劉燦黃，章澤恒，汪輝，何清彥，蔣桃，黃勝

1.長沙市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 長沙 410208；2.湖南省藥品審評(píng)認(rèn)證與不良反應(yīng)監(jiān)測中心，湖南 長沙 410013；3.湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，湖南 長沙 410208；4.九芝堂股份有限公司，湖南 長沙 410205

丹膝顆粒收載于《中國藥典》2020 年版一部［1］，為九芝堂獨(dú)家生產(chǎn)品種，全方由丹參、牛膝、天麻、牡丹皮、赤芍、川芎、生地黃、淫羊藿、桑寄生、梔子、決明子、火麻仁十二味藥材組成。丹膝顆粒原名“偏癱靈顆粒”，臨床上對(duì)陰虛風(fēng)動(dòng)型和氣虛血瘀型中風(fēng)偏癱有其特有的預(yù)防和治療優(yōu)勢。處方中以丹參、牛膝為君藥，活血祛瘀，通經(jīng)止痛，補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨；赤芍、生地黃、牡丹皮清熱涼血、養(yǎng)陰生津、散瘀止痛，共為臣藥；淫羊藿、桑寄生、天麻、川芎、梔子共為佐藥，增強(qiáng)君藥補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨、活血通經(jīng)、清熱除煩的作用，方中決明子、火麻仁清肝明目，潤腸通便。丹膝顆粒原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立了丹參、牛膝、淫羊藿、梔子、決明子的薄層色譜鑒別和丹酚酸B、天麻素的含量測定方法，薄層色譜和含量測定項(xiàng)目多而且前處理方法繁雜，本研究前期在43 批次樣品分析的基礎(chǔ)上，多方法條件摸索，將復(fù)方中17 種成分作為目標(biāo)成分進(jìn)行整體評(píng)價(jià)分析，建立了丹膝蓋顆粒HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜多指標(biāo)成分控制模式。為促進(jìn)丹膝顆粒藥用功效的二次開發(fā)，進(jìn)一步研究丹膝顆粒復(fù)方制劑的化學(xué)成分和物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究中采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用方法（UPLC-Q-TOFMS/MS），更為快速、簡便、全面地分析丹膝顆粒中化學(xué)成分。

UPLC-Q-TOF-MS/MS 具有高分辨率、高靈敏度、周期短、掃描范圍廣等特點(diǎn)，是研究中藥復(fù)雜體系中化學(xué)成分和定性分析的重要工具。本研究通過將MS/MS 掃描的碎片離子信息和化合物裂解規(guī)律與對(duì)照品或文獻(xiàn)比對(duì)來快速地分析其所含的化學(xué)成分，為加強(qiáng)丹膝顆粒整體質(zhì)量控制、闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、分析藥效機(jī)制提供參考。

1 儀器與試藥

超高效液相色譜儀（Agilent 1290），質(zhì)譜儀（Agilent Q-TOF 6545），數(shù)據(jù)分析軟件（Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.08.00），XS205DU電子天平（瑞士Mettler Toledo），SB-800DTD 超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

對(duì)照品：沒食子酸（批號(hào)110831-201906，91.5%），天麻素（批號(hào)110807-202010，95.5%），梔子苷（批號(hào)110749-201718，97.6%），丹酚酸B（批號(hào)110562-201917，96.6%），淫羊藿苷（批號(hào)110737-202017，98.1%），丹皮酚（批號(hào)110708-201908，99.8%），丹 參 酮ⅡA（批 號(hào)110766-202022，98.9%），β-蛻皮甾醇（批號(hào)111638-201907，97.9%），芍藥苷（批號(hào)110736-201943，95.1%），丹參素（批號(hào)20101，99.3%），人參皂苷Ro（批號(hào)20051，96.0%），橙黃決明素（批號(hào)20031，98.0%），朝藿定A（批號(hào)20121，96.0%）。朝藿定B（批號(hào)20121，96.0%），朝藿定C（批號(hào)20051，96.0%），梓醇（批號(hào)20051，98.0%），地黃苷D（批號(hào)20121，98.0%），天麻素（批號(hào)110807-202010，96.7%），阿魏酸（批號(hào)110773-201915，99.4%），大黃酚（批號(hào)110796-201922，99.4%），大黃素（批號(hào)110756-201913，96.0%），丹參素、人參皂苷Ro、橙黃決明素、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、梓醇、地黃苷D 對(duì)照品購自珠海安哲生物科技有限公司，其余對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院。

