丁軒 劉建蕊 楊青青 冉麗 鄭姚佩 田羽 韋永琴 劉維芳 李祝
摘要:本試驗(yàn)利用10種生物誘導(dǎo)子和6種非生物誘導(dǎo)子提高黑曲霉(Aspergillus niger)xj發(fā)酵液中糠醛和5-羥甲基糠醛(5-HMF)的產(chǎn)量。先采用單因素試驗(yàn)篩選誘導(dǎo)子及誘導(dǎo)條件,再設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)并結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳的誘導(dǎo)條件。結(jié)果表明:將黑曲霉xj的種子液與誘導(dǎo)子一同接入發(fā)酵培養(yǎng)基,加入0.675%還原糖濃度為10 μg/mL的金葡萄球菌代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子,誘導(dǎo)8.6 h,此時(shí)發(fā)酵液中糠醛的產(chǎn)量為50.49 μg/mL,相較優(yōu)化之前糠醛的含量提高了37%;而在此條件下發(fā)酵液中5-HMF的產(chǎn)量為41.12 μg/mL,提高了31%。該試驗(yàn)結(jié)果可為后續(xù)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)糠醛和5-HMF提供參考。
關(guān)鍵詞:糠醛;5-羥甲基糠醛;黑曲霉;誘導(dǎo)子;響應(yīng)面優(yōu)化
中圖分類號(hào):Q939文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A
文章編號(hào):1008-0457(2022)03-0034-08國際DOI編碼:10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.03.005
糠醛(Furfural)是一種重要的生物質(zhì)平臺(tái)化合物,其分子結(jié)構(gòu)中含有呋喃環(huán)和醛基,化學(xué)性質(zhì)活潑,可作為多種化學(xué)產(chǎn)品的起始原料,廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、化工、能源等領(lǐng)域[1-3]。張素等[4]、趙妗頤等[5]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑曲霉xj菌株粗提物中對(duì)齊整小核菌和鏈格孢菌具有拮抗作用的物質(zhì)可能是糠醛,說明糠醛可能具有抑菌作用。目前生產(chǎn)糠醛主要是酸水解法,戊糖經(jīng)酸催化環(huán)化脫水形成,而大多含有戊糖的物質(zhì)都可作為原材料生產(chǎn)糠醛[6]。五-羥甲基糠醛(5-Hydorxymethylfurfural,簡(jiǎn)寫為5-HMF),因其具有呋喃環(huán)、醛基及羥基,所以穩(wěn)定性差、性質(zhì)活潑,是一種重要的平臺(tái)化學(xué)物??赏ㄟ^縮合反應(yīng)、氧化反應(yīng)、氫化反應(yīng)和縮醛等反應(yīng),合成多種具有高附加價(jià)值的衍生物如2,5-二呋喃甲醛(DFF)、五-酰基糠酸(HMFCA)等。5-HMF的眾多衍生物可作為有機(jī)導(dǎo)體、生物燃料,在醫(yī)藥方面具有抗癌細(xì)胞增值活性,降血糖等藥理作用[7-10]。馬明超等[11]展示了許多制備5-HMF的方法,其中葡萄糖轉(zhuǎn)化制備 5-HMF的方法達(dá)到72%的產(chǎn)率。雖然目前生產(chǎn)糠醛和5-HMF的方法眾多,但仍存在產(chǎn)率較低、生產(chǎn)資源浪費(fèi)等情況。
黑曲霉(Aspergillus niger)屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科,是絲狀真菌中一個(gè)常見真菌[12-13]。具有生長(zhǎng)旺盛、發(fā)酵周期短、不產(chǎn)生毒素等特點(diǎn),屬于GRAS菌種,是應(yīng)用于食品工業(yè)上發(fā)酵和生產(chǎn)酶制劑的主要菌種[14]。黑曲霉的基因組中發(fā)現(xiàn)了大量與次級(jí)代謝有關(guān)的基因簇,可以產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物[15],關(guān)麗萍等[16]在海洋真菌Aspergillus niger 2HL-M -8的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)11個(gè)黑曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物。因其具有高產(chǎn)、高分泌、高安全性等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛地應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中,其中黑曲霉已被用于規(guī)?;罅堪l(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。
