何向東 字向東 夏 憶 陳 瑩

(西南民族大學(xué) 動物科學(xué)國家民委重點實驗室，成都 610041)

雌性動物在出生前后，卵巢上形成大量由卵母細胞和周圍包裹一層扁平狀的顆粒細胞前體細胞構(gòu)成的原始卵泡。到初情期以后，這些原始卵泡會分期分批有規(guī)律地發(fā)育依次形成初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡。隨著卵泡的發(fā)育，顆粒細胞不斷增殖，當(dāng)發(fā)育到次級卵泡后開始出現(xiàn)膜細胞的發(fā)育，三級卵泡以后現(xiàn)顆粒細胞之間的分離，形成許多不規(guī)則的腔隙，充滿卵泡液，各個小腔隙逐漸合并形成卵泡腔，進入有腔卵泡發(fā)育階段。隨著卵泡液增多，卵泡腔也逐漸擴大，卵母細胞被擠向一邊，并被包裹在一團顆粒細胞中，該結(jié)構(gòu)即為卵丘卵母細胞復(fù)合體(Cumulus oocyte complexes, COCs)。COCs中卵丘細胞與卵母細胞的互作對卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟起至關(guān)重要的作用。絕大多數(shù)卵泡在不同發(fā)育階段閉鎖，只有極少數(shù)發(fā)育到最后成熟排卵。遺傳、營養(yǎng)和內(nèi)分泌等一系列因素作用于下丘腦-垂體-性腺軸，直接或間接調(diào)節(jié)COCs中一系列基因和蛋白按特定的時空順序表達決定卵泡發(fā)育的命運。

牦牛(

Bos

grunniens

)是分布在海拔2 500～5 000 m 的青藏高原及其毗鄰高山、亞高山地區(qū)的重要牛種。目前，全世界有約1 500余萬頭牦牛，其中，我國的牦牛數(shù)量占世界95%以上。牦牛是我國青藏高原人民賴以生存的生產(chǎn)和生活資料，對高寒低氧的生態(tài)環(huán)境的獨特適應(yīng)能力決定了該畜種在青藏高原畜牧業(yè)中占據(jù)不可替代的特殊地位。但是，牦牛是季節(jié)性繁殖的單胎動物，其繁殖季節(jié)主要集中在每年的7～9月份，繁殖率低(40%～60%)，因此,探明牦牛卵泡發(fā)育調(diào)控機制對提高牦牛繁殖力具有重要意義。自2012 年牦牛全基因組序列測定發(fā)布后，以基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)為代表的“組學(xué)”相關(guān)技術(shù)和方法逐步被應(yīng)用到牦牛科學(xué)上，有關(guān)牦?；蚪M和轉(zhuǎn)錄組研究的成果相繼涌現(xiàn)，并取得了諸多突破性的研究成果。據(jù)報道，牦牛體外成熟卵母細胞與未成熟卵母細胞有4 767個差異表達基因(Differentially expressed genes, DEGs)，凋亡通路、內(nèi)吞通路及代謝通路是上調(diào)的關(guān)鍵調(diào)控通路, 而代謝通路、丙酮酸代謝、黏著斑及氧化磷酸化是下調(diào)的關(guān)鍵調(diào)控通路。母牦牛的卵巢在冷季(非繁殖季節(jié))和暖季(繁殖季節(jié))存在320個DEGs，主要包括

FST

、

CYP1A1

、

PIK3R1

和

PIK3R2

等與雌激素的分泌與代謝信號通路相關(guān)的基因。牦牛的這些基因組和轉(zhuǎn)錄組在卵泡發(fā)育機制的相關(guān)研究主要集中在對整個卵巢或卵母細胞的研究。但是，有關(guān)牦牛COCs發(fā)育轉(zhuǎn)錄組學(xué)尚未見報道，因此，本研究旨在探討牦牛有腔卵泡發(fā)育過程中COCs轉(zhuǎn)錄組變化，為解析牦牛卵泡發(fā)育與成熟調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品收集及RNA提取

