孫 坤，任怡璇，賈凌云，陳大為

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

黨參(Codonopsispilosula(Franch.)Nannf) 為桔梗科植物，主產(chǎn)于陜西、甘肅、四川等地，是我國(guó)重要的傳統(tǒng)中藥[1]，其性味甘平，具有補(bǔ)中益氣、生津止渴、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等功效[2-3].但是近年來(lái)，隨黨參種植面積的不斷擴(kuò)大，其病蟲(chóng)害發(fā)生日益嚴(yán)重，特別是灰霉病危害最為突出，陰濕地區(qū)發(fā)病率高達(dá)80%～100%，造成黨參產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低，成為阻礙黨參種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一[4].

灰霉病(Botrytis cinerea Pers.)是一種常見(jiàn)的植物病害，可危害多種植物.目前灰霉病的防治主要依靠化學(xué)殺菌劑和一些簡(jiǎn)單的農(nóng)業(yè)措施，但是，隨著化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期大量使用，灰霉病菌對(duì)很多藥劑都產(chǎn)生了不同程度的抗性，防治效果開(kāi)始大幅降低.同時(shí)，化學(xué)殺菌劑對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染、危害人畜健康[5].因此，篩選灰霉病拮抗菌并開(kāi)發(fā)具有環(huán)境友好、安全等特性的生物防治藥劑已成為國(guó)內(nèi)外灰霉病防治研究的新趨勢(shì)[6].近年來(lái)，已有諸多關(guān)于拮抗菌防治植物灰霉病的報(bào)道.例如，陳晉等[7]通過(guò)離體葉片和果實(shí)的抑病試驗(yàn)表明非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)可有效防治黃瓜灰霉病；Jiang 等[8]通過(guò)溫室試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)可降低辣椒灰霉病的發(fā)病嚴(yán)重程度；石玉瑩等[9]從番茄土壤中分離到的假單孢屬細(xì)菌(Pseudomonassp.)對(duì)番茄灰霉病具有較好的防治作用；王瀟冉[10]發(fā)現(xiàn)洋蔥伯克氏菌(Burkholderiacontaminans)可有效防治草莓灰霉病.但是，在黨參灰霉病拮抗菌的篩選及其生物防治的研究甚少.

為得到對(duì)黨參灰霉病有良好防治效果的拮抗細(xì)菌，本試驗(yàn)分離了黨參根際土壤和根、莖、葉中的細(xì)菌并對(duì)其進(jìn)行篩選，并在盆栽條件下測(cè)定了拮抗菌對(duì)灰霉病的防治效果，以期為今后黨參灰霉病的生物防治提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病原菌：黨參灰霉病菌(Botrytiscinerea)由西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院逆境植物進(jìn)化與發(fā)育實(shí)驗(yàn)室保存.

供試植株與土樣： 2019年9月于甘肅省定西市安定區(qū)、渭源縣和岷縣采集黨參種植試驗(yàn)田中的健康黨參植株及其根際土壤，每一田地各采集3份，采集地信息見(jiàn)表1.隨機(jī)挖取田中的健康黨參植株，同時(shí)取其地表下5～10 cm處的新鮮土壤，采用抖落法[11]取與健康黨參植株根系緊密結(jié)合的土壤，帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

表1 樣品采集地信息

1.2 拮抗細(xì)菌的分離與純化

根際細(xì)菌的分離采用土壤稀釋涂布法[12].先稱取10 g土樣，置于盛有90 mL 無(wú)菌水的三角瓶中(原液)，于150 r·min-1恒溫振蕩12 h后制成土壤懸液備用.將制成的懸液稀釋至10-5,10-6,10-7梯度，分別吸取 100 μL 均勻涂布于NA培養(yǎng)基上，每組處理重復(fù)3次.

內(nèi)生細(xì)菌的分離采用組織勻漿法[13].將采集的新鮮黨參用自來(lái)水清洗表面附著的土壤和灰塵并晾干.分別稱取根、莖、葉各0.2 g于75%的乙醇中浸泡1 min后用濃度為1% NaClO溶液浸泡30 s，再用無(wú)菌水沖洗5次.取經(jīng)消毒處理過(guò)的根、莖、葉放置于無(wú)菌研缽中，加入1.8 mL無(wú)菌水研磨至糊狀，取1 mL加入到9 mL無(wú)菌水中，梯度稀釋制成菌液濃度為10-5，10-6和10-7CFU·mL-1的稀釋液，取稀釋液100 μL分別涂布于NA平板上，每組處理3個(gè)重復(fù).吸取等量用于最后一次清洗的無(wú)菌水涂布于NA培養(yǎng)基上檢查表面滅菌效果.28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落形態(tài)、大小等特征挑取不同的單菌落并在平板上劃線純化.根際細(xì)菌以GJ+采集地的方式命名，如：GJWY-1…n.分離自根、莖、葉的內(nèi)生細(xì)菌分別以NS+采集地首字母+1-1…n、NS+采集地首字母+2-1…n和NS+采集地首字母+3-1…n命名后于4 ℃冰箱斜面保存.