目前提高次級(jí)代謝產(chǎn)量的方法主要有菌株選育、發(fā)酵優(yōu)化、微生物共培養(yǎng)[17-19]。誘變選育菌株[17]包含化學(xué)誘變、物理誘變以及復(fù)合誘變。在誘變選育中常使用2種以上的誘變方法復(fù)合誘變提高誘變效應(yīng);發(fā)酵優(yōu)化[18]為發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化和培養(yǎng)條件的優(yōu)化;而微生物共培養(yǎng)發(fā)酵[19]可以使活性粗提取物增加、促進(jìn)次級(jí)代謝產(chǎn)量的提高以及誘導(dǎo)新的次級(jí)代謝物的合成,還可誘發(fā)原次級(jí)代謝物的類似物的共同途徑。除以上三種提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的方法外,目前誘導(dǎo)子也廣泛應(yīng)用于提高次級(jí)代謝產(chǎn)量。
誘導(dǎo)子(Elicitor)最初定義為可誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生和積累植保素的化學(xué)物質(zhì)[20],但隨著誘導(dǎo)子的應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)大,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子是一類可以特異激活植物或微生物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)[21-22]。目前誘導(dǎo)子已廣泛應(yīng)用于提高植物中次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量且誘導(dǎo)機(jī)制較成熟透徹[23-25]。而誘導(dǎo)子在微生物方面的應(yīng)用主要是關(guān)于促進(jìn)納他霉素的產(chǎn)量,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃青霉代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子和黑曲霉代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子對(duì)產(chǎn)納他霉具有較好的促進(jìn)作用[26-27]。目前將誘導(dǎo)子用于提高黑曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)量的研究很少見,本試驗(yàn)主要利用誘導(dǎo)子來提高黑曲霉產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物—糠醛和5-HMF的產(chǎn)量,以便為后續(xù)的黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)糠醛和5-HMF提供參考。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1主要試驗(yàn)菌種
黑曲霉(Aspergillus niger)xj,由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離[5],現(xiàn)于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存(CCTCC No:M206021)。
1.1.2培養(yǎng)基及試劑
馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PDB);馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA);LB培養(yǎng)基;0.1%吐溫-80溶液。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1誘導(dǎo)子的制備
1.2.1.1誘導(dǎo)子類型
本次試驗(yàn)以10種生物誘導(dǎo)子(表1)和6種非生物誘導(dǎo)子CuSO4、苯甲酸鈉、氨基寡糖素、抗壞血酸、苯丙氨酸、色氨酸為篩選目標(biāo)。
1.2.1.2非生物誘導(dǎo)子的制備
參考聶麗[28]的試驗(yàn)方法,將上述非生物誘導(dǎo)子配成濃度為10 μg/mL的溶液,經(jīng)0.45 μm濾膜后得到的溶液即為非生物誘導(dǎo)子。
1.2.1.3生物誘導(dǎo)子的制備
采用凍融研磨法制備生物誘導(dǎo)子。除微生物的培養(yǎng)方式不同外,其余步驟與聶麗[28]相同,改動(dòng)如下。
真菌誘導(dǎo)子:用打孔器分別將鏈格孢菌(Alternaria alternata)、煙草疫霉(Phytophthora nictotianae)、齊整小核菌(Sclerotium rolfsis)制成菌餅后,分別接種到PDB 培養(yǎng)基(100 mL/250 mL)中,于28 ℃,180 r/min 培養(yǎng)7 d,其中齊整小核菌28 ℃靜止培養(yǎng)7 d,過濾收集菌體。將收集的菌體參照聶麗[28]的凍融研磨法制備誘導(dǎo)子,后置于4 ℃冰箱中備用。
