趙佳，馮志威，田志剛，高振峰*

（1.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西晉中 030619；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院） 食品科學(xué)與工程學(xué)院（農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所），山西太原 030031）

我國(guó)是蒸餾白酒的生產(chǎn)大國(guó)，山西省為清香型白酒的發(fā)源地，僅汾陽(yáng)市杏花村鎮(zhèn)就有正規(guī)酒企17家，2020年產(chǎn)生的酒糟100余萬(wàn)t。酒糟為白酒蒸餾取酒后的固態(tài)廢棄物，因其持續(xù)生產(chǎn)時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)量大、不易貯藏與運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)，酒糟處理成為限制釀造企業(yè)快速發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。目前，酒糟主要的處理方式為晾曬后作為動(dòng)物粗飼料向周?chē)B(yǎng)殖戶售賣(mài)，但由于其價(jià)格低、經(jīng)濟(jì)效益差、需求量小等原因，部分酒糟被酒企直接丟棄。隨著釀酒產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，丟糟規(guī)模日益擴(kuò)大，這不僅使得酒糟資源白白浪費(fèi)，還對(duì)周?chē)霓r(nóng)田與水源等環(huán)境造成了嚴(yán)重污染[1-4]。從白酒的釀造生產(chǎn)工藝來(lái)看，發(fā)酵過(guò)程中釀造微生物無(wú)法充分利用糧食物料中的所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，尤其是清香型白酒只進(jìn)行兩輪發(fā)酵蒸餾取酒，相對(duì)于瀘州老窖與五糧液、茅臺(tái)與郎酒等濃香型與醬香型的白酒糟，蒸餾取酒后殘留的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（粗纖維、粗淀粉、粗蛋白、無(wú)氮浸出物、粗灰分和礦物質(zhì)元素等）含量仍然較高。另外，酒糟經(jīng)過(guò)高溫蒸煮后可以有效殺菌，因此可作為制作生物有機(jī)肥的理想原材料[5-6]。

生物有機(jī)肥由有機(jī)肥發(fā)展而來(lái)，是以經(jīng)過(guò)無(wú)害化處理、腐熟的畜禽糞污、糠醛渣、各種作物秸稈與菌糠等農(nóng)業(yè)固態(tài)廢棄物為原料，以具有拮抗病原菌、促進(jìn)作物生長(zhǎng)等功能的特定微生物為發(fā)酵劑，進(jìn)行二次發(fā)酵制成的兼具有機(jī)肥作用和微生物功效的一類(lèi)肥料，與其他肥料相比具有穩(wěn)效、長(zhǎng)效、高效3大突出優(yōu)點(diǎn)[7-8]。車(chē)艷麗等[9]以貴州茅臺(tái)鎮(zhèn)的醬香型白酒糟為底物制作栽培基質(zhì)，以番茄為供試作物，研究酒糟基質(zhì)對(duì)番茄生長(zhǎng)及其品質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，酒糟基質(zhì)相比普通基質(zhì)中有機(jī)質(zhì)和總養(yǎng)分含量高，種植過(guò)程中番茄生物量、產(chǎn)量明顯高于對(duì)照，果實(shí)品質(zhì)顯著提高。李哲等[10]以瀘州老窖蒸餾取酒后的酒糟為原料，利用高溫發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)有機(jī)肥，以高粱作為供試作物，研究其對(duì)高粱的肥效。結(jié)果表明，施用該肥料后高粱產(chǎn)量比對(duì)照組提高了12.55%，籽粒含氮量比對(duì)照組增加了36.70%，植株磷、鉀吸收量分別比對(duì)照組上升了22.22%和29.20%，說(shuō)明該有機(jī)肥的肥效顯著。目前，既能解決清香型白酒糟無(wú)害化處理問(wèn)題又能實(shí)現(xiàn)酒糟的大規(guī)模資源化利用的方法已成為學(xué)界研究的熱點(diǎn)，而利用特定功能微生物菌劑將其發(fā)酵制成生物有機(jī)肥還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，筆者利用具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的微生物復(fù)合菌劑對(duì)清香型白酒糟進(jìn)行二次發(fā)酵制成酒糟生物有機(jī)肥并對(duì)其肥效進(jìn)行研究，為酒糟生物有機(jī)肥的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和研究思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試菌種為解淀粉芽孢桿菌CM3、解淀粉芽孢桿菌Lh-1及微白黃鏈霉菌G-1，均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)科院）保藏，前期試驗(yàn)證明3種菌株都具有一定的拮抗病原菌與促進(jìn)植株生長(zhǎng)的功效[11-13]；供試黃瓜品種為“津優(yōu)35號(hào)”，供試地點(diǎn)為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)科院）東陽(yáng)試驗(yàn)基地，位于山西省晉中市；供試酒糟，由山西杏花村國(guó)賓白酒有限公司提供；供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基，配方見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14]。