色譜純乙腈（Fisher，美國，071757），甲醇（Fisher，美國，154449），甲酸（CNW，德國，3208K240）、純凈水（怡寶），丹膝顆粒（九芝堂股份有限公司，批號(hào)20190104，20190307，20190401，規(guī)格：每袋裝10 g，）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備稱取天麻素、沒食子酸、丹參素、原兒茶醛、梔子苷、芍藥苷、阿魏酸、β-蛻皮甾醇、丹酚酸B、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、丹皮酚、人參皂苷Ro、橙黃決明素、大黃素、大黃酚、丹參酮ⅡA、地黃苷D、梓醇共21 種對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度分別為5 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備取丹膝顆粒，研細(xì)，取粉末約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定重量，超聲提?。üβ?50 W，頻率40 kHz）45 min，濾過，續(xù)濾液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2 液相色譜條件

采用Atlantis? T3 色譜柱（2.1 mm×250 mm，5 μm）；柱溫為35 ℃；體積流量為0.4 mL/min；檢測波長為254 nm；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%A；5～45 min，5%A →40%A；45～55 min，乙腈40%A →85%A；55～58 min，85%A →5%A）。

2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子模式監(jiān)測，掃描范圍m/z 100～1 100，毛細(xì)管電壓3 500 V，毛細(xì)管出口電壓175 V；干燥氣（N2體積流量8 L/min；干燥器溫度320 ℃，霧化器壓力35 psi）。裂解電壓為120 V，碰撞能量分別為10、20、40 eV。TOF-MS/MS 掃描范圍m/z 30～1 000，開啟動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Masshunter Qualitative Analysis B.08.00處理。

2.5 結(jié)果與分析

按“2.2”項(xiàng)下色譜條件和“2.3”項(xiàng)下質(zhì)譜條件，分析供試品溶液，正負(fù)離子掃描模式下總離子流圖見圖1。查閱《中藥質(zhì)量現(xiàn)代分析技術(shù)》、國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料，參考TCMSP 數(shù)據(jù)庫，結(jié)合各對(duì)照品質(zhì)譜信息，特征碎片離子，色譜保留時(shí)間的信息，與本研究中檢測到的丹膝顆?；瘜W(xué)成分的相關(guān)信息進(jìn)行比較，共鑒定和推測出102 種化學(xué)成分，見表1。

圖1 負(fù)離子（A）、正離子（B）模式下丹膝顆粒的總離子流圖（TIC）

表1 UPLC-Q-TOF-MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)

表1 （續(xù)）

表1 （續(xù)）

下面舉例說明丹膝顆粒中主要化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律推測過程。

2.5.1 酚酸類化合物在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在負(fù)離子模式下進(jìn)行酚酸類成分分析［23-24］，酚酸類化合物主要來自丹參、川芎、赤芍等。主要有單體的丹參素和咖啡酸，縮酚酸類的丹酚酸A、B、C、E 以及迷迭香酸等。根據(jù)文獻(xiàn)總結(jié)的質(zhì)譜規(guī)律結(jié)合實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜信息可發(fā)現(xiàn)，酚酸類化合物主要含有羰基、羧基和羥基，在質(zhì)譜碰撞中易丟失CO、CO2、H2O 等中性碎片。如化合物5 丹參素，負(fù)離子給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 197.045 5［M-H］-（C9H10O5），在TOF-MS/MS 中，脫去一分子H2O 形成m/z179.035 4，再脫去一分子CO2形成 m/z 135.045 8，丹參素分子中的CH（OH）和 COOH 部分與母環(huán)中芐基碳碎裂形成碎片離子 m/z 72.993 5，經(jīng)與對(duì)照品相比較，化合物5 確認(rèn)為丹參素，推測丹參素的裂解途徑見圖2。

圖2 丹參素質(zhì)譜裂解規(guī)律

丹參素和咖啡酸作為水溶性酚酸類化合物的一個(gè)基本母核，其他的水溶性酚酸類化合物大多為這二者的聚合或者縮合產(chǎn)物，質(zhì)譜中通常發(fā)生對(duì)應(yīng)丟失丹參素、咖啡酸和脫水咖啡酸等裂解規(guī)律，主要為縮酚酸類的成分在質(zhì)譜碰撞中丟失［M-H-180］和［M-H-198］中性碎片即丟失不同分子的丹參素和咖啡酸，根據(jù)以上的中性丟失和特征性碎片可以實(shí)現(xiàn)對(duì)酚酸類化合物的快速分類及鑒定。如化合物58 丹酚酸B，其結(jié)構(gòu)中含有2 個(gè)丹參素片段。負(fù)離子給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 717.145 1［M-H］-（C36H30O16），在 TOF-MS/MS 中，分別失去1 分子和2 分子的丹參素得到碎片離子m/z 519.093 5［M-HC9H10O5］-和m/z 321.041 1［M-H-2（C9H10O5）］，少數(shù)m/z 519.093 5 發(fā)生麥?zhǔn)现嘏?，失?80，得到碎片m/z 339.051 1，隨后側(cè)鏈斷裂，產(chǎn)生碎片m/z 295.061 8，有些繼續(xù)失去一分子H2O，產(chǎn)生碎片m/z 277.048 7，另外也可見到與丹參素相同的碎片離子峰m/z 179.035 4、135.045 8。經(jīng)與對(duì)照品相比較，化合物58 確認(rèn)為丹酚酸 B，推測丹酚酸B 的裂解途徑見圖3。