1.3 拮抗細(xì)菌的篩選

1.3.1 拮抗細(xì)菌的初篩 采用平板對(duì)峙法[14]，十字交叉法在PDA平板背面做標(biāo)記，中心位置接倒置的灰霉病菌菌餅(d=5 mm)，于十字兩端等距離(距中心位置30 mm)處劃線接種供試細(xì)菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，以只接灰霉病菌菌餅的平板為對(duì)照，每組處理3個(gè)重復(fù).28 ℃培養(yǎng)5 d后測(cè)量菌落直徑，并按公式計(jì)算抑制率[14]:

1.3.2 拮抗細(xì)菌的復(fù)篩 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[12]，將初篩抑制率最高的菌株NSW3-1接種在NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃,180 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后，4 ℃,10 000 r·min-1離心20 min，所得上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾得到無(wú)菌發(fā)酵濾液.取制備好的無(wú)菌發(fā)酵濾液2 mL與冷至45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基18 mL混合加入培養(yǎng)皿內(nèi)，制成含有拮抗菌發(fā)酵液的固體平板.于平板中央接入灰霉病菌菌餅(d=5 mm)，每組處理3個(gè)重復(fù)，以加入2 mL無(wú)菌水的PDA作對(duì)照.28 ℃下恒溫培養(yǎng)，對(duì)照組菌絲將鋪滿整個(gè)平板時(shí)用十字交叉法測(cè)量對(duì)照菌落直徑和處理菌落生長(zhǎng)直徑，并計(jì)算抑制率[14].

1.4 拮抗細(xì)菌的鑒定

1.4.1 表型特征及生理生化測(cè)定 將篩選出的拮抗菌于NA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察菌落形態(tài)、大小以及經(jīng)革蘭氏染色后的顏色等特征.參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]中的方法對(duì)菌株的接觸酶、淀粉水解、明膠液化等生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定.

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 利用16S rDNA序列分析方法，采用Cheng等[16]的方法提取細(xì)菌DNA.使用細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17].PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，從第2步到第4步共30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，4 ℃ 永久保存.所得PCR產(chǎn)物由測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定.測(cè)序結(jié)果登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，獲得近緣物種的信息，利用MEGA7軟件Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(T代表模式菌株)，確定分類位置.

1.5 室內(nèi)盆栽防效測(cè)定

采用葉面噴霧的方法，試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)處理組1×106,1×107和1×108CFU·mL-1，2個(gè)對(duì)照組無(wú)菌培養(yǎng)基(不接菌)和病原菌+無(wú)菌培養(yǎng)基(CK).

拮抗細(xì)菌發(fā)酵液的制備：將篩選出的拮抗細(xì)菌接種在NA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)1 d.以接種環(huán)挑取菌株菌落，接入裝有50 mL NB液體培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，28 ℃,180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，得菌株種子液.將種子液按1%接種量加入到50 mL(150 mL三角瓶)的NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃,180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，得菌株發(fā)酵液.

分生孢子懸浮液的制備：將黨參灰霉病菌(Botrytiscinerea)在PDA平板上培養(yǎng)7 d后在培養(yǎng)基中加入無(wú)菌水，輕輕震蕩30 min后用血球計(jì)數(shù)板將分生孢子濃度調(diào)整為1×106個(gè)·mL-1備用.

黨參種子的萌發(fā)及移栽：黨參種子于25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱萌發(fā)，條件設(shè)定為12 h光照、12 h黑暗，種子露白后移栽入裝有營(yíng)養(yǎng)土(滅菌)的花盆中，待黨參長(zhǎng)至6～8葉期時(shí)進(jìn)行防效測(cè)定.

預(yù)防試驗(yàn)：將稀釋的拮抗細(xì)菌發(fā)酵液(20 mL)噴施于黨參幼苗，以葉片布滿稀釋的發(fā)酵液而不滴水為度.待植株葉片上的發(fā)酵液變干后，接種灰霉病菌孢子懸浮液(20 mL)于各處理植株，兩組對(duì)照的處理分別為只噴施NB液體培養(yǎng)基和噴施NB液體培養(yǎng)基后再接種病原菌孢子懸浮液，25 ℃保濕處理48 h，14 d后按病害分級(jí)統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，并按公式計(jì)算病情指數(shù)和防效.

治療試驗(yàn)：將黨參灰霉病菌孢子懸浮液(20 mL)噴施于黨參幼苗，25℃保濕48 h后，將拮抗細(xì)菌稀釋發(fā)酵液(20 mL)噴施于處理后的黨參幼苗，兩組對(duì)照的處理分別為只噴施NB液體培養(yǎng)基和接種病原菌孢子懸浮液后再噴施NB液體培養(yǎng)基，噴霧處理后第14 d調(diào)查發(fā)病情況并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果.