細(xì)菌誘導(dǎo)子:分別將青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tume faciens)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)接種到LB培養(yǎng)基(100 mL/250 mL)中30 ℃,150 r/min培養(yǎng)2 d;大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)接種到LB培養(yǎng)基中,于37 ℃,180 r/min培養(yǎng)2 d,10000 r/min離心10 min 收集菌體。收集到的菌體同真菌誘導(dǎo)子制備方法一致。
1.2.1.4生物誘導(dǎo)子還原糖含量的測(cè)定
以還原糖含量作為生物誘導(dǎo)子質(zhì)量濃度的指標(biāo),采用3,5 一二硝基水楊酸(DNS)比色法測(cè)定其還原糖含量。參照趙凱等[29]試驗(yàn)利用DNS比色法測(cè)定還原糖濃度,選取DNS試劑2在波長(zhǎng)為550 nm處測(cè)定。
1.2.2黑曲霉種子液的生長(zhǎng)曲線
將活化的黑曲霉接種于PDA培養(yǎng)基中,于26 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,用適量的0.1%吐溫-80無菌溶液洗下孢子。參照袁洪威等[30]的試驗(yàn)方法用分光光度計(jì)測(cè)定黑曲霉孢子懸浮液濃度。制備濃度為107CFU/mL孢子懸浮液,以6%的接種量加入種子培養(yǎng)基(50 mL/250 mL)中。培養(yǎng)8 d,每24 h取樣測(cè)定菌體干重。
1.2.3發(fā)酵液中糠醛和5-HMF含量的測(cè)定
1.2.3.1建立糠醛和5-HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線模型
試驗(yàn)方法參照彭秋菊等[31]和張素等[32]用HPLC法測(cè)定黑曲霉發(fā)酵液中五-羥甲基糠醛和糠醛的含量,建立糠醛和5-HMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.3.2發(fā)酵液中糠醛和5-HMF含量的測(cè)定
參照彭秋菊等[31]和張素等[32]用HPLC法測(cè)定黑曲霉發(fā)酵液中糠醛和5-HMF的含量。稍有改動(dòng),改動(dòng)如下:將斜面培養(yǎng)基中的黑曲霉活化,制成107CFU/mL孢子懸浮液,將孢子懸液以8%~12%(V/V)接種于發(fā)酵瓶中培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液處理方法以及色譜條件與彭秋菊等[31]試驗(yàn)一致。
1.2.4誘導(dǎo)子篩選及優(yōu)化
主要以發(fā)酵液中糠醛含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的種子液按6%的接種量加入發(fā)酵培養(yǎng)基(50 mL/250 mL)中,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。
1.2.4.1誘導(dǎo)子種類及最佳添加時(shí)間的篩選
將濃度為10 μg/mL的氨基寡糖素、抗壞血酸、苯丙氨酸、色氨酸和濃度為10 μmol/mL的CuSO4和苯甲酸鈉,還原糖濃度為10 μg/mL的生物誘導(dǎo)子以1%的添加量,在誘導(dǎo)時(shí)間為72 h的條件下,添加時(shí)間設(shè)為0 d、3 d、5 d,測(cè)糠醛和5-HMF的含量。以糠醛含量為指標(biāo),篩選最佳誘導(dǎo)子及最佳添加時(shí)間。以不添加誘導(dǎo)子為空白對(duì)照。
1.2.4.2誘導(dǎo)子添加量的篩選
在誘導(dǎo)子為10 μg/mL SAE,添加時(shí)間為0 d,誘導(dǎo)時(shí)間為72 h的條件下,添加量設(shè)為1%、2%、4%、6%、8%、10%,測(cè)糠醛和5-HMF含量。
1.2.4.3誘導(dǎo)子誘導(dǎo)時(shí)間的篩選
在添加量為1%的10 μg/mL SAE,添加時(shí)間為0 d的條件下,誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h,測(cè)糠醛和5-HMF含量(誘導(dǎo)時(shí)間從誘導(dǎo)子加入后開始計(jì)算,而發(fā)酵時(shí)間針對(duì)空白對(duì)照,包含添加時(shí)間)。1.2.5響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取最佳條件作為0因素水平,設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)(表2)。利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)方案,以黑曲霉發(fā)酵液中的糠醛產(chǎn)量為響應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面分析,預(yù)測(cè)誘導(dǎo)子在黑曲霉發(fā)酵體系中的最佳誘導(dǎo)條件。(因?yàn)樽罴烟砑訒r(shí)間為0 d,左邊已是極值,故選用1d為0水平)
2結(jié)果與分析
2.1還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線
利用DNS法測(cè)定還原糖濃度(即生物誘導(dǎo)子質(zhì)量濃度)。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性回歸方程為y=0.4957x-0.0088(R2=0.998),葡萄糖含量在0~1.2 mg之間,具有良好線性關(guān)系。
