楊 益,朱麗芳,曾慶亮

楊益,曾慶亮,海警醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 浙江省嘉興市 314000

朱麗芳,海警醫(yī)院檢驗科 浙江省嘉興市 314000

0 引言

流行病學調(diào)查顯示,我國結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)發(fā)病率在多種惡性腫瘤中占第3位,死亡率占第5位,且近年來呈逐漸升高趨勢,同時也是風險增加最快的疾病之一.臨床多采用全直腸系膜切除(total mesorectal excision,TME)治療,CRC患者5年生存率具有明顯改觀,但每年仍有部分患者發(fā)生腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移,臨床應(yīng)積極發(fā)掘與其相關(guān)的腫瘤分子標志物,預(yù)測預(yù)后發(fā)展.國外相關(guān)研究表明,富含脯氨酸蛋白11(prolinerich protein 11,)是腫瘤相關(guān)基因,在肝癌組織中表達高于癌旁組織,與腫瘤TNM分期有關(guān),且表達較高患者總生存時間較短,沉默PRR11能明顯抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲,可見與肝癌惡性生物學行為、預(yù)后有關(guān).而Hu等研究表明,高遷移率族蛋白A2(high mobility group AT-hook 2,HMGA2)在胃癌中高表達,能通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)胃癌干細胞的自我更新和致瘤性,而腫瘤干細胞是一類能夠?qū)е履[瘤發(fā)生、復發(fā)的細胞,故推測HMGA2可能與結(jié)直腸癌復發(fā)有關(guān).根據(jù)相關(guān)研究,膜聯(lián)蛋白A10(annexinA10,ANXA10)敲除可誘導N-鈣粘蛋白轉(zhuǎn)換為E-鈣粘蛋白,促進胃癌癌細胞遷移復發(fā).上述三個因子均與腫瘤發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)聯(lián)性,因此可將其作為重要腫瘤分子標志物進行檢測分析.基于此,本研究選取我院收治的CRC患者231例,并首次探討PRR11、HMGA2、ANXA10對結(jié)直腸癌TME術(shù)后早期復發(fā)的預(yù)測效能.現(xiàn)報告如下.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2016-03/2020-03我院收治的231例CRC患者進行前瞻性研究,均符合《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2020年版)》中結(jié)直腸癌診斷標準;均行TME術(shù)治療;術(shù)前未接受過放化療、靶向治療、免疫治療、中醫(yī)藥等抗癌治療;均未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移;術(shù)后石蠟標本保存完好;自愿簽署知情同意書.排除其他部位惡性腫瘤;腫瘤導致穿孔、梗阻等需急診手術(shù)治療;合并嚴重心、肝、腎等重要臟器功能障礙;TME術(shù)禁忌證;導致腹腔粘連的手術(shù)史.本研究獲醫(yī)院倫理委員會審核通過,患者及家屬知情,自愿加入.

1.2 方法

1.2.1 TME手術(shù)方法:根據(jù)患者病情及意愿選擇完全腹腔鏡TME或經(jīng)肛聯(lián)合經(jīng)腹TME手術(shù),并留取新鮮腫瘤組織作為檢測標本.

1.2.2 PRR11、HMGA2、ANXA10 mRNA檢測:采用熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測,提取腫瘤組織及細胞總RNA,并測定其濃度與D(260)/D(280)比值,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,最后采用熒光定量PCR試劑盒(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)進行定量PCR檢測;反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)程序為10 min 95 ℃預(yù)變形-15 s 90 ℃變性-10 s 60 ℃退火-15 s 95 ℃延伸,共計40個循環(huán);最終采用2法計算相對基因表達量.以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參;各基因引物序列如下:(1)PRR11上游引物為5’-GAAGCTGGCTAACATCATCCTG-3’,下游引物為5’-CTCTGGGTTATGCAGTTCTGG-3’;(2)HMGA2上游引物為5’-ACCCAGGGGAAGACCCAAA-3’,下游引物為5’-CCTCTTGGCCGTTTTTCTCCA-3’;(3)ANXA10上游引物為5’GCATCCATTATGGGATT GAAA-3’,下游引物為5’-CAAAATGTTTTGTGGAGAG TAT G T G-3’;(4)內(nèi)參G A P D H上游引物為5’-C A GCCTCAAGATCATCAGCA-3’,下游引物為5’-TGT GGTCATGAGTCCTTCCA-3’.

