熊明朋，劉寧，龔瑋，劉波

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

據(jù)不完全統(tǒng)計，近年來隨著激烈的社會競爭、電子設備使用率的增加以及染發(fā)燙發(fā)的流行，中國脫發(fā)人口已遠超2 億，防脫育發(fā)類產品已越來越受追捧。浙江某公司生產的育發(fā)液主要由丹參、苦參、何首烏、防風、人參根等提取物組成，其在減少油脂分泌的同時，也能改善毛囊的生理狀態(tài)，促使毛母細胞恢復生發(fā)的功能，從而促進頭發(fā)的再生，但是其遺傳毒性并未見相關報道。遺傳毒性試驗用于檢測通過不同機制直接或間接誘導遺傳學損傷的供試品體內和體外的試驗，其方法有多種，其中體外哺乳動物微核試驗可用于檢測有絲分裂細胞暴露于供試品期間或之后致染色體斷裂和/或誘發(fā)非整倍體的能力，以評價供試品致突變的可能性。本試驗將中國倉鼠肺細胞株（CHL）暴露在一定濃度的育發(fā)液下進行體外微核試驗，評價育發(fā)液的安全性。

1 實驗材料與方法

1.1 主要試劑

育發(fā)液（浙江某公司生產，批號：20191101），環(huán)磷酰胺（CP）、絲裂霉素C（MMC）、秋水仙素、胰酶、小牛血清均購自Sigma 公司，肌動蛋白聚合抑制劑細胞松弛素B（cytoB）購自大連美侖生物技術有限公司，姬姆薩染液購自雷根生物有限公司，MEM 無血清培養(yǎng)基、MEM 完全培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要儀器設備

酶標儀（賽默飛世爾科技公司），BX63 雙人共覽熒光顯微鏡（奧林巴斯株式會社），電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司），細胞計數(shù)器（上海睿鈺生物科技有限公司），離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 細胞及代謝活化系統(tǒng)

CHL 細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司，大鼠肝S9購自瑞德肝臟疾病研究（上海）有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 S9 活化系統(tǒng)的制備取大鼠肝S91.25 mL，分別加入0.40 mol/L 的MgCl20.20 mL、1.65 mol/L 的KCl 0.20 mL、葡萄糖-6-磷酸17.91 mg、氧化型NADP 30.62 mg，最后用MEM 無血清培養(yǎng)基補足至10 mL。

1.4.2 對數(shù)生長期細胞的準備取對數(shù)生長期的CHL細胞，PBS 液洗滌3 次，棄去洗滌液，胰酶消化后，調整為1×105個/mL，備用。

1.4.3 供試品濃度的確定取育發(fā)液50 μL 加入9.95 mL MEM完全培養(yǎng)基溶解，配成5.000 μL/mL的溶液，再用MEM 完全培養(yǎng)基稀釋成2.500、1.250、0.625、0.313 μL/mL 的系列濃度。

在含對數(shù)生長期細胞的96 孔板中，加入活化系統(tǒng)S9或不加入，接種于含上述5 種濃度梯度的供試品及陰性對照組（MEM 完全培養(yǎng)基），每組設4孔，吹打成細胞懸液，置37 ℃，5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，棄去原培養(yǎng)基，加入新鮮MEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL 濃度為5 g/L 的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去孔內液體，加入150 μL 的DMSO，置振蕩器上振蕩10 min，在酶標儀上雙波長（570 nm、630 nm）測定吸光度，并計算相對倍增數(shù)（RPD）。RPD=受試物組細胞倍增數(shù)/陰性對照組細胞倍增數(shù)×100，細胞毒性=100 -RPD。

1.4.4 體外細胞微核試驗［1-2］（1）培養(yǎng)3 h 方案。在含對數(shù)生長期細胞的接種板中，加入適量MEM 完全培養(yǎng)基后，當加入活化系統(tǒng)S9時，各孔加入3 種梯度（5.000 μg/mL、2.500 μg/mL、1.250 μg/mL）的供試品、陽性對照物（60 μg/mL CP）、陰性對照物（空白MEM 完全培養(yǎng)基），每組1 孔；當不加入活化系統(tǒng)S9時，各孔加入3 種梯度（5.000 μg/mL、2.500 μg/mL、1.250 μg/mL）的供試品、陽性對照物（0.6 μg/mL MMC、1.0 μg/mL 秋水仙素）、陰性對照物（空白MEM 完全培養(yǎng)基），每組設2 孔，吹打成細胞懸液，置37 ℃，5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，棄去原培養(yǎng)基，加入新鮮MEM 完全培養(yǎng)基和cytoB，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集細胞，并進行消化、低滲、固定、滴片、染色，顯微鏡下各組觀察2 000 個雙核細胞，計算微核細胞率。微核細胞率=具有微核的雙核細胞數(shù)/雙核細胞數(shù)。