2019年11月，在四川省成都市青白江區(qū)屠宰場采集牦牛卵巢，母牦牛均為健康未孕。目前，用于體外受精(

In

vitro

fertilization, IVF)的牦牛與普通牛COCs通常都是在卵巢表面直徑為2～8 mm的卵泡中收集，而在普通牛的研究表明，直徑2～3 mm與6～8 mm的卵泡中獲得的COCs的發(fā)育能力有顯著差異，因此，本研究將直徑2～3 mm、4～5 mm和6～8 mm的牦牛卵泡分別確定為小卵泡、中卵泡和大卵泡。用帶18針頭的注射器從卵泡中分別抽取COCs，每種卵泡中收集20枚COCs，采用Trizol試劑(Invitrogen, 美國)提取總RNA用于構(gòu)建測序文庫。

1.2 RNA-seq 文庫構(gòu)建

RNA的質(zhì)量和含量通過使用NanoDrop 2000分析儀(Thermo,美國)檢測吸光度260 nm/280 nm比值進行測定, 完整性通過Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies,美國)進行檢測。每種卵子取1 μg質(zhì)量合格的RNA混合樣，按NEBNextUItraRNA Library Prep Kit for Illumina(NEB,美國)建庫試劑盒的說明書進行建庫。

主要包括以下步驟：利用Oligo(dT)磁珠富集每種卵子帶有polyA尾的mRNA，加入NEB片段化緩沖液(5×)將mRNA隨機打斷成短片段。以片段化的mRNA為模版，隨機寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成第一鏈cDNA。隨后用DNA polymerase I和RNase H合成第二鏈cDNA。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭后，用AMPure XP beads(Beckman Coulter, 美國)篩選大小在250～300 bp的cDNA片段進行PCR擴增，然后再次使用AaMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，最終獲得雙末端(Paired-end, PE)測序文庫。文庫經(jīng)Qubit 2.0熒光定量儀(Life Technologies，美國)和Agilen1 2100生物分析儀質(zhì)檢合格后在 Illumina cBot 上進行簇的生成，最后用 Illumina HiSeq2500 進行雙末端測序(天津諾禾致源科技有限公司)。

1.3 序列分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)首先用SOAPnuke(https:∥github.com/BGI-flexlab/SOAPnuke, v1.5.2)進行過濾得到clean reads用于后續(xù)分析。采用HiSat軟件(http:∥www.ccb.jhu.edu/software/hisat, v2.0.4)將過濾后的數(shù)據(jù)比對到牦牛參考基因組(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=yak)。用RSEM(http:∥deweylab. biostat.wisc.edu/ RSEM, v1.2.12)計算基因表達水平。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用edgeR(v3.28.0)軟件進行差異表達基因(Differentially expressed genes, DEGs)檢測，以|logFold Change|>1且

P

<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選DEGs。將獲得的DEGs向GO數(shù)據(jù)庫(http:∥www.geneontology.org/)各個條目進行映射，計算其數(shù)目，用Benjamini 法對

P

值進行校正后，Q<0.05的GO條目即為在DEGs中顯著富集的GO條目。通過與KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因與基因組百科全書)數(shù)據(jù)庫(http:∥wego.genomics.org.cn)進行比對，對基因涉及的信號通路或代謝途徑進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量評估及基本數(shù)據(jù)分析

利用Agilent High Sensitivity DNA Kit試劑盒經(jīng)Agilent 2100生物分析儀檢測，構(gòu)建的牦牛小卵泡COCs、中卵泡COCs和大卵泡COCs 3個測序文庫樣本峰圖顯示在1～2 kb片段長度范圍存在明顯的目的產(chǎn)物主峰，有部分1 kb以下小片段產(chǎn)物但比例較小，表明原始樣本完整性較好，判定合格，符合建庫要求。3個樣本Q30百分比分別為 93.70%、93.52%和93.68%，說明測序質(zhì)量和文庫構(gòu)建質(zhì)量高，測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，可滿足后續(xù)分析。對小、中和大卵泡COCs的轉(zhuǎn)錄組測序分析，堿基含量分布圖顯示堿基質(zhì)量穩(wěn)定于30%～40%，堿基質(zhì)量分布圖顯示A-T、C-G含量均大體對應(yīng)重合，說明堿基構(gòu)成穩(wěn)定且平衡。說明本次轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量高，符合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)研究要求。