圖3 丹酚酸B質(zhì)譜裂解規(guī)律

2.5.2 黃酮類化合物黃酮類化合物是一類基本母核為2-苯基色原酮的化合物，以游離形式、與糖結(jié)合成苷類或以碳糖基的形式存在。黃酮類化合物具有相同的母核，該類化合物在質(zhì)譜條件下有相似的裂解規(guī)律，主要發(fā)生糖鏈、側(cè)鏈的裂解和脫水。本研究丹膝顆粒中黃酮類化合物主要來自淫羊藿、桑寄生、牡丹皮等。淫羊藿的異戊烯基類黃酮化合物為其主要活性成分，如淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定 B 和朝藿定C 等，該類化合物在裂解過程中容易發(fā)生脫糖基、脫水、環(huán)的RDA 裂解以及CO、CO2、CHO 等一些中性分子丟失［25-26］，在負(fù)離子模式下，異戊烯基取代的黃酮類成分易失去糖基產(chǎn)生基峰離子，而苷元離子較難進(jìn)一步裂解?？蓪④赵x子作為鑒別該類化合物的特征離子。以化合物67 朝藿定A 為例，［M-H］-離子m/z 837.285 4，分子式為C39H50O20，失去1 分子葡萄糖形成基峰離子m/z 675.232 5 ［M-H-glu］-離子，離子m/z 675.232 5 同時(shí)失去1 分子葡萄糖和鼠李糖后產(chǎn)生母核離子m/z 367.267 8［M-H-glu-glu-rha］-。與朝藿定A 對(duì)照品比較，推測朝藿定A 的裂解途徑見圖4。

2.5.3 醌類化合物醌類化合物是一類具有醌式結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分，主要分為苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌4 種類型，結(jié)合文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)［27］，丹膝顆粒中醌類化合物主要來源于決明子、丹參，決明子中醌類化合物主要為游離和結(jié)合蒽醌類、萘并吡喃酮類及其苷類。蒽醌類化合物母核結(jié)構(gòu)主要為大黃素型，結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，蒽醌母核上常有羥基、羥甲基、甲基、甲氧基及羧基取代，同時(shí)以游離形式與糖結(jié)合成苷的形式存在。結(jié)合蒽醌所結(jié)合糖的類型主為葡萄糖和龍膽二糖。萘并吡喃酮類成分也是本研究丹膝顆粒中來自決明子的一類特異性成分，多以苷的形式存在，糖類型以吡喃葡萄糖和龍膽二糖為主，有決明子苷、紅鐮霉素-6-O-β-D-葡萄糖苷、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷等。本研究丹膝顆粒中蒽醌類化合物有大黃素、大黃酚、大黃素-6-O-β-D-葡萄糖苷、橙黃決明素等。該類化物的分子骨架存在共軛體系，比較穩(wěn)定，不易斷裂，其質(zhì)譜裂解主要發(fā)生在側(cè)鏈取代基的斷裂，如糖基、甲基、甲氧基等，或丟失母核基團(tuán)中的CO，留存共軛體系。以化合物79 橙黃決明素為例，游離醌依次脫去2 個(gè)分子-CH3分別得到m/z 314.042 3 和m/z 299.018 6 碎片，以m/z 299.018 6 為母離子失去-CO可得到m/z 271.024 9 離子，或者通過失去-CH2可得到m/z 285.041 3離子。與橙黃決明素對(duì)照品比較，推測橙黃決明素的裂解途徑見圖5。

