龐圓圓,張曉媛,王 磊,袁 昕,路國濤,肖煒明

龐圓圓,張曉媛,路國濤,肖煒明,揚州大學附屬醫(yī)院消化內科 江蘇省揚州市 225000

王磊,揚州大學附屬醫(yī)院病理科 江蘇省揚州市 225000

袁昕,揚州大學附屬醫(yī)院腫瘤科 江蘇省揚州市 225000

0 引言

全球范圍內,結直腸癌是第三位最常見的惡性腫瘤,也是第二位最常見的惡性腫瘤死亡原因.據世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)癌癥研究中心的GLOBOCAN項目估計,2018年全球范圍內結直腸癌新發(fā)病例數約為180萬,死亡人數約為88萬.Bufill依據胚胎起源、生理解剖、內環(huán)境和分子生物學特征等差異提出,應將結腸癌以結腸脾曲為界分為左、右結腸癌這兩種不同的疾病.研究發(fā)現,DNA錯配修復(mismatch repair,MMR)蛋白在DNA復制過程中可以識別和修復錯配的堿基對,從而使DNA聚合酶和DNA連接酶能夠重新合成和重新結合正確的DNA鏈.MMR蛋白表達陰性會導致遺傳不穩(wěn)定性,引起短重復DNA序列長度的改變,從而產生新的等位基因,此現象被稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI).近年來,有不少學者針對MMR蛋白與結直腸癌之間的臨床相關性展開研究,認為MMR蛋白在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展及其預后評估中起重要作用,給臨床醫(yī)生提供了有價值的經驗.結直腸癌是一種組織形態(tài)學、臨床和分子水平的異質性疾病.可能通過以BRAF基因突變和高水平CpG島甲基化表型為特征的“鋸齒狀”途徑進展;或是可能通過微衛(wèi)星不穩(wěn)定性進展,并顯示出腫瘤抑制因子同源異型框轉錄因子(caudal-related homeobox transcription factor 2,CDX-2)的顯著缺失.CDX-2是具有較高敏感性的腸上皮特異標志物,CDX-2表達下調與結腸癌分化不良和MMR缺陷相關.此外p53通過協調一系列廣泛的DNA損傷修復機制來維持基因組穩(wěn)定,且MMR系統的MSH2、MLH1是p53介導的腫瘤抑制的關鍵組成部分,因此本文就錯配修復蛋白及CDX-2、p53在結直腸腺癌中的表達及對臨床病理特征影響展開討論.

1 材料和方法

1.1 材料 收集2017-01/2021-03揚州大學附屬醫(yī)院收治的175例結直腸腺癌患者的臨床資料.

入組標準:經腸鏡活檢或術后病理明確診斷為原發(fā)性結直腸腺癌.取材前或術前均未接受過放、化療或靶向治療,且臨床及病理資料完整.

排除標準:排除既往有其他腫瘤病史;排除術前接受過放、化療或靶向治療的患者;排除合并特殊藥物使用致可能對結果有影響的患者;排除由于各種原因不能耐受手術或未在本院行手術治療的患者;其中男性113例,女性62例;年齡≤50歲16例,＞50歲159例;高/中分化153例,低分化22例;腫瘤病灶侵犯黏膜下層或固有肌層47例;穿透固有肌層128例;不伴淋巴結轉移110例,伴淋巴結轉移65例;左半結腸癌65例,右半結腸癌47例,直腸癌63例.所有患者均簽署知情同意書,該項目已通過揚州大學附屬醫(yī)院倫理委員會審查,意見號為:2021-YKL4-28-008.

1.2 方法

1.2.1 免疫組化:所有患者病理組織均經本院病理科行免疫組織化學法檢測,結腸癌組織塊行固定、脫水、石蠟包埋連續(xù)切片,厚度約3 μm-5 μm,經脫蠟復水、滅活內源性酶、抗原修復、封閉后,采用二步法染色檢測MLH1、MSH2、MSH6、PMS2及CDX-2、p53蛋白表達,在進行陰性對照時改用PBS代替一抗.將DAB顯色后的玻片用清水沖洗后,使用蘇木素溶液進行細胞核復染.脫水封片(圖1).