按病斑面積占葉片總面積的百分比對(duì)黨參灰霉病發(fā)病情況進(jìn)行定級(jí)[18]：0級(jí)(0%)、1級(jí)(5%以下)、3級(jí)(6%～10%)、5級(jí)(11%～25%)、7級(jí)(26%～50%)、9級(jí)(>50%).

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用SPSS 17.0軟件的Duncan氏新復(fù)極差法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的初篩

從土壤樣品中分離出39株根際細(xì)菌，其中抑制率>50%的為12株，占全分離的30.77%.黨參根、莖、葉中分別分離出11株、3株和8株，共22株內(nèi)生細(xì)菌，其中抑制率>50%的為3株，占全分離的13.64%.初篩結(jié)果顯示，分離自渭源栽培黨參葉組織的菌株NSW3-1抑制率最高，達(dá)到92.31%(表2).

表2 拮抗細(xì)菌對(duì)灰霉病菌的抑制作用初篩結(jié)果

2.2 拮抗細(xì)菌的復(fù)篩

對(duì)初篩效果最好的菌株NSW3-1進(jìn)行復(fù)篩，

結(jié)果表明，NSW3-1的發(fā)酵濾液對(duì)黨參灰霉病菌具有明顯的抑制作用(圖1)，且抑制率可達(dá)86.88%.

圖1 拮抗細(xì)菌NSW3-1無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)黨參灰霉 病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.3 拮抗細(xì)菌NSW3-1的鑒定

2.3.1 表型特征觀察及生理生化測(cè)定 拮抗細(xì)菌NSW3-1于NA培養(yǎng)基上菌落呈白色圓形，大小中等，半透明，表面粗糙，邊緣由不規(guī)則到整齊(圖2A-C).光學(xué)顯微鏡(100×)下觀察細(xì)胞(圖2D)為桿狀，多為單個(gè)排列、兩端平滑，革蘭氏染色呈紫色為陽(yáng)性.由表3可知，NSW3-1可用于葡萄糖、麥芽糖、甘油和檸檬酸鹽，能有效液化明膠、還原硝酸鹽、水解淀粉，V-P實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)均呈陽(yáng)性，與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]中描述的枯草芽胞桿菌(B.subtilis)的生理生化特征基本相同，初步鑒定為枯草芽胞桿菌.

A 正面；B 背面；C 單菌落；D 光學(xué)顯微鏡下的顯微形態(tài)

表3 生理生化測(cè)定結(jié)果

2.3.2 16S rDNA序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 經(jīng)測(cè)序分析，菌株NSW3-1的16S rDNA基因片段長(zhǎng)度約為1 436 bp，提交Genbank獲得的注冊(cè)號(hào)為MW131662.系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中(圖3)，菌株NSW3-1與2株枯草芽胞桿菌的模式菌株(B.subtilis)位于同一分支，其聚類支持強(qiáng)度為100%.結(jié)合形態(tài)和生理生化特征，最終確定菌株NSW3-1為枯草芽胞桿菌(B.subtilis).

圖3 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的菌株NSW3-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 室內(nèi)盆栽防效測(cè)定

由表4可知，接種黨參灰霉病病原菌第14 d時(shí)，預(yù)防試驗(yàn)和治療試驗(yàn)的對(duì)照組黨參(CK)病情指數(shù)分別為45.22和51.70，而經(jīng)菌株NSW3-1不同濃度發(fā)酵液處理的黨參病情指數(shù)顯著低于對(duì)照組.結(jié)果表明，灰霉病的防效隨發(fā)酵液濃度的增大而增大.其中，1×108CFU·mL-1的發(fā)酵液對(duì)灰霉病的預(yù)防和治療效果最好，分別為89.42%和81.20%；當(dāng)發(fā)酵液濃度為1×107CFU·mL-1時(shí)，預(yù)防效果和治療效果下降至66.89%和65.08%；發(fā)酵液濃度為1×106CFU·mL-1時(shí)，預(yù)防效果和治療效果分別為55.64%和56.88%.