（2）培養(yǎng)24 h 方案。在含對數(shù)生長期細胞的接種板中，加入適量MEM 完全培養(yǎng)基和cytoB，不加入活化系統(tǒng)S9，各孔加入3 種梯度（5.000 μg/mL、2.500 μg/mL、1.250 μg/mL）的供試品、陽性對照物（0.4 μg/mL MMC）、陰性對照物（MEM 完全培養(yǎng)基），每組設2 孔，吹打成細胞懸液，置37 ℃，5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)基，加入新鮮MEM 完全培養(yǎng)基和cytoB，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集細胞，并進行消化、低滲、固定、滴片、染色，顯微鏡下各組各觀察2 000 個雙核細胞，計算微核細胞率。

1.5 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010 軟件，使用SPSS 19.0 軟件作χ2檢驗，將樣品各劑量組微核細胞率與陰性對照進行比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 供試品溶解情況

各濃度的供試品在MEM 完全培養(yǎng)基中未見沉淀。

2.2 供試品細胞毒性

供試品細胞毒性見表1，供試品在有活化系統(tǒng)和無活化系統(tǒng)的情況下，其細胞毒性均小于10%。

表1 供試品細胞毒性結果

2.3 體外哺乳動物細胞微核試驗結果

體外哺乳動物細胞微核試驗結果見表2，供試品組在有活化系統(tǒng)和無活化系統(tǒng)情況下，與陰性對照相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），陽性對照組與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表2 體外哺乳動物細胞微核試驗結果

3 討論

本研究所使用的育發(fā)液主要由丹參、苦參、何首烏、防風、人參根等提取物組成，卷柏、何首烏，丹參等藥材配伍經常用于促進頭發(fā)生長和治療脂溢性脫發(fā)［3-4］。盡管何首烏、丹參在成品膠囊中被證實無遺傳毒性［5-6］，苦參在一種水溶液中無明顯致突變作用［7］，人參粉劑也未顯示有遺傳毒性［8］，但是卷柏、防風以及該育發(fā)液中藥提取物按照一定比例配伍，并按一定工藝加工的成品的安全性并未見相關報道。根據(jù)《化妝品注冊備案管理辦法》，育發(fā)類產品屬于特殊用途化妝品，其遺傳毒性試驗是必做項目之一，因此，本試驗選擇體外哺乳動物微核試驗研究其遺傳毒性。

在有活化系統(tǒng)或無活化系統(tǒng)的情況下，CHL 細胞暴露在不同濃度的育發(fā)液下，細胞毒性均遠小于50%，說明在該系列濃度下，供試品沒有毒性，在以后的試驗中，我們將考慮增加供試品濃度，直至最高劑量能引起50%～60%的細胞毒性以及其他形式的遺傳毒性研究［9-10］。在同一個劑量組下，使用活化系統(tǒng)的劑量組，相比于不使用活化系統(tǒng)的劑量組，供試品的細胞毒性更低，但相差不大，表明育發(fā)液中某些物質不排除經活化系統(tǒng)發(fā)生了改變，能促使毒性降低，但在體外哺乳動物細胞微核試驗，使用活化系統(tǒng)的劑量組，相比于不使用活化系統(tǒng)的劑量組，供試品的微核率更高。并且，同一個劑量組下，不管是劑量組還是空白對照組，培養(yǎng)24 h 方案比培養(yǎng)3 h 方案的微核率都有稍許增加，暗示隨著接觸時間的增加，細胞本身的自然突變能力增加，而非供試品誘導突變的能力增加。另外，供試品各劑量組在有活化系統(tǒng)和無活化系統(tǒng)情況下，與陰性對照相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），陽性對照組與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明供試品在5.000 μL/mL、2.500 μL/mL、1.250 μL/mL 的情況下，體外對哺乳動物細胞致突變性為陰性。

本研究表明，某中藥育發(fā)液在5.000 μL/mL、2.500 μL/mL、1.250 μL/mL 的情況下，體外對哺乳動物細胞沒有致突變性。