1.2.3 復發(fā)判定標準:a局部復發(fā):經(jīng)腸鏡檢查重新出現(xiàn)腫瘤原發(fā)灶及結(jié)直腸周圍局部出現(xiàn)病灶;b遠隔轉(zhuǎn)移:肝臟、腹膜等部位發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移;并根據(jù)術(shù)后1年復發(fā)情況分為復發(fā)組、未復發(fā)組.

1.3 觀察指標 (1)分析手術(shù)情況;(2)比較兩組基線資料、、、;(3)比較不同N分期患者、、;(4)比較不同、HMGA2、水平者復發(fā)率;(5)采用多因素Logistic回歸方程分析、、與復發(fā)的相關(guān)性;(6)采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)曲線分析、、對復發(fā)的預(yù)測價值.

采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行分析,計數(shù)資料(%)表示,檢驗;計量資料采用(mean±SD)表示,多組間比較以單因素方差分析,兩兩比較以LSD-檢驗,兩組間比較采用獨立樣本檢驗對比;等級資料采用Ridit分析;采用Logistic進行多因素回歸分析;預(yù)測效能分析采用ROC曲線,獲取曲線下面積(area under the curve,AUC)、置信區(qū)間、敏感度、特異度及Cut-off值,聯(lián)合預(yù)測實施Logistic二元回歸擬合,返回預(yù)測概率logit(P).均采用雙側(cè)檢驗,α=0.05.

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)情況 231例CRC患者,均順利完成TME術(shù),其中完全腹腔鏡TME 71例,經(jīng)肛聯(lián)合經(jīng)腹TME 160例,無中轉(zhuǎn)開腹病例;隨訪1年,失訪1例,獲訪230例患者中,25例(10.87%)復發(fā),復發(fā)類型:局部復發(fā)14例,遠隔轉(zhuǎn)移11例.

2.2 兩組基線資料、、、比較 兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、飲酒史、吸煙史、腫瘤直徑、病理類型、T分期、合并疾病、手術(shù)方式、術(shù)后輔助治療、是否保肛比較,差異無統(tǒng)計學意義;復發(fā)組N分期、手術(shù)切緣、淋巴結(jié)清掃數(shù)目、、、與未復發(fā)組比較,差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05).見表1.

表1 兩組基線資料、PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA比較

2.3 不同N分期患者、、比較、N0＜N1＜N2,ANXA10 mRNA:N0＞N1＞N2,兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05).見表2.

表2 不同N分期患者PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA比較(mean±SD)

2.4 不同、、水平者復發(fā)率比較 以復發(fā)組和未復發(fā)組各指標均值為分界(兩組、、均值分別為1.28、1.43、1.10),將患者分為低表達與高表達.不同、、水平者復發(fā)率比較,差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05).見表3.

表3 不同PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA水平者復發(fā)率比較n(%)

2.5 多因素分析 以復發(fā)情況作為因變量(0=未復發(fā),1 =復發(fā)),納入N分期、手術(shù)切緣、淋巴結(jié)清掃數(shù)目、、、作為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,將N分期、手術(shù)切緣、淋巴結(jié)清掃數(shù)目控制后,、、仍與術(shù)后復發(fā)相關(guān)(＜0.05).見表4.