圖1 MLH1、PMS2、CDX-2、p53蛋白在結直腸惡性腫瘤中的表達(免疫組化染色). A:MLH1(+);B:MLH1(-);C:PMS2(+);D:PMS2(-);E:CDX-2(+);F:CDX-2(-);G:p53(+);H:p53(-).

錯配修復蛋白MSH2、MSH6、MLH1和PMS2表達于腫瘤細胞、正常結直腸粘膜細胞、間質細胞及炎癥細胞,呈細胞核棕黃色顆粒.腫瘤細胞核呈棕黃色表達判讀為陽性,即判定為MMR蛋白表達正常,定義為錯配修復基因完整(pMMR組);任意一項或多項不著色判讀為陰性,即判定為MMR蛋白表達陰性,定義為錯配修復基因表達陰性(dMMR組).判定過程由2名高年資病理科醫(yī)師雙盲法獨立進行.隨機選取5個400倍視野計算每100個細胞中表達呈陽性的細胞數,取其平均值作為檢測數值,按陽性細胞比例數分為:(-),≤10%;(+),11%-25%;(++),25%-50%;(+++),≥50%;有異議的病例,提交1名上級醫(yī)師重新判讀.

病理分期按第8版AJCC分期標準進行病理分期.統計并比較2組患者CDX-2、p53表達差異及年齡、性別、組織分化程度、浸潤深度、有無淋巴結轉移、腫瘤位置等臨床病理特征差異.

采用SPSS 25軟件進行統計學分析.MMR、CDX-2、p53表達與結直腸腺癌臨床病理特征的差異進行檢驗、校正檢驗或Fisher精確檢驗.以＜0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 結直腸癌中MMR蛋白的表達 根據免疫組化分析結果,175例結直腸腺癌患者中pMMR組136例,dMMR組39例,表達陰性率達22.3%,其中MSH2、MSH6、MLH1、PMS2的表達陰性者分別為12例(6.9%)、1例(0.6%)、17例(9.7%)、28例(16.0%).

2.2 MMR蛋白表達與結直腸腺癌臨床病理特征的關系

本文共分析175例結直腸腺癌中MMR蛋白表達與臨床病理特征的關系,MMR蛋白表達陰性與結直腸癌患者發(fā)病年齡、腫瘤位置及分化程度差異有顯著性(＜0.05,表1),在患者性別、浸潤深度及淋巴結轉移方面差異均無顯著性(＞0.05,表1).

表1 MMR表達與結直腸腺癌臨床病理特征的關系

2.3 不同MMR-CDX-2蛋白狀態(tài)與結直腸腺癌臨床病理特征的關系 本文共分析91例結直腸腺癌中MMRCDX-2蛋白狀態(tài)與臨床病理特征的關系,CDX-2表達陰性共34例(35.1%),CDX-2表達陰性病例中MMR表達陰性率(8.82%)高于CDX-2表達病例中MMR表達陰性率(6.35%),經統計學分析MMR表達與CDX-2表達無相關性(＞0.05,表2).

表2 MMR與CDX-2、p53的相關性

dMMR-CDX-2(+)蛋白組和dMMR-CDX-2(-)蛋白組相比,兩者在患者性別、發(fā)病年齡、腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結轉移及腫瘤部位方面差異均無顯著性(＞0.05,表3).pMMR-CDX-2(+)蛋白組和pMMR-CDX-2(-)蛋白組相比,兩者在患者性別、發(fā)病年齡、腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結轉移及腫瘤部位方面差異均無顯著性(＞0.05,表3).