2.2黑曲霉在種子培養(yǎng)基中的的生長(zhǎng)曲線
將濃度為107CFU/mL孢子懸浮液以6%的接種量接入種子培養(yǎng)基,裝液量為50 mL/250 mL。由圖1可知,經(jīng)過3 d培養(yǎng)后菌種生物量最大,即將進(jìn)入穩(wěn)定期,可將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期(3 d)的培養(yǎng)液作為種子液,進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。
2.3糠醛和五羥甲基糠醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線
利用HPLC法測(cè)定糠醛和5-HMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中糠醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=57.582x+195.82(R2=0.999)。5-HMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=72.107x-11.357(R2=0.999)。兩個(gè)方程在0~60 μg/mL濃度范圍具有良好線性關(guān)系。
2.4誘導(dǎo)子種類及誘導(dǎo)時(shí)間篩選
分別向已培養(yǎng)0 d、3 d、5 d的發(fā)酵培養(yǎng)液中添加10種生物誘導(dǎo)子及6種非生物誘導(dǎo)子。其中非生物誘導(dǎo)子對(duì)于黑曲霉的作用效果不明顯,但生物誘導(dǎo)子有較明顯的作用效果。綜合圖2-4來看,相比于CK培養(yǎng)基液中的糠醛產(chǎn)量,0 d添加的ATFE、SAE、AAE、PNE具有促進(jìn)作用。其中SAE的誘導(dǎo)效果最佳,其余誘導(dǎo)子對(duì)糠醛產(chǎn)量均表現(xiàn)為抑制作用,其中PNE對(duì)菌體的生長(zhǎng)也具有抑制作用;在3 d時(shí)添加誘導(dǎo)子均表現(xiàn)為促進(jìn)作用;在5 d時(shí)添加誘導(dǎo)子較0 d糠醛的產(chǎn)量減少??芍? d添加SAE效果顯著優(yōu)越,糠醛含量達(dá)47.44 μg/mL,較空白對(duì)照(CK)提升了19.18 μg/mL;5-HMF含量達(dá)38.59 μg/mL,較空白對(duì)照提高了16.50 μg/mL。故選擇最佳誘導(dǎo)子為SAE,最佳添加時(shí)間為0 d。
2.5誘導(dǎo)子最佳添加量的篩選
在誘導(dǎo)子為10 μg/mL SAE,添加時(shí)間為0 d,誘導(dǎo)時(shí)間為72 h的條件下,添加量按1%、2%、4%、6%、8%、10%與黑曲霉種子液一起加入發(fā)酵液中,測(cè)定糠醛和5-HMF的含量。由圖5可知,1%的添加量產(chǎn)生糠醛含量較高,其余濃度對(duì)產(chǎn)糠醛影響不大,故選取1%為最佳添加量。
2.6誘導(dǎo)子最佳誘導(dǎo)時(shí)間的篩選
在添加量為1%的10 μg/mL SAE,添加時(shí)間為0 d的條件下,誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h(從加入誘導(dǎo)子時(shí)間開始計(jì)算)。由圖6可知,誘導(dǎo)子時(shí)間為12 h對(duì)促進(jìn)黑曲霉產(chǎn)生糠醛含量最大達(dá)到53.22 μg/mL;5-HMF含量達(dá)42.46 μg/mL。故最佳誘導(dǎo)時(shí)間為12 h。
2.7響應(yīng)面法優(yōu)化誘導(dǎo)條件
2.7.1響應(yīng)面的模型建立與統(tǒng)計(jì)分析
確定單因素的最佳值后,進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn),以發(fā)酵液中的糠醛(Y)的產(chǎn)量為響應(yīng)值,誘導(dǎo)子的添加時(shí)間(A)、添加量(B)以及誘導(dǎo)時(shí)間(C)為變量,進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),結(jié)果如表3所示。
根據(jù)表3的試驗(yàn)結(jié)果,利用Design Expert 8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到糠醛的回歸方程:Y1=42.71-13.2A-0.15B-1.09C+0.47AB+1.01AC+0.59BC-5.66A2-1.02B2-7.73C2。
由表4可知,添加時(shí)間(A)的一次項(xiàng)和誘導(dǎo)時(shí)間的二次項(xiàng)(C2)對(duì)發(fā)酵液中糠醛的產(chǎn)量影響具有極顯著性(P<0.01),添加時(shí)間的二次項(xiàng)(A2)對(duì)發(fā)酵液中糠醛的產(chǎn)量影響具有顯著性(P<0.05),其余的變量影響不顯著(P>0.05)。根據(jù)α=0.05的顯著水平除去不顯著因素后,將回歸方程簡(jiǎn)化為Y1=42.71-13.2A- 5.66A2-7.73C2。該回歸方程的變量與因變量之間的線性關(guān)系顯著(R2=0.9467),模型調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)為R2Adj=0.8782,說明該模型可以解釋87.82%響應(yīng)值的變化,擬合程度較好[33]。