1.2 儀器與設(shè)備

SN-CJ-1G型超凈工作臺(tái)，上海尚儀儀器設(shè)備有限公司；SN-SPX-80/150型恒溫培養(yǎng)箱，上海尚儀儀器設(shè)備有限公司；XFS-260型雙閥門(mén)滅菌鍋，上海尚儀儀器設(shè)備有限公司；DDS-11A型電導(dǎo)率儀，上海雷磁儀器有限公司；HH420型恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋，常州天瑞儀器有限公司；7230G型光譜儀、7230G型分光光度計(jì)，上海菁華儀器有限公司。

1.3 菌劑制備

將保存的解淀粉芽孢桿菌CM3、解淀粉芽孢桿菌Lh-1及微白黃鏈霉菌G-1菌種接入斜面培養(yǎng)基活化，解淀粉芽孢桿菌CM3和解淀粉芽孢桿菌Lh-1使用NA培養(yǎng)基活化，微白黃鏈霉菌G-1使用PDA培養(yǎng)基活化。活化后的菌株接入液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，解淀粉芽孢桿菌CM3和解淀粉芽孢桿菌Lh-1培養(yǎng)條件為30 ℃、200 r/min，發(fā)酵36 h；微白黃鏈霉菌G-1培養(yǎng)條件為30 ℃、200 r/min，發(fā)酵48 h。

1.4 清香型白酒糟生物有機(jī)肥制備

在清香型白酒糟中加入石灰粉0.9%（w/w）混合均勻調(diào)至中性，設(shè)計(jì)F1與F2兩個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)。F1自然放置8 d；F2處理如下：將培養(yǎng)好的解淀粉芽孢桿菌CM3、解淀粉芽孢桿菌Lh-1與微白黃鏈霉菌G-1 3種菌懸液按1∶1∶2的比例混合均勻，然后按3%（V/W）的接種量接種到3個(gè)重復(fù)的白酒糟中混勻，在低于45 ℃的條件下發(fā)酵8 d，總菌量＞109cfu/g備用。

1.5 清香型白酒糟生物有機(jī)肥指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 清香型白酒糟生物有機(jī)肥微生物多樣性檢測(cè)

在F1與F2的每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選擇5個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)取100 g樣品后混勻，共6個(gè)樣品，4 ℃保存于自封袋內(nèi)運(yùn)回。對(duì)采回的樣品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)⒃诓煌呐囵B(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，分別統(tǒng)計(jì)樣品中的細(xì)菌、放線菌與真菌數(shù)量[12]。

1.5.2 清香型白酒糟生物有機(jī)肥理化指標(biāo)檢測(cè)

取新鮮樣品，按1∶10（g∶mL）比例用蒸餾水稀釋?zhuān)≌袷?0 min，取上清，測(cè)定pH值、電導(dǎo)率、吸光度（665 nm）。種子的發(fā)芽指數(shù)與含水率的相關(guān)檢測(cè)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[15-16]。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2020年9月，在晉中市榆次區(qū)東陽(yáng)試驗(yàn)基地的日光溫室內(nèi)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。在營(yíng)養(yǎng)缽（裝土300 g）中進(jìn)行黃瓜育苗，待出苗后將黃瓜苗移栽入盆缽（裝土10 kg）中進(jìn)行培養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為3個(gè)試驗(yàn)組，每組分為3個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，共9個(gè)試驗(yàn)小區(qū)（完全隨機(jī)分布），每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)放置盆缽30個(gè)：（1）對(duì)照組（CK），不添加任何肥料；（2）試驗(yàn)組1（T1）以2%（w/w）的施入量向土壤中添加自然放置的清香型白酒糟并混合均勻；（3）試驗(yàn)組2（T2）以2%（w/w）的施入量向土壤中添加經(jīng)二次發(fā)酵的清香型白酒糟生物有機(jī)肥并混合均勻。篩選均一度好的黃瓜種子，一粒黃瓜種子穴播于不同處理的營(yíng)養(yǎng)缽中進(jìn)行育苗，淘汰不出苗的營(yíng)養(yǎng)缽，瓜苗長(zhǎng)出4～5片真葉后移栽至對(duì)應(yīng)的盆缽中進(jìn)行常規(guī)盆栽試驗(yàn)，定期觀測(cè)記錄。

1.7 清香型白酒糟生物有機(jī)肥的各項(xiàng)肥效指標(biāo)檢測(cè)

待溫室內(nèi)的黃瓜苗定植40 d后，在每個(gè)小區(qū)內(nèi)以“S”形隨機(jī)取樣的方式采取黃瓜植株5株，并收集該黃瓜植株的根際土壤樣品100 g，用于后續(xù)各項(xiàng)檢測(cè)。