表3 MMR及CDX-2表達與結直腸腺癌臨床病理特征的相關性

2.4 不同MMR-p53蛋白狀態(tài)與結直腸腺癌臨床病理特征的關系 本文共分析28例結直腸腺癌中MMR-p53蛋白狀態(tài)與臨床病理特征的關系,p53表達陰性共7例(25%),p53表達陰性病例中MMR表達陰性率(42.9%)高于p53表達病例中MMR表達陰性率(23.8%),經統計學分析MMR表達與p53表達無相關性(＞0.05,表2).dMMR-p53(+)蛋白組和dMMR-p53(-)蛋白組相比,兩者在患者性別、發(fā)病年齡、腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結轉移及腫瘤部位方面差異均無顯著性(＞0.05,表4).pMMR-p53(+)蛋白組和pMMR-p53(-)蛋白組相比,兩者在患者性別、發(fā)病年齡、腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結轉移及腫瘤部位方面差異均無顯著性(＞0.05,表4).

表4 MMR及p53表達與結直腸腺癌臨床病理特征的相關性

3 討論

結腸癌的發(fā)生主要有兩條途徑:染色體不穩(wěn)定(chromosomal instability,CIN)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI),MSI是錯配修復(mismatch repair,MMR)缺陷的重要標志,MMR系統對于糾正DNA復制過程中的DNA序列錯配起著至關重要的作用.這個修復系統主要由四種蛋白質(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)相互作用來檢測錯配并將其剪除,從而使DNA聚合酶和DNA連接酶能夠重新合成和重新結合正確的DNA鏈.其中PMS2和MSH6分別與MLH1和MSH2相互作用,形成異源二聚體.MMR蛋白其表達與其主要配對(即MLH1和MSH2)的結合密切相關.MSH2的表達陰性常常與MSH6的表達陰性相關,這種模式高度提示MSH2胚系突變.同樣,MLH1的表達陰性通常與PMS2的表達陰性相關,這種模式可能是MLH1胚系突變或MLH1基因啟動子的獲得性高甲基化所致.MSH6和PMS2的胚系突變通常分別與單獨的MSH6和PMS2蛋白表達陰性有關.結合國內外關于MMR蛋白與結直腸癌相關性分析的文獻,亞洲國家報道的MMR蛋白表達陰性率約為5.6%-19.24%,而本文涉及的腫瘤患者表達陰性率達22.3%,基本符合,由于各研究中MMR蛋白表達陰性率差異較大,推斷MMR蛋白表達陰性具有種族和地域差異性.在多項涉及中國結直腸癌患者的研究中,MMR蛋白表達陰性率達6.7%-7.6%,主要表現為MLH1、PMS2雙表達陰性,認為MMR蛋白表達陰性在結直腸癌患者發(fā)病年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化類型、淋巴結轉移、臨床分期均有顯著性差異,而與患者性別方面無關.提出MMR蛋白表達陰性在50歲以下、右半結腸、低分化腺癌、TNM分期Ⅰ＋Ⅱ期的患者中有相對更高的發(fā)病率.而也有作者認為結直腸癌MMR蛋白表達陰性與腫瘤位置、分化類型及組織學類型有關,而與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期無關.本研究中MMR蛋白表達陰性共39例(22.3%),其中MSH2、MSH6、MLH1、PMS2的表達陰性分別為12例(6.9%)、1例(0.6%)、17例(9.7%)、28例(16.0%).通過統計學分析得出,MMR蛋白表達陰性與結直腸癌患者發(fā)病年齡、腫瘤部位及分化程度差異有顯著性(＜0.05),好發(fā)于年齡≤50歲、右半結腸、低分化腫瘤患者,而與患者性別、浸潤深度及淋巴結轉移無關.本文結論與以上研究結論相一致.