表4 術(shù)后復發(fā)的多因素Logistic回歸方程分析

2.6、、預(yù)測復發(fā)的ROC 以復發(fā)組為陽性樣本,以未復發(fā)組為陰性樣本,繪制各指標預(yù)測復發(fā)的ROC曲線,結(jié)果顯示,、、預(yù)測復發(fā)的AUC依次為0.798、0.768、0.832(＜0.05);將、、原始數(shù)據(jù)隨機劃分為訓練集(60%)、驗證集(20%)、測試集(20%),利用訓練集訓練出模型,利用驗證集驗證模型,不斷調(diào)整模型選出最好的模型,記錄最佳模型的各項選擇;再利用訓練集+驗證集數(shù)據(jù)訓練出一個新模型作為最終模型,同時利用測試集評估最終模型,將返回Logit(P)作為獨立檢驗變量,得到、聯(lián)合的ROC曲線,結(jié)果顯示各指標聯(lián)合預(yù)測復發(fā)的AUC為0.942(＜0.05).見圖1、表5.

圖1 PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA 預(yù)測復發(fā)的ROC. ROC:受試者工作特征曲線.

表5 ROC分析結(jié)果

3 討論

CRC發(fā)病機制復雜,多數(shù)學者認為腫瘤發(fā)生的重要原因是癌癥防御機制的失活、致癌途徑的激活,而TME術(shù)后早期復發(fā)轉(zhuǎn)移往往是導致治療失敗與死亡的重要原因.臨床通過探索新型基因功能與CRC發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移復發(fā)的關(guān)系,對揭示其具體分子機制、設(shè)計合理的靶向藥物及預(yù)后判斷具有重要意義.

隨著目前對CRC發(fā)生發(fā)展過程中分子機制的深入研究,基因方面成為新型檢測手段,通過積極尋找癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的可作為基因治療靶點的調(diào)控基因序列是目前研究熱點內(nèi)容.新型基因PRR11在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,但其分子機制尚不明確,目前已證實在食管癌、宮頸癌肺癌、肺癌等多種腫瘤疾病均高表達.而HMGA2在細胞分化增殖方面具有顯著表現(xiàn),與腫瘤產(chǎn)生、組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等過程具有密切關(guān)聯(lián)性.基于此,本研究采用PCR法對TME術(shù)后采集的新鮮腫瘤組織標本中、基因表達水平進行檢測分析,結(jié)果顯示復發(fā)組、高于未復發(fā)組,二者水平與復發(fā)情況的發(fā)生顯著相關(guān).細胞周期的調(diào)控紊亂在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,其中PRR11可作用于細胞周期的S期,促進癌細胞由S期向G/M期轉(zhuǎn)換,導致細胞異常增殖,參與調(diào)控CRC的發(fā)生發(fā)展,且與其侵襲轉(zhuǎn)移息息相關(guān).李慧娟等學者研究表明,敲減PRR11會阻滯細胞周期于S期,導致癌細胞增殖減緩,抑制細胞成瘤的再次發(fā)生,間接證明本研究結(jié)果可靠性.而HMGA2能通過蛋白-DNA或蛋白-蛋白作用方式改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu),引發(fā)DNA發(fā)生劇烈變性,從而發(fā)揮促進或抑制下游基因表達的作用;或者可通過結(jié)合其他轉(zhuǎn)錄因子間接調(diào)節(jié)下游基因表達,促進CRC腫瘤細胞的增殖分化,可能會加速TME術(shù)后早期復發(fā)的發(fā)生.同時,本研究還進行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示上述2個因子均為復發(fā)的重要影響因素,其水平升高會增加復發(fā)風險2倍左右,表明PRR11、HMGA2均為影響CRC患者TME術(shù)后復發(fā)的獨立因子.但PRR11作用是通過作用于Wnt蛋白還是與破壞性復合物結(jié)合等具體分子機制,仍需后續(xù)相關(guān)研究進一步探索分析;而HMGA2雖能激活Wnt信號通路促進CRC增殖過程,但具體調(diào)控機制仍有待研究.