圖5 橙黃決明素質(zhì)譜裂解規(guī)律

2.5.4 萜類化合物萜類化合物由甲戊二羥酸衍生而成，基本碳架多具有2 個(gè)或2 個(gè)以上異戊二烯單位結(jié)構(gòu)特征。以單萜、二萜、三萜及倍半萜等形式存在，在丹膝顆粒中主要來自赤芍、牡丹皮、丹參、梔子等藥材。萜類通常在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，母離子主要以［M-H］-或［M+COOH］-形式存在，碎片離子以丟失糖配基較為常見。赤芍和牡丹皮中單萜及其苷類化合物主要為具蒎烷結(jié)構(gòu)和具內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的單萜及其苷類［28］。如芍藥苷、去苯甲酰芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等。以芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷為例。首先根據(jù) TOF-MS 給出的分子離子峰525.161 5，與芍藥苷或者芍藥內(nèi)酯苷的加甲酸峰一致，初步推測其為芍藥苷或者芍藥內(nèi)酯苷，分子式為C23H28O11?；衔?9 裂解二級(jí)質(zhì)譜圖上m/z 479.154 6 峰為其分子離子峰，由于芍藥內(nèi)酯苷結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)內(nèi)酯環(huán)，其酰氧基兩側(cè)均可發(fā)生斷裂，失掉一分子CO2得到m/z 435.144 4。而碎片m/z 357.118 0 為準(zhǔn)分子離子峰失去一分子苯甲酸形成，m/z 121.029 3 為失掉的一分子苯甲酸碎片離子。初步鑒定該化合物為芍藥內(nèi)酯苷，推測其裂解途徑見圖6。

圖6 芍藥內(nèi)酯苷質(zhì)譜裂解規(guī)律

化合物23 裂解質(zhì)譜圖上m/z 449.145 0 為分子離子峰（m/z 479.155 9）蒎烷骨架失去一分子CH2O重排離子［M-H］-峰，繼而進(jìn)一步失去1 個(gè)苯甲酸形成m/z 327.109 4 離子峰，m/z 165.055 4 為蒎烷基本骨架結(jié)構(gòu)的碎片，由于蒎烷骨架上與一苯甲酰取代基相連，m/z 121.028 0 為失掉的一分子苯甲酸碎片離子。經(jīng)與芍藥苷對(duì)照品比較，確定該化合物23 為芍藥苷，推測其裂解途徑見圖7。

圖7 芍藥苷質(zhì)譜裂解規(guī)律

3 討論

本研究首次利用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)，利用TOF-MS/MS、XIC、BPC 提取功能，利用精確分子質(zhì)量數(shù)，推測分子結(jié)構(gòu)，參考文獻(xiàn)，參照對(duì)照品，對(duì)比化合物質(zhì)譜信息，獲取二級(jí)質(zhì)譜圖。對(duì)丹膝顆粒成分進(jìn)行定性分析，初步表征了該復(fù)方中102 個(gè)化學(xué)成分，除上述舉例說明的酚酸類、黃酮類、醌類、萜類等化合物外，還有丹參的二萜醌類丹參酮類、牛膝的甾酮類、梔子的環(huán)烯醚萜類等，實(shí)驗(yàn)中對(duì)豐度較高的化合物如芍藥苷、梔子苷、丹酚酸B、丹皮酚、淫羊藿苷等用對(duì)照品進(jìn)行了確證。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中用薄層色譜法定性鑒別丹參、牛膝、淫羊藿、梔子、決明子，前處理方法繁雜時(shí)間長，本方法快速簡便，且相對(duì)全面反映了丹膝顆粒的化學(xué)成分。

研究中生產(chǎn)企業(yè)反饋原標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)大黃素、大黃酚的薄層色譜鑒別項(xiàng)目經(jīng)常出現(xiàn)斑點(diǎn)不明顯的情況，從本研究中發(fā)現(xiàn)，丹膝顆粒加甲醇超聲處理后能檢出有游離大黃素、大黃酚，還有結(jié)合型大黃素-6-Oβ-D-龍膽二糖苷、大黃素-6-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-1-O-β-D-四吡喃葡萄糖苷、大黃酚-1-Oβ-D-龍膽二糖苷等。原薄層色譜鑒別方法中樣品加乙酸乙酯、鹽酸回流水解取濾液，樣品加乙酸乙酯、鹽酸后結(jié)團(tuán)不能充分水解，而原樣品游離大黃素、大黃酚含量低，推斷薄層色譜鑒別斑點(diǎn)不明顯主要源于對(duì)樣品的水解前處理因素的影響。

本研究所鑒定和推測的102 個(gè)成分中，19 個(gè)成分來自丹參、7 個(gè)來自牛膝，15 個(gè)來自淫羊藿，22個(gè)來自決明子等。為丹膝顆粒進(jìn)一步的藥理作用研究提供了研究基礎(chǔ)。