徐鎮(zhèn)錢,趙嗣鈺

徐鎮(zhèn)錢,臺(tái)州市腫瘤醫(yī)院腫瘤放療科 浙江省臺(tái)州市 317502

趙嗣鈺,臺(tái)州市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 浙江省臺(tái)州市 317502

0 引言

結(jié)腸癌(colon cancer,CC)是臨床常見惡性腫瘤,近年來(lái)我國(guó)CC患病率呈逐漸升高趨勢(shì),嚴(yán)重威脅人們生命健康,加強(qiáng)防治非常重要.臨床上越來(lái)越多的研究關(guān)注分子改變對(duì)CC的影響,有研究指出微小RNA在CC的發(fā)生發(fā)展中具有重要調(diào)控作用.微小RNA-151a-3p(microRNA-151a,miR-151a)基因定位于染色體8q24.3,包括miR-151a-3p和miR-151a-5p兩條成熟序列.國(guó)外有學(xué)者于胰腺癌組織中發(fā)現(xiàn)微小RNA-151a-3p(microRNA-151a-3p,miR-151a-3p)明顯高表達(dá).國(guó)內(nèi)相關(guān)研究在前列腺癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)miR-151a-3p表達(dá)發(fā)生明顯異常.但miR-151a-3p在CC中的表達(dá)情況如何,目前尚無(wú)研究報(bào)道.此外,研究指出Notch信號(hào)通路是一種進(jìn)化上保守的細(xì)胞信號(hào)通路,它對(duì)癌癥發(fā)生、癌癥干細(xì)胞生物學(xué)和腫瘤血管生成產(chǎn)生影響,其中Notch2表達(dá)與結(jié)直腸癌密切相關(guān),抑制Notch2表達(dá)可能在腫瘤抑制中發(fā)揮作用.基于此,本研究嘗試探討miR-151a-3p及Notch2在CC中的表達(dá)情況及臨床意義.報(bào)告如下.

1 材料和方法

1.1 材料 收集2018-01/2020-06我院92例CC患者作為研究對(duì)象,均取術(shù)中切除的癌組織與癌旁組織(距癌邊緣＞2.0 cm,且病理結(jié)果顯示無(wú)癌細(xì)胞)標(biāo)本.所有患者均經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)檢查確診為結(jié)腸癌.其中男53例,女39例;年齡47-78歲,平均(58.79±5.89)歲.收集所有患者臨床病理參數(shù),腫瘤直徑:≤5 cm 37例,＞5 cm 55例;腫瘤部位:左半結(jié)腸49例,右半結(jié)腸43例;病理類型:腺癌62例,其他30例;腫瘤分期:Ⅰ-Ⅱ期40例,Ⅲ-Ⅳ期52例;浸潤(rùn)深度:T1-T2 43例,T3-T4 49例;分化程度:中高分化51例,低分化41例;52例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移.所有患者均參照《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017年版)》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)診斷為CC,并經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)診斷確診,均為首次確診,且術(shù)前均未接受放、化療等抗腫瘤治療.本研究獲得本院醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)開展,且在獲取標(biāo)本前均患者均知情同意并簽署同意書.手術(shù)外科切除過(guò)程必須在30 min內(nèi)收集相對(duì)應(yīng)的標(biāo)本,并迅速置于液氮凍存?zhèn)溆?

1.2 方法 RNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific公司;BX51光學(xué)顯微鏡購(gòu)自于日本奧林巴斯公司;ABI 7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司;miR-151a-3p引物購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;內(nèi)參U6購(gòu)自美國(guó)Invitrogen;Notch2一抗、二抗均購(gòu)自德國(guó)CST公司.

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)組織標(biāo)本中miR-151a-3p的表達(dá) 采用組織研磨法提取組織中總RNA,在無(wú)酶的操作條件下加入焦炭酸二乙酯,測(cè)量RNA濃度后,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后采用熒光定量PCR試劑盒,按照說(shuō)明書要求進(jìn)行qRT-PCR.反應(yīng)體系:總RNA 2 μL,2×One Step RT-PCR BufferⅢ 12.5 μL,TaKaRa Ex Taq HS(5 U/μL)0.5 μL,Prime Script RT enzyme MixⅡ0.5 μL,上下游引物各0.5 μL.miR-151a-3p上游引物5'-AGGAGCTCACAGTCTAGTATGTCT-3',下游引物5'-CTACTGGCCTGGAGGGTTTGG-3'.反應(yīng)條件:反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),42 ℃,5min、95 ℃ 10 s,95 ℃5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán).以U6為內(nèi)參檢測(cè),應(yīng)用公式2計(jì)算miR-151a-3p相對(duì)表達(dá)水平.