黃瓜植株根際土壤中微生物群落的檢測(cè)：將每份根際土壤樣品混合均勻后放入自封袋中，4 ℃條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，采用梯度稀釋法，分別對(duì)樣品中的細(xì)菌、放線菌與真菌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)[17]。

黃瓜葉片理化指標(biāo)測(cè)定：丙二醛（MDA）含量，過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）與超氧化物歧化酶（SOD）活性，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[18]。

黃瓜生長(zhǎng)指標(biāo)：黃瓜植株的鮮重、干重、葉面積和株高。植株干重采用烘干法，葉面積采用葉面積儀測(cè)定法，株高采用直尺測(cè)量法。

2 結(jié)果與分析

2.1 清香型白酒糟生物有機(jī)肥微生物多樣性檢測(cè)

如表1所示，添加復(fù)合菌劑進(jìn)行二次發(fā)酵后，清香型白酒糟中的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變，細(xì)菌數(shù)量與放線菌數(shù)量較F1顯著提高并成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)群落，達(dá)到1.47×109cfu/g和1.84×107cfu/g；由于復(fù)合菌劑中沒(méi)有真菌，F(xiàn)2中的真菌數(shù)量顯著降低，F(xiàn)1中的真菌數(shù)量是F2的3倍。

表1 清香型白酒糟生物有機(jī)肥微生物多樣性檢測(cè)

2.2 清香型白酒糟生物有機(jī)肥各項(xiàng)理化指標(biāo)檢測(cè)

如表2所示，清香型白酒糟經(jīng)二次發(fā)酵后相比其理化指標(biāo)發(fā)生了顯著變化。二次發(fā)酵后F2含水率較F1下降了13.52%。這是因?yàn)樗质前l(fā)酵過(guò)程中微生物群落活躍程度的重要反映指標(biāo)之一，微生物的擴(kuò)繁與代謝等活動(dòng)會(huì)持續(xù)消耗水分，從而使水分減少。pH值是影響作物生長(zhǎng)的重要指標(biāo)之一，添加復(fù)合菌劑進(jìn)行二次發(fā)酵后物料由中性向偏堿性轉(zhuǎn)變，其pH值達(dá)到8.15，符合腐熟肥料的酸堿度要求。電導(dǎo)率（EC）是反映肥料浸提液中的有機(jī)酸鹽類(lèi)和無(wú)機(jī)鹽含量的指標(biāo)，一般而言肥料電導(dǎo)率＜9.0 mS/cm，不會(huì)抑制種子發(fā)芽[19]，F(xiàn)2處理相較于F1而言，電導(dǎo)率顯著下降。吸光度（OD665）的值可以作為肥料腐殖化程度的參考指標(biāo)，通常腐熟有機(jī)肥料的OD665＜0.008[20]。由表2可知，F(xiàn)1的吸光度值未達(dá)到腐熟標(biāo)準(zhǔn)，而F2的吸光度值符合腐熟肥料的標(biāo)準(zhǔn)。種子發(fā)芽指數(shù)（GI）是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中反映肥料腐熟與否的權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)，GI＜50%說(shuō)明肥料中有毒物質(zhì)的含量超過(guò)了植物可以承受的范圍，GI值為50%～85%時(shí)說(shuō)明該肥料還沒(méi)有完全腐熟，肥料中仍有部分有害物質(zhì)會(huì)對(duì)植株的生長(zhǎng)造成影響，GI＞85%說(shuō)明該肥料已經(jīng)達(dá)到完全腐熟狀態(tài)，可以進(jìn)行施用[21]。F1的GI值為68.64%，表示酒糟沒(méi)有腐熟，對(duì)植株生長(zhǎng)有影響；F2的GI值為86.04%，說(shuō)明二次發(fā)酵后的酒糟有機(jī)肥已經(jīng)達(dá)到完全腐熟狀態(tài)。

表2 清香型白酒糟生物有機(jī)肥理化指標(biāo)檢測(cè)

2.3 施用不同肥料對(duì)黃瓜根際土壤微生物群落多樣性的影響

不同肥料處理對(duì)黃瓜根際土壤微生物群落的影響如表3所示。從表3可以看出，細(xì)菌成為根際土壤微生物的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，其占比為70%～90%，與另外2個(gè)處理相比，T2處理顯著提高了微生物群落中的細(xì)菌數(shù)量與放線菌數(shù)量（10.55×107cfu/g、9.64×105cfu/g）；一般黃瓜的土傳病害都是由真菌引起的，而T2處理的根際土壤中真菌數(shù)量顯著低于其他兩個(gè)處理（1.63×105cfu/g）。與CK相比，T1處理放線菌數(shù)量顯著提高（3.75×105cfu/g），而細(xì)菌數(shù)量和真菌數(shù)量則與CK差異不顯著。