2.2 測序結(jié)果比對分析

對HiSeq2500測序所得的原始測序序列進行數(shù)據(jù)過濾后，得到小卵泡、中卵泡和大卵泡 3個發(fā)育階段的牦牛COCs干凈數(shù)據(jù)序列數(shù)(Clean reads)為32 905 166～47 542 818條。采用HiSat軟件將獲得的Clean reads與參考基因組進行比對分析。結(jié)果表明，每個階段有94.62%～95.51% Clean reads唯一比對(Unique-mapped)上牦牛參考基因，比對到基因組多個位置的序列比例(Multi-map rate)為2.16%～2.22%，符合要求(表1)。

表1 牦牛卵丘卵母細胞復(fù)合體轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對分析
Table 1 Comparative analysis of transcriptome of yak COCs and mapping to the reference genome

指標(biāo)Index小卵泡COCsSmall COCs中卵泡COCsMedium COCs大卵泡COCsLarge COCs原始序列數(shù) Raw reads47 629 88432 982 61644 094 580干凈數(shù)據(jù)序列數(shù) Clean reads43 998 576 (99.78)32 905 166 (99.78)47 542 818 (99.82)唯一比對到基因組的序列數(shù) Unique-mapped42 023 040(95.51)31 250 036(94.97)44 985 014(94.62)比對到基因組多位點的序列數(shù) Multi-mapped reads1 020 767(2.32)710 752(2.16)1 055 451(2.22)未比對到基因組的序列數(shù) Unmapped reads954 769(2.17)944 378(2.87)1 502 353(3.16)

注：括號內(nèi)的數(shù)字表示占原始序列數(shù)的百分比。

Note: Data in the brackets represent percentage to raw reads.

2.3 卵泡發(fā)育過程中COCs基因表達特征及差異表達基因分析

在小、中、大卵泡3個階段的COCs中共檢測到17 342個基因表達，其中有14 660個基因在3個階段共表達，有692、315和399個基因分別在小、中、大COCs中特異表達(圖1)。

S：小卵泡的卵丘卵母細胞復(fù)合體；M：中卵泡的卵丘卵母細胞復(fù)合體；L：大卵泡的卵丘卵母細胞復(fù)合體 S: COCs from small follicles; M: COCs from medium follicles; L: COCs from large follicles圖1 牦牛卵泡發(fā)育過程中COCs基因表達韋恩圖Fig.1 Venn diagram of gene expression of COCs during follicle development

采用edgeR軟件進行DEGs檢測的結(jié)果顯示，小卵泡與中卵泡COCs之間有879個DEGs，其中，S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100 calcium binding protein A9,

S100A9

)、可溶性載體族25(Solute carrier family 25 member 47,

SLC25A47

)和胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白(Matrix extracellular phosphoglycoprotein,

MEPE

)等435個基因上調(diào)，胞質(zhì)tRNA2-硫代化蛋白(Cytoplasmic tRNA 2-thiolation protein 1,

TUC1/NCS6

)、非典型趨化因子受體3(Atypical chemokine receptor 3,

ACKR3

)和谷氨酸受體代謝型1(Glutamate receptor, metabotropic 1,

GRM1

)等444個基因下調(diào)。中卵泡與大卵泡COCs之間有1 560個DEGs，其中，神經(jīng)肽B (Neuropeptide B,

NPB

)、絲氨酸/精氨酸相關(guān)核基質(zhì)蛋白2(Serine/arginine repetitive matrix protein 2-like,

SRRM2

)和胞質(zhì)tRNA2-硫代化蛋白1(Cytoplasmic tRNA 2-thiolation protein 1,

TUC1/NCS6

)等590個基因上調(diào)，錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白1(Ankyrin repeat domain 1,