2.7.2響應(yīng)面分析及優(yōu)化
利用Design Expert根據(jù)回歸方程進(jìn)行響應(yīng)面分析,尋找糠醛產(chǎn)量最大的誘導(dǎo)條件。響應(yīng)面的陡峭程度可以表明變量對(duì)因變量的影響程度,響應(yīng)面越陡峭說明相關(guān)因素影響效果越明顯。由圖7可知,三個(gè)因素對(duì)黑曲霉產(chǎn)糠醛的影響表現(xiàn)為:添加時(shí)間(A)>誘導(dǎo)時(shí)間(C)>添加量(B)。對(duì)模型進(jìn)行分析,得到最優(yōu)的培養(yǎng)條件:添加時(shí)間為0 d、添加量為0.675%、誘導(dǎo)時(shí)間為8.6 h,此條件下的糠醛含量理論值為50.52 μg/mL。根據(jù)給出的最佳培養(yǎng)條件設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證(設(shè)置三組平行試驗(yàn))得出發(fā)酵液中糠醛的實(shí)際含量分別為50.51、50.47、50.48 μg/mL,與預(yù)測(cè)值較為接近,說明此模型可以較好地預(yù)測(cè)誘導(dǎo)條件下的糠醛產(chǎn)量。而在糠醛的最佳誘導(dǎo)條件下發(fā)酵液中5-HMF的實(shí)際產(chǎn)量也達(dá)到了41.12 μg/mL。
3結(jié)論與討論
用誘導(dǎo)子提高微生物次級(jí)代謝的產(chǎn)量,不僅與黑曲霉自身的發(fā)酵特性有關(guān),還跟誘導(dǎo)子的種類、誘導(dǎo)子的含量、添加時(shí)間和誘導(dǎo)時(shí)間有密切的關(guān)系。聶麗[28,34]等試驗(yàn)表明細(xì)菌誘導(dǎo)子內(nèi)的活性成分主要是多糖類物質(zhì)和蛋白質(zhì),并且在誘導(dǎo)鏈霉菌合成農(nóng)抗702時(shí)也是細(xì)菌誘導(dǎo)子具有較好的誘導(dǎo)效果。結(jié)果顯示,對(duì)黑曲霉發(fā)酵作用最好的誘導(dǎo)子為金葡萄球菌代謝產(chǎn)物,是一種細(xì)菌代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子,說明細(xì)菌代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子對(duì)微生物產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物具有一定的作用效果,但對(duì)于SAE內(nèi)的具體有效物質(zhì)還是未知的。在確定最佳誘導(dǎo)子后,觀察誘導(dǎo)子的含量、添加時(shí)間和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)其誘導(dǎo)效果的影響。本試驗(yàn)在添加濃度為1%時(shí)產(chǎn)糠醛量最大,但隨著誘導(dǎo)子的含量增加,出現(xiàn)產(chǎn)糠醛含量較高的添加量。有人將誘導(dǎo)子含量與次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量的關(guān)系概括為飽和型和最適型[35],最適型可以解釋本試驗(yàn)的情況。本試驗(yàn)的最佳添加時(shí)間是將種子液與金葡萄球菌代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子一同接入發(fā)酵培養(yǎng)基,即為0 d,表明在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期時(shí)加入誘導(dǎo)子,次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量較多。在邊猛[36]試驗(yàn)中利用Bacillus sp.代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子作用于海洋真菌,結(jié)果表明將真菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期加入誘導(dǎo)子,產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物含量最高,這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。關(guān)于誘導(dǎo)子最佳添加時(shí)間出現(xiàn)的情況,可能是由于在真菌培養(yǎng)早期合成糠醛和5-HMF的關(guān)鍵酶前體物質(zhì)不足,導(dǎo)致早期加入誘導(dǎo)子無法激活關(guān)鍵酶的活性,而在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期關(guān)鍵酶前體物質(zhì)充足,受到誘導(dǎo)子的刺激導(dǎo)致關(guān)鍵酶活性增強(qiáng),次生代謝產(chǎn)物含量增多。對(duì)于不同的誘導(dǎo)時(shí)間,在12~48 h內(nèi)誘導(dǎo)子具有明顯的促進(jìn)效應(yīng),說明在發(fā)酵初期誘導(dǎo)子的作用效果較明顯。但是隨著誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)時(shí)間推移,糠醛產(chǎn)量降低,誘導(dǎo)子的作用效果不顯著。而在64 h后出現(xiàn)空白對(duì)照的含量高于樣品組,可能是由于前期發(fā)酵大量消耗了培養(yǎng)基中的成分,導(dǎo)致添加誘導(dǎo)子的樣品后期次生代謝產(chǎn)物較空白組少。