表3 黃瓜根際微生物群落多樣性檢測(cè)

2.4 黃瓜葉片理化指標(biāo)的檢測(cè)

對(duì)于植株而言，抗氧化保護(hù)酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）和過(guò)氧化氫酶（CAT），非常重要。當(dāng)植株體內(nèi)處于受脅迫的狀態(tài)時(shí)會(huì)產(chǎn)生氧自由基，抗氧化保護(hù)酶可以有效清除這些氧自由基從而提高植株系統(tǒng)抗性；而丙二醛（MDA）含量反映植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度，含量越高說(shuō)明膜質(zhì)受害越重[1]。由表4可知，施用清香型白酒糟生物有機(jī)肥（T2）后黃瓜葉片中的SOD、POD在3個(gè)處理組中活性最高 [8.05 g/（U·min ） 和 9.84 g/（U·min）]，CAT活性與T1處理差異不顯著但二者均高于CK處理組，MDA含量最低（僅為5.17 μmol/g）；T1處理組黃瓜葉片的MDA含量在3個(gè)處理組中最高（7.56 μmol/g），POD與CAT活性均顯著高于CK，SOD活性與CK差異不顯著。

表4 黃瓜葉片理化指標(biāo)的檢測(cè)

2.5 黃瓜生長(zhǎng)指標(biāo)的檢測(cè)

施用不同肥料后各處理的黃瓜株高、葉面積指數(shù)、植株地上部分鮮重與干重的差異如表5所示。從表5可知，施用清香型白酒糟生物有機(jī)肥（T2）后黃瓜植株長(zhǎng)勢(shì)較其他處理優(yōu)勢(shì)顯著，4項(xiàng)指標(biāo)均為最優(yōu)；T1處理組的株高與CK沒(méi)有顯著差異，其他3項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于CK處理；CK處理各項(xiàng)指標(biāo)均為最低。結(jié)果說(shuō)明，施用清香型白酒糟生物有機(jī)肥可以顯著促進(jìn)黃瓜植株的生長(zhǎng)。

表5 黃瓜生長(zhǎng)指標(biāo)的檢測(cè)

3 結(jié)論

清香型白酒糟因只進(jìn)行2輪發(fā)酵取酒，酒糟中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較其他白酒糟豐富許多，因此是制作生物有機(jī)肥的理想原材料[22]。但經(jīng)試驗(yàn)證明其理化指標(biāo)與腐熟肥料相比還存在一定差距,無(wú)法直接應(yīng)用。本試驗(yàn)以微生物復(fù)合菌劑為發(fā)酵劑對(duì)清香型白酒糟進(jìn)行二次發(fā)酵，發(fā)酵后含菌量符合生物有機(jī)肥標(biāo)準(zhǔn)，制成的清香型白酒糟生物有機(jī)肥與自然放置的酒糟相比理化性質(zhì)發(fā)生了顯著改變，其pH值為8.15、電導(dǎo)率為5.02 mS/cm、OD665為0.005 5、種子發(fā)芽指數(shù)達(dá)到86.04%，達(dá)到了腐熟肥料的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

施用清香型白酒糟生物有機(jī)肥后黃瓜植株根際微生物群落結(jié)構(gòu)與其他2組處理相比發(fā)生了定向改變。一般黃瓜的土傳病害都是由真菌引起的，施肥后群落中的細(xì)菌數(shù)量和放線菌數(shù)量顯著提高，真菌數(shù)量顯著下降，這說(shuō)明施入清香型白酒糟生物有機(jī)肥后黃瓜植株根際土壤的微環(huán)境得到了有效改善。黃瓜葉片中抗氧化保護(hù)酶與丙二醛的含量也證實(shí)了這一點(diǎn)，施用清香型白酒糟生物有機(jī)肥后3種抗氧化保護(hù)酶的含量顯著提高而丙二醛含量顯著下降。施用自然放置的白酒糟后葉片中的丙二醛含量最高，說(shuō)明未完全腐熟的物料對(duì)黃瓜植株有一定的毒害作用。F2處理中黃瓜的株高、葉面積指數(shù)、鮮重和干重與其他2個(gè)處理組相比均為最高，再一次說(shuō)明施用清香型白酒糟生物有機(jī)肥可顯著促進(jìn)黃瓜植株的生長(zhǎng)。

綜上所述，利用復(fù)合菌劑對(duì)清香型白酒糟進(jìn)行二次發(fā)酵可使酒糟完全腐熟，制成的生物有機(jī)肥對(duì)黃瓜生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用，應(yīng)用前景良好。