蔡慧慧

（合肥諾為爾基因科技服務(wù)有限公司，安徽合肥 230000）

褪黑激素主要是由松果體合成分泌的一種激素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為N-乙酰-5-甲氧基色胺，在動(dòng)物的生殖、生物鐘、免疫、抗自由基等方面都有重要影響。褪黑激素受體（Melatonin Receptor，MELR）屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族，人和其他哺乳動(dòng)物的褪黑素受體共3種亞型，分別為MT1、MT2和MT3。褪黑素可與其受體特異性結(jié)合從而發(fā)揮作用，其主要作用部位一般認(rèn)為是腦、垂體和視網(wǎng)膜。褪黑素也作用于動(dòng)物的外周組織，在小鼠的心臟、肺、肝臟和腎臟等多個(gè)外周組織發(fā)現(xiàn)MT1受體的存在[1]。趙勁松等[2]報(bào)道MT1受體在無(wú)蹼壁虎的肝臟中表達(dá)。非洲鴕鳥(niǎo)的卵巢、豚鼠和鴨子的腎臟以及人的外周血淋巴細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了特異的MELR[3]。本文研究揚(yáng)子鱷性腺、胸腺和脾臟中褪黑素受體MT1的表達(dá)和分布，探討褪黑素對(duì)于揚(yáng)子鱷的季節(jié)性生殖及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用鱷為成年揚(yáng)子鱷，分別于2011年8月15日、2011年10月21日和2012年1月5日捕獲成年雄鱷1條，解剖取其睪丸；分別于2011年9月23日、2012年3月21日和2012年7月6日捕獲成年雌鱷1條，解剖取其卵巢，同時(shí)取其胸腺和脾臟等。所有組織均切成小塊，浸入Bouin’s液中固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，厚度為5 μm。實(shí)驗(yàn)所用揚(yáng)子鱷均取自安徽省揚(yáng)子鱷繁育研究中心。

1.2 主要試劑

濃縮型兔抗人、兔、大鼠、小鼠等褪黑素受體多克隆抗體，即用型SABC（兔IgG）試劑盒，DAB顯色試劑盒，抗體稀釋液，以上試劑均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，放入新鮮配制的3%過(guò)氧化氫（H2O2）處理10 min 以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。ddH2O洗3次，每次2min?？乖瓱嵝迯?fù)10 min，暴露易被固定破壞的抗原。PBS洗2次，每次2 min。5%BSA封閉液處理，室溫20 min，以減少非特異性背景。去除多余液體，不洗，滴加一抗，4 ℃孵育過(guò)夜（18h），第一抗體為濃縮型兔抗人、兔、大鼠、小鼠褪黑素受體等多克隆抗體（Melatonin Receptor la，Mel1a，1∶100稀釋?zhuān)?。PBS洗3次，每次2 min。滴加生物素化羊抗兔IgG，室溫20 min。PBS洗3次，每次2min。DAB顯色。ddH2O洗3次，每次2 min。蘇木精輕度復(fù)染。ddH2O洗3次，每次 2 min。脫水，透明，封片。免疫組織化學(xué)法陰性對(duì)照，用PBS代替一抗，其余步驟同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素受體在揚(yáng)子鱷性腺中的表達(dá)

由圖1可知，在揚(yáng)子鱷性腺中，免疫陽(yáng)性反應(yīng)位點(diǎn)主要存在于3月卵巢和7月卵巢的濾泡細(xì)胞層和生殖上皮，9月卵巢的濾泡細(xì)胞的細(xì)胞核以及1月精巢和10月精巢的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞，8月精巢的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。其中，7月卵巢的MT1免疫陽(yáng)性反應(yīng)物存在于濾泡細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核均呈陰性；而9月卵巢中，其免疫陽(yáng)性反應(yīng)物存在于濾泡細(xì)胞的細(xì)胞核，且細(xì)胞核完全被染成棕黃色，其細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜均呈陰性。在不同月份精巢中的分布也具有不同的特點(diǎn)：1月精巢中褪黑素受體呈現(xiàn)出團(tuán)狀聚集分布，且為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色；10月精巢的MT1陽(yáng)性反應(yīng)物主要位于細(xì)胞核，呈顆粒狀，且為散在不均勻分布。

圖1 MT1免疫陽(yáng)性定位在揚(yáng)子鱷不同組織的顯示圖（400×）

2.2 褪黑素受體在揚(yáng)子鱷胸腺中的表達(dá)