1.4 Western blot法檢測(cè)組織標(biāo)本中Notch2蛋白的表達(dá)

組織標(biāo)本中加入細(xì)胞裂解液,提取總蛋白,采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度,將50 μg蛋白在SDS-PAGE凝膠上電泳并分離,將分離后的蛋白分子轉(zhuǎn)至PVDF膜上,于低速搖床上用含脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h.加入Notch2一抗(1:1000),4 ℃過(guò)夜孵育.加入Notch2二抗(1:3000)孵育2 h.用ECL發(fā)光液在顯影儀中進(jìn)行目的蛋白顯影并保存圖片.分析條帶灰度,以目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值表示Notch2蛋白相對(duì)表達(dá)量.

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0軟件,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)描述,采用檢驗(yàn).計(jì)量資料采取Bartlett方差齊性檢驗(yàn)與Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn),均確認(rèn)具備方差齊性且服從正態(tài)分布,以mean±SD描述,采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn).癌組織中miR-151a-3p與Notch2蛋白表達(dá)量的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析.miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量與CC臨床病理特征的關(guān)系用檢驗(yàn).＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 癌組織、癌旁組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量比較 癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量均顯著高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.001),見表1.Notch2蛋白電泳圖,見圖1.

圖1 Notch2蛋白電泳圖.A:癌組織中Notch2蛋白表達(dá)情況;B:癌旁組織中Notch2蛋白表達(dá)情況.

表1 癌組織、癌旁組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量比較(mean±SD)

2.2 癌組織中miR-151a-3p與Notch2蛋白表達(dá)量的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示,CC癌組織中miR-151a-3p表達(dá)量與Notch2蛋白表達(dá)量間存在正相關(guān)關(guān)系(=0.592,＜0.05),見圖2.

圖2 miR-151a-3p與Notch2蛋白表達(dá)量的相關(guān)性.

2.3 患者臨床特征與癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量的關(guān)系 不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、病理類型CC患者癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;腫瘤分期、浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不同CC患者癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05),見表2.經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示,CC患者癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量與腫瘤分期(=0.752、0.539)、浸潤(rùn)深度(=0.592、0.391)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(=0.791、0.563)間存在正相關(guān)關(guān)系,與分化程度(=-0.680、-0.463)間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(均＜0.05).

表2 不同臨床特征患者癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量比較(mean±SD)

3 討論

CC是一種發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜的惡性腫瘤,已知有多種致瘤途徑均可導(dǎo)致CC的發(fā)生發(fā)展.腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為是CC致死的主要原因,但其機(jī)制仍未明確,而從分子水平研究CC惡性生物學(xué)行為的影響因素意義深遠(yuǎn).

微小RNA是一類長(zhǎng)21-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA,其表達(dá)變化不僅能調(diào)節(jié)基因沉默和癌癥惡化過(guò)程,同時(shí)能影響細(xì)胞功能,如惡性轉(zhuǎn)化、血管生成、細(xì)胞生長(zhǎng)、炎癥反應(yīng)等.其中miR-151a-3p是一種多功能微小RNA,能調(diào)控骨質(zhì)疏松、狼瘡性腎炎的發(fā)生發(fā)展,且與急性腦梗死患者的炎性因子聯(lián)系緊密.Liu等開展的一項(xiàng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),miR-151a-3p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲具有促進(jìn)作用,下調(diào)其蛋白表達(dá)可抑制腫瘤進(jìn)展.湯杰等研究也證實(shí),在胰腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的miR-151a-3p能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,且能抑制細(xì)胞凋亡.推測(cè)miR-151a-3p可能是一種促癌基因,但目前miR-151a-3p在結(jié)腸癌的表達(dá)及其作用尚未見報(bào)道.本研究在CC癌組織中同樣發(fā)現(xiàn)miR-151a-3p表達(dá)量顯著升高,提示miR-151a-3p表達(dá)水平升高可能促進(jìn)CC的發(fā)生.但其具體作用機(jī)制尚未明確.