表4 盆栽試驗(yàn)中菌株NSW3-1對(duì)黨參灰霉病的防治效果

3 討論

生物防治由于具有安全、綠色等特點(diǎn)，在植物病害防治上已成為一個(gè)重要的研究領(lǐng)域，該方法運(yùn)用于藥用植物病害防治可保證用藥安全[19-20].此前，諸多學(xué)者已從藥用植物生存環(huán)境中篩選到對(duì)灰霉病具有生防作用的菌株.陳長(zhǎng)卿等[21]從人參莖部分離出一株內(nèi)生拮抗細(xì)菌NJ13(Bacillusmethylotrophicus)，對(duì)人參灰霉病的平均防效可達(dá)73.86%.蔣妮等[22]從三七植株土壤中分離到棘孢木霉(Trichodermaasperellum)，其對(duì)三七灰霉病有較好的防治作用.但在我國(guó)常見(jiàn)中藥材黨參的種植中，黨參灰霉病的生物防治仍鮮有報(bào)道.本研究通過(guò)初步篩選得到了15株對(duì)黨參灰霉病菌有較強(qiáng)抑制作用的細(xì)菌，其中抑制率最高(92.31%)的細(xì)菌為NSW3-1，經(jīng)鑒定該細(xì)菌為枯草芽胞桿菌，該菌株分離自渭源栽培黨參的葉組織，其發(fā)酵濾液可抑制灰霉病菌菌絲的生長(zhǎng)，這可能與發(fā)酵濾液中含有抗菌蛋白有關(guān)[23].另外，芽孢桿菌屬是一類具有重大潛在價(jià)值的微生物資源，可防治多種植物灰霉病.潘曉梅[24]發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)對(duì)番茄灰霉病具有防治作用；張立新等[25]篩選到的特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)對(duì)采后櫻桃灰霉病的發(fā)生有良好的防控效果；Mousavi等[26]發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌發(fā)酵液對(duì)薔薇灰霉病的防治亦有顯著效果.其中，枯草芽胞桿菌因具有抑菌廣譜性、繁殖迅速、易于儲(chǔ)存、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用[27-29].因此，本試驗(yàn)篩選鑒定的枯草芽胞桿菌NSW3-1可為黨參灰霉病的生物防治提供菌種資源.

利用枯草芽胞桿菌進(jìn)行室內(nèi)盆栽防效測(cè)定時(shí)，Wang等[30]用預(yù)防試驗(yàn)測(cè)定了菌株WXCDD105的發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病的預(yù)防效果，李麗梅等[31]采用了相同的方法，測(cè)定了菌株BS03對(duì)黃瓜灰霉病的預(yù)防效果.而本試驗(yàn)將枯草芽胞桿菌發(fā)酵液稀釋為3個(gè)不同濃度梯度通過(guò)先接種拮抗菌再接種病原菌和先接種病原菌再接種拮抗菌的方法對(duì)黨參灰霉病進(jìn)行了預(yù)防和治療試驗(yàn).結(jié)果顯示，枯草芽胞桿菌NSW3-1的低濃度和高濃度發(fā)酵液在室內(nèi)盆栽的預(yù)防和治療試驗(yàn)中均有較好的防治作用.當(dāng)發(fā)酵液濃度為1×106CFU·mL-1時(shí)，治療效果為56.88%，優(yōu)于預(yù)防效果(55.64%)，濃度為1×107和1×108CFU·mL-1時(shí)，預(yù)防效果優(yōu)于治療效果，因此利用菌株NSW3-1防治黨參灰霉病時(shí)應(yīng)采用預(yù)防為主,治療為輔的方法.喬俊卿等[32]利用枯草芽胞桿菌PTS-394濃度為1×107CFU·mL1的發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)防試驗(yàn)時(shí)預(yù)防效果為58.2%，Bu等[33]發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌L1-21濃度為1×108CFU·mL-1的發(fā)酵液對(duì)灰霉病的預(yù)防效果為86.57%，而菌株NSW3-1同濃度的發(fā)酵液預(yù)防效果分別達(dá)到66.89%和89.42%，均高于上述試驗(yàn)的預(yù)防效果.有關(guān)商業(yè)化枯草芽胞桿菌可濕性粉劑對(duì)灰霉病的防治也有報(bào)道.王學(xué)慧等[34]利用枯草芽胞桿菌可濕性粉劑2 000倍對(duì)番茄灰霉病的治療效果為83.06%，而本試驗(yàn)中NSW3-1的治療效果為56.88%,65.08%和81.20%，低于枯草芽胞桿菌可濕性粉劑，這可能是由于環(huán)境條件的多變性導(dǎo)致單一菌株對(duì)灰霉病的防治效果低下.而經(jīng)過(guò)制劑加工往往避免了外界因素對(duì)拮抗菌的影響，因此防治效果優(yōu)于NSW3-1[35].

綜上，枯草芽胞桿菌NSW3-1不僅有效防治黨參灰霉病，同時(shí)具備綠色、無(wú)污染、對(duì)環(huán)境友好和維持生態(tài)平衡等特點(diǎn)，有開(kāi)發(fā)為防治藥用植物病害新型生物源農(nóng)藥的潛力.但是，目前本試驗(yàn)僅在盆栽條件下對(duì)黨參灰霉病的生防效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，該菌在田間對(duì)黨參灰霉病的防治效果及其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究.