CDX-2是腸特異性的核轉錄因子,在小腸及結直腸上皮的發(fā)育中起著關鍵作用,CDX-2的表達幾乎完全局限于胃腸道,它在日常診斷程序中被用作識別腸源性腫瘤的標志物.CDX-2表達降低與癌細胞的遷移和侵襲增加有關,并可能通過破壞WNT通路信號在上皮間質轉化中發(fā)揮作用.結直腸癌患者中,CDX-2表達與微衛(wèi)星穩(wěn)定性(microsatellite stable,MSS)患者的預后有一定的相關性,主要表現為CDX-2表達陰性患者預后不佳,而MSI-CDX-2表達陰性的患者發(fā)生遠處轉移的風險較低.CDX-2表達陰性可能只在MSS結直腸癌患者亞組中是一個較差的預后因素.此前多項研究認為CDX-2表達陰性與腫瘤大小、位置、分化程度、浸潤深度和淋巴浸潤及神經侵襲相關;提出CDX-2表達陰性患者在較大的原發(fā)灶、右半結腸、高分化、較深的浸潤深度的患者中有相對更高的發(fā)病率,轉移灶中的CDX-2表達陰性與dMMR顯著相關.MMR表達陰性與CDX-2在腫瘤中的表達降低顯著相關;且CDX-2表達陰性與生存率惡化相關,CDX-2的表達陰性是MMR表達陰性的敏感和特異性預測因子.同時,也有部分研究認為CDX-2表達陰性與臨床病理特征無明顯相關性,PMS2表達陰性與CDX-2表達陰性顯著相關.CDX-2表達陰性存在多種機制:DNA甲基化、雜合性缺失、基因位點擴增和MSI,這些機制都已被報道可調節(jié)CDX2的表達.CDX-2的蛋白低表達可能發(fā)生在無蒂鋸齒狀腺瘤(鋸齒狀通路的前體病變)后和進展為癌癥之前,其基因很少發(fā)生突變,蛋白的低表達伴隨著CDX-2 mRNA的低表達,反映了轉錄水平下調,這可能是CDX-2調節(jié)中最重要的因素.CDX2缺失與MMR缺乏、BRAFV突變和高CIMP表達有顯著且特異的關聯.在多項研究中均有證據表明CDX-2可能在結直腸癌的MSI/鋸齒狀通路中發(fā)揮作用,但該分子是否真的作為該通路內腫瘤進展的原因而非結果參與功能尚未確定.本研究發(fā)現dMMR病例中CDX-2表達陰性率(42.9%)高于pMMR病例中CDX-2表達陰性率(34.4%),通過統計學分析得出,dMMR病例中CDX-2基因突變狀態(tài)與患者各臨床病理特征均無相關性(＞0.05),MMR表達陰性與CDX-2表達陰性無相關性(＞0.05),這一結論與上述研究有所差異,可能由于本組病理組織均采自原發(fā)灶,且不能排除地區(qū)及種族差異性,后續(xù)或可對轉移灶批量行免疫組化染色及統計分析.

p53參與細胞增殖、分化、DNA損傷修復和凋亡的調節(jié),其突變被認為是結直腸腺瘤向癌發(fā)展中相對較晚的事件,作為結直腸癌預后評估指標的作用仍有爭議.MMR在p53抑制腫瘤發(fā)展中起重要的協調作用,且MMR系統的MLH1基因作為p53下游靶基因參與抑制腫瘤的發(fā)展,MLH1的表達陰性或者p53基因的突變均會促進腫瘤的發(fā)展.MLH1是p53介導的腫瘤抑制的關鍵貢獻者,一項涉及淋巴瘤及結直腸癌的研究中作者驗證了p53的丟失不僅會導致MLH1的表達減少,而且會導致DNA修復基因的表達減少,并可能推動腫瘤的發(fā)生.在多項涉及結直腸癌患者的臨床研究中,認為MMR表達陰性與p53基因突變狀態(tài)無相關性,但對于dMMR病例中p53基因突變狀態(tài)與患者各臨床病理特征有無相關性仍存在爭議,同樣,也有研究認為MMR蛋白表達陰性與p53基因突變狀態(tài)有顯著相關性,以上研究皆認同p53表達水平對總生存率和無病生存率沒有預后影響.本研究通過統計學分析得出,dMMR病例中p53基因突變狀態(tài)與患者各臨床病理特征均無相關性(＞0.05),MMR表達陰性與p53基因突變無相關性(＞0.05),這雖與上述研究部分結論一致,但由于本文涉及臨床病例中檢測的局限性,關于p53的數據共計28例,因此得出的結論及臨床意義存在一定的缺陷;考慮到樣本量原因,且CDX-2及p53相關性統計學分析后無意義,故本文未對其做進一步探討,必要時或可進一步擴大樣本量行檢驗分析.