文獻(xiàn)報(bào)道顯示,Notch信號(hào)通路被認(rèn)為在多種癌癥中發(fā)揮作用,是調(diào)節(jié)正常腸黏膜的細(xì)胞譜系分化的必要條件,Notch受體中Notch2具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用,且能降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性.目前,Notch2在CC發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制逐漸被發(fā)現(xiàn),Lin等報(bào)道指出,Notch2抑制了GATA3介導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞中IL-4的分泌,并最終抑制了M2樣TAM極化.王艷良等研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)抑制Notch2表達(dá),可降低CC SW480細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力.上述研究均表明Notch2可能是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要因子.本研究結(jié)果顯示,CC患者癌組織中Notch2蛋白表達(dá)量顯著高于癌旁組織,說(shuō)明Notch2蛋白表達(dá)可能促進(jìn)CC的發(fā)生.此外,本研究通過(guò)相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)CC患者癌組織中miR-151a-3p表達(dá)量與Notch2蛋白表達(dá)量間存在正相關(guān)關(guān)系,提示miR-151a-3p可能通過(guò)正向調(diào)控Notch2蛋白參與CC的發(fā)生過(guò)程.

為進(jìn)一步探究miR-151a-3p、Notch2在CC進(jìn)展中的作用機(jī)制,本研究對(duì)比分析了不同臨床特征CC患者癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示,CC患者腫瘤分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量呈正相關(guān),分化程度與癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān),提示miR-151a-3p、Notch2表達(dá)增高可能是結(jié)腸癌組織發(fā)生轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)的重要因子.因此,我們推測(cè)通過(guò)抑制miR-151a-3p、Notch2的表達(dá)可對(duì)CC惡性生物學(xué)行為進(jìn)行抑制,將來(lái)可能成為CC防治的新途徑.但由于本研究屬于初步研究,未進(jìn)行相關(guān)的細(xì)胞學(xué)研究觀察,在下一步的研究中我們將開展相關(guān)研究進(jìn)行探討.

4 結(jié)論

綜上可知,CC癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白的表達(dá)升高,且二者在CC癌組織中的表達(dá)量呈正相關(guān),miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量的升高可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系,可為CC的發(fā)病機(jī)制及臨床診斷提供參考依據(jù).但本研究屬于單中心研究,存在樣本量較少的不足,研究結(jié)果可能存在一定誤差,仍需通過(guò)大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證.

據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年約有100萬(wàn)人被診斷為結(jié)腸癌,探究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制,尋找新的診斷指標(biāo)及治療方法是其治療關(guān)鍵.RNA在其發(fā)生發(fā)展中具有重要調(diào)控作用,Notch2表達(dá)與結(jié)直腸癌密切相關(guān),抑制其表達(dá)可能在腫瘤抑制中發(fā)揮作用.

本研究嘗試探討miR-151a-3p及Notch2在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況及臨床意義,為探討結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制提供參考依據(jù).

本研究探究微小RNA-151a-3p及Notch2在結(jié)腸癌的表達(dá)情況及臨床意義,找出RNA-151a-3p及Notch2與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系.

選取2018-01/2020-06我院92例結(jié)腸癌患者作為研究對(duì)象,均取術(shù)中切除的癌組織與癌旁組織(距癌邊緣＞2.0 cm,且病理結(jié)果顯示無(wú)癌細(xì)胞)標(biāo)本,檢測(cè)比較癌組織與癌旁組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量,分析癌組織中miR-151a-3p與Notch2蛋白表達(dá)量的相關(guān)性,并比較不同臨床特征(性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、病理類型、腫瘤分期、浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)患者癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量,分析miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量與結(jié)腸癌臨床特征的關(guān)系.

結(jié)腸癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量均高于癌旁組織(＜0.001);癌組織中miR-151a-3p表達(dá)量與Notch2蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)(＜0.001);隨著結(jié)腸癌患者腫瘤分期和浸潤(rùn)深度增加、分化程度降低、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量逐漸升高(＜0.05);癌組織中miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量與結(jié)腸癌患者腫瘤分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),與分化程度呈負(fù)相關(guān)(＜0.05).

miR-151a-3p、Notch2蛋白在結(jié)腸癌癌組織中表達(dá)明顯增加,且二者之間的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系,其過(guò)表達(dá)可參與了結(jié)腸癌疾病的發(fā)生發(fā)展.

miR-151a-3p、Notch2在結(jié)腸癌癌組織中的表達(dá)量呈正相關(guān),miR-151a-3p、Notch2蛋白表達(dá)量的升高可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系,可為結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制及臨床診斷提供參考依據(jù),但本研究屬于單中心研究,存在樣本量較少的不足,研究結(jié)果可能存在一定誤差,仍需通過(guò)大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證.