由圖2可知，揚(yáng)子鱷胸腺中存在褪黑素受體陽(yáng)性反應(yīng)位點(diǎn)。胸腺組織中的免疫陽(yáng)性反應(yīng)定位于淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核呈陰性。

圖2 MT1免疫陽(yáng)性定位在胸腺的淋巴細(xì)胞（400×）

2.3 褪黑素受體在揚(yáng)子鱷脾臟中的表達(dá)

由圖3可知，揚(yáng)子鱷脾臟中存在褪黑素受體陽(yáng)性反應(yīng)位點(diǎn)。脾臟中的免疫陽(yáng)性反應(yīng)定位于淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核。

圖3 MT1免疫陽(yáng)性定位在脾的淋巴細(xì)胞（400×）

3 討論

3.1 褪黑素受體在揚(yáng)子鱷性腺中的表達(dá)

研究表明，在鳥(niǎo)類(lèi)和一些哺乳類(lèi)動(dòng)物附睪、睪丸和卵泡的顆粒細(xì)胞上存在褪黑素受體。MT1廣泛存在于非洲鴕鳥(niǎo)卵巢中，在每一級(jí)卵泡的生殖上皮、卵泡細(xì)胞層、卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)以及間質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)[4]。本研究對(duì)不同月份的揚(yáng)子鱷性腺中的褪黑素受體進(jìn)行鑒定，結(jié)果提示，褪黑素受體的分布可能存在組織間差異和季節(jié)性差異，褪黑素對(duì)動(dòng)物的生殖功能具有一定的調(diào)節(jié)作用。這種調(diào)節(jié)作用，既可以通過(guò)與MT1膜受體接合經(jīng)G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也可能通過(guò)與MT1質(zhì)受體或核受體結(jié)合激活相應(yīng)的信號(hào)途徑發(fā)揮生理效應(yīng)。

3.2 褪黑素受體在揚(yáng)子鱷胸腺和脾臟中的表達(dá)

胸腺是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，免疫系統(tǒng)外周成分的發(fā)育成熟有賴(lài)于正常的胸腺功能。研究發(fā)現(xiàn)，切除松果體會(huì)導(dǎo)致胸腺加速退化，而注射松果體提取物卻促進(jìn)胸腺增生，已證實(shí)這些效應(yīng)與松果體分泌的褪黑素有關(guān)。褪黑素對(duì)脾臟同樣有作用。將25 μg褪黑素經(jīng)皮下注射給敘利亞倉(cāng)鼠，持續(xù)10周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)鼠的脾臟相對(duì)或絕對(duì)重量增加，且髓外造血功能得到了加強(qiáng)。不同的光照周期也可影響脾臟重量。長(zhǎng)光照（14∶10）與短光照（10∶14）周期相比，前者使脾臟明顯減輕，并使脾臟中淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯減少[5]。

應(yīng)用放射配體結(jié)合法檢測(cè)大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠、雞、鴨、鴿子和鵪鶉的胸腺、腔上囊及脾臟的褪黑素特異結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果顯示鳥(niǎo)類(lèi)及鼠類(lèi)免疫器官均存在褪黑素特異結(jié)合位點(diǎn)，并鑒定為褪黑素受體，證實(shí)免疫組織是褪黑素作用的靶器官，褪黑素對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用是通過(guò)免疫組織上褪黑素受體直接作用的結(jié)果[6-8]。與上述測(cè)定結(jié)果一致，揚(yáng)子鱷胸腺和脾臟中均存在褪黑素受體陽(yáng)性反應(yīng)位點(diǎn)，說(shuō)明揚(yáng)子鱷胸腺和脾臟是褪黑素作用的靶器官，褪黑素能與揚(yáng)子鱷胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞的MT1受體相結(jié)合，直接調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，而非通過(guò)阿片受體等間接作用。

4 結(jié)論

利用免疫組織化學(xué)法對(duì)褪黑素受體在揚(yáng)子鱷不同組織中的分布進(jìn)行了一定的研究。結(jié)果表明，在揚(yáng)子鱷不同月份的卵巢、精巢以及胸腺和脾臟中均存在褪黑素受體。在揚(yáng)子鱷性腺和免疫器官中檢測(cè)到褪黑素受體的存在，說(shuō)明性腺和免疫器官是褪黑素作用的靶器官。褪黑素對(duì)揚(yáng)子鱷生殖、免疫等生理功能的影響是通過(guò)與其靶組織器官中的受體相結(jié)合，進(jìn)而直接參與調(diào)控作用的結(jié)果。