MSI的主要病理特征為粘液成分、腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)和克羅恩樣淋巴細胞反應(Crohn’s-like lymphocytic reaction,CLR),而本文未討論單純型粘液腺癌,是為本文的不足之處,不排除因此對其余統計學結果產生偏倚.

4 結論

綜上所述,MMR蛋白表達與結直腸腺癌患者發(fā)病年齡、腫瘤部位及分化程度有關,而與患者性別、浸潤深度、淋巴結轉移及p53、CDX-2表達無關.檢測MMR蛋白對結直腸腺癌的早期診斷、制定治療方案及評估預后具有重要的臨床意義.

結直腸癌為臨床常見惡性腫瘤,錯配修復蛋白及CDX-2、p53的表達陰性明確與其發(fā)生發(fā)展相關,錯配修復蛋白與CDX-2、錯配修復蛋白與p53間存在相互關系.本文探討三者與結直腸腺癌患者臨床病理特征的相關性,以期對其相互關系做進一步驗證.

隨著結直腸癌患者的增多及年輕化,本研究主題為利用統計學分析結直腸腺癌患者腫瘤原發(fā)灶中錯配修復蛋白及CDX-2、p53及臨床病理特征的相關性,以期驗證三者對何臨床病理特征存在影響.

本研究主要目標為探討結直腸腺癌患者腫瘤原發(fā)灶中錯配修復蛋白及CDX-2、p53的表達與臨床病理特征是否存在相關性,旨在為結直腸癌的臨床治療和預后評價提供一個有效的參考依據.

選取175例揚州大學附屬醫(yī)院收治的結直腸腺癌患者,采用免疫組化方法檢測腫瘤原發(fā)灶中錯配修復蛋白(MLH1、MSH2、PMS2、MSH6)及CDX-2、p53的表達情況,采用檢驗統計分析各組中的分布差異,采用Spearman等級相關統計分析各指標間的相關性.

175例結直腸腺癌患者中四種錯配修復蛋白表達陰性比例為22.3%,其中MLH1、PMS2的表達陰性比例較高,分別為9.7%及16.0%;91例結直腸腺癌中CDX-2表達陰性比例為35.1%,28例結直腸腺癌中p53表達陰性比例為25%.dMMR與結直腸腺癌患者發(fā)病年齡、腫瘤部位及分化程度有顯著性,在患者性別、腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移方面差異均無顯著性.錯配修復蛋白與CDX-2、p53表達水平相關性無顯著性.

錯配修復蛋白的表達與結直腸癌患者的臨床病理特征-發(fā)病年齡、腫瘤部位及分化程度有關.腫瘤原發(fā)灶中錯配修復蛋白的檢測對于結直腸腺癌的早期診斷、風險管理評估及預后評價具有一定的參考意義.

本研究收集的病例數有限,研究結果可能存在一定偏倚,后續(xù)工作中仍需納入更多病例進一步驗證.未來我們將調整樣本量,同時分析腫瘤原發(fā)灶及轉移灶,探究錯配修復蛋白及CDX-2、p53三者間的相關性,并進行進一步機制分析.