已有相關(guān)研究證實,膜聯(lián)蛋白家族成員ANXA6在宮頸癌、ANXA7在胃癌進展中均具有一定影響;而ANXA10作為定位于常染色體4q33上的另一膜聯(lián)蛋白家族成員,其生物學功能仍有待發(fā)掘.對本研究中CRC患者的ANXA10基因表達情況進行分析,結(jié)果顯示復發(fā)患者ANXA10 mRNA水平低于未復發(fā)患者,低表達ANXA10患者其復發(fā)率明顯升高,表明ANXA10表達下調(diào)可能是導致CRC轉(zhuǎn)移復發(fā)的重要機制之一.馬鵬程等學者研究中CRC組織存在明顯ANXA10表達缺失現(xiàn)象,其水平降低可能會導致腫瘤細胞進展轉(zhuǎn)移的發(fā)生,與本研究結(jié)果具有一致性.提示臨床可將ANXA10作為CRC復發(fā)的獨立危險因素,但目前對下調(diào)其表達的機制及其是以何種機制促進癌癥發(fā)生發(fā)展知之甚少,臨床需更加深入研究.本研究通過繪制ROC曲線進一步探究上述3個因子表達的檢測意義,結(jié)果顯示各指標聯(lián)合可提高對復發(fā)的預(yù)測價值,從而證實PRR11、HMGA2、ANXA10對CRC發(fā)病機制的豐富、潛在基因治療靶點的探尋具有重要意義,為提高癌癥生存率帶來曙光.值得注意的是,本研究兩組手術(shù)方式均衡可比,保證了各指標組間的可比性,但其基礎(chǔ)均為TME術(shù),這種手術(shù)方式術(shù)后PRR11、HMGA2、ANXA10基因表達水平是否與其它手術(shù)方式有區(qū)別尚不明確,仍需后續(xù)研究進行探討.

4 結(jié)論

綜上所述,CRC患者PRR11、HMGA2、ANXA10表達與TME術(shù)后早期復發(fā)明顯密切相關(guān),對預(yù)后生存情況具有一定指導意義,有望成為CRC未來靶向治療的潛在靶點.

近年來我國結(jié)直腸癌發(fā)病率在惡性腫瘤中占第3位,死亡率占第5位.臨床多采用全直腸系膜切除治療,結(jié)直腸癌患者5年生存率具有明顯改觀,但每年仍有部分患者發(fā)生腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移,其具體原因尚未完全明確.

找出、、等基因表達是否結(jié)直腸癌患者全直腸系膜切除術(shù)后復發(fā)存在相關(guān),為改善患者預(yù)后提供參考依據(jù)和研究方向.

探討、、對結(jié)直腸癌全直腸系膜切除術(shù)后早期復發(fā)的預(yù)測效能,找出其與全直腸系膜切除術(shù)早期復發(fā)之間的關(guān)系.

選取2016-03/2020-03我院收治的231例結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)患者進行前瞻性研究,均行TME治療,根據(jù)術(shù)后1年復發(fā)情況分為復發(fā)組、未復發(fā)組.比較兩組基線資料、PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA,并比較不同PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA水平者復發(fā)率,采用多因素Logistic回歸方程分析術(shù)后復發(fā)的相關(guān)影響因素,采用受試者工作特征曲線及曲線下面積分析各指標預(yù)測術(shù)后復發(fā)的效能.

復發(fā)組N分期、手術(shù)切緣、淋巴結(jié)清掃數(shù)目、PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA與未復發(fā)組比較,差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05);PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA:N0＜N1＜N2,ANXA10 mRNA:N0＞N1＞N2,兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05);不同PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA水平者復發(fā)率比較,差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05);PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA與術(shù)后復發(fā)相關(guān)(＜0.05);各指標聯(lián)合預(yù)測復發(fā)的AUC高于單一預(yù)測(＜0.05).

CRC患者PRR11、HMGA2、ANXA10表達與TME術(shù)后早期復發(fā)明顯密切相關(guān),對預(yù)后生存情況具有一定指導意義,可作為分子標志物協(xié)助臨床治療.

通過本研究可以得出PRR11、HMGA2、ANXA10表達對預(yù)后生存情況具有一定指導意義,有望成為CRC未來靶向治療的潛在靶點,但本次研究存在一定局限性,選取例數(shù)較少,且均為我院患者,可能存在一定程度的偏倚,建議開展多中心、大樣本隨機對照試驗加以證實.