響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化發(fā)酵條件具有優(yōu)化速度快,預(yù)測(cè)結(jié)果偏差小等優(yōu)點(diǎn)[37]。目前,已有報(bào)道將響應(yīng)面優(yōu)化法應(yīng)用于發(fā)酵條件的優(yōu)化以及誘導(dǎo)子篩選等方面。如彭秋菊等[31]用響應(yīng)面優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)糠醛的培養(yǎng)基條件較優(yōu)化前糠醛產(chǎn)量提高了20.2%;魏寶東等[33]利用響應(yīng)面法優(yōu)化促進(jìn)納他霉素合成的誘導(dǎo)子誘導(dǎo)條件,經(jīng)優(yōu)化后納他霉素產(chǎn)量提高了1.68倍。以上試驗(yàn)說明響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)于發(fā)酵具有較好的優(yōu)化效果。本試驗(yàn)利用經(jīng)單因素試驗(yàn)確定了誘導(dǎo)子的種類、誘導(dǎo)子添加時(shí)間、誘導(dǎo)量及誘導(dǎo)時(shí)間的范圍后,利用Box-Behnken試驗(yàn)并結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化篩選出黑曲霉產(chǎn)糠醛最佳條件為:糠醛的添加時(shí)間為0 d、添加量0.675%,誘導(dǎo)時(shí)間8.6 h。在此條件下培養(yǎng)黑曲霉發(fā)酵液中糠醛含量為50.49 μg/mL,較空白對(duì)照(36.84 μg/mL)提高了37%;5-HMF的含量為41.12 μg/mL,較空白對(duì)照(32.08 μg/mL)提高了31%。(責(zé)任編輯:段麗麗)
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Screening and Optimization of Elicitors for Furfural and 5-Hydroxymethyl Furfural Production by Aspergillus niger
Ding Xuan,Liu Jianrui,Yang Qingqing,Ran Li,Zheng Yaopei,Tian Yu,Wei Yongqin,Liu Weifang,Li Zhu*
(College of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang,Guizhou 550025,China)
Abstract:In this study,ten biological elicitors and six abiotic elicitors were used to increase the contents of furfural and 5-hydroxymethyl furfural (5-HMF) in the fermentation broth of Aspergillus niger xj.Firstly,elicitors and inducible conditions were screened by single factor,box-Behnken test was designed,and then response surface method was used to optimize the best inducible conditions.The results showed that:the seed liquid of A.niger xj and the elicitor were added into the fermentation medium,0.675% of staphylococcus aureus metabolite elicitor with a reducing sugar concentration of 10 μg/mL was added and induced for 8.6 h.The furfural yield in the fermentation liquid was 50.49 μg/mL,which was 37% higher than that before optimization.Under these conditions,the yield of 5-HMF in fermentation broth was 41.12 μg/mL,an increase of 31%.The results can provide reference for furfural and 5-HMF production by Aspergillus niger fermentation.
Keywords:furfural;5-hydorxymethyl furfural;Aspergillus niger;elicitor;response surface optimization