ANKRD1

)、同源異形盒D10(Homeobox D10,

HOXD10

)和去整合素金屬蛋白酶1(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 1,

ADAMTS1

)等970個基因下調(diào)(圖2(a))。兩個發(fā)育階段有423個DEGs相同，中卵泡發(fā)育到大卵泡COCs的特異DEGs數(shù)(1 137個)高于小卵泡發(fā)育到中卵泡COCs的特異DEGs數(shù)(456)(圖2(b))。牦牛小卵泡到中卵泡發(fā)育過程中COCs的前10位上調(diào)基因包括和下調(diào)基因及從中卵泡發(fā)育到大卵泡前10位上調(diào)基因和下調(diào)基因分別見表2和3，2個階段的前10位上調(diào)基因和下調(diào)基因存在明顯差異。

S:小卵泡COCs；M:中卵泡COCs；L:大卵泡COCs。 S: COCs from small follicles; M: COCs from medium follicles; L: COCs from large follicles.圖2 牦牛COCs差異表達基因分析Fig.2 DEG analysis of yak COCs

表2 牦牛小卵泡與中卵泡卵丘卵母細胞復(fù)合體的前10位上調(diào)基因和下調(diào)基因
Table 2 Top 10 up- and down-regulated DEGs between yak COCs from small and medium follicles

基因Gene登錄號Gene IDlog2倍比log2 FCP值P value基因描述Description上調(diào)基因 Up-regulated genes S100A9BmuPB0184597.664 40.000 1S100鈣結(jié)合蛋白A9 S100 calcium binding protein A9 SLC25A47BmuPB0019597.344 20.000 4可溶性載體族25 Solute carrier family 25 member 47 MEPEBmuPB0205947.344 20.000 4胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白Matrix extracellular phosphoglycoprotein HCRTBmuPB0070587.344 20.000 4下丘泌素神經(jīng)肽前體Hypocretin neuropeptide precursor AGXT2BmuPB0069427.344 20.000 4丙氨酸乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶2Alanine-glyoxylate aminotransferase 2 SLC23A1BmuPB0064007.152 90.000 7可溶性載體族23 Solute carrier family 23 member 1 ANKRD62BmuPB0191967.152 90.000 7錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白Ankyrin repeat domain-containing protein 62-like DIRAS3BmuPB0121377.152 90.000 7DIRAS家族 GTP酶3 DIRAS family GTPase 3 MOXD2BmuPB0217987.152 90.000 7DBH 樣單加氧酶蛋白2Putative DBH-like monooxygenase protein 2 IFNB2BmuPB0143727.152 90.000 7干擾素β-2 Interferon beta-2下調(diào)基因 Down-regulated genes TUC1/NCS6BmuPB021329-8.564 88.76×10-7胞質(zhì)tRNA2-硫代化蛋白Cytoplasmic tRNA 2-thiolation protein 1 ACKR3BmuPB017683-8.513 41.22×10-6非典型趨化因子受體3 Atypical chemokine receptor 3 GRM1BmuPB007411-8.317 62.94×10-6谷氨酸受體代謝型1 Glutamate receptor, metabotropic 1 ANO2BmuPB013453-8.125 67.72×10-6阿諾菌胺-2 Anoctamin-2 BNIPLBmuPB019114-7.779 14.53×10-5BCL2樣相互作用蛋白質(zhì) BCL2 interacting protein like DSG2BmuPB002343-7.642 27.45×10-5橋粒芯糖蛋白2 Desmoglein 2 LRRC38BmuPB006751-7.491 00.000 2富含亮氨酸重復(fù)蛋白38 Leucine rich repeat containing 38 LDHDBmuPB001552-7.322 10.000 3乳酸脫氫酶D Lactate dehydrogenase D TRIM68BmuPB015987-7.261 10.000 4三結(jié)構(gòu)域蛋白家族 Tripartite motif containing 68 TTFBmuPB012707-7.197 40.000 5T轉(zhuǎn)錄因子T brachyury transcription factor

注：logFC倍比表示log中卵泡COCs基因表達量/小卵泡COCs基因表達量。

Note: logFC represents log gene expression of medium COCs to small COCs.

2.4 差異表達基因的GO富集分析.

經(jīng)GO注釋分類分析后發(fā)現(xiàn)，牦牛小卵泡與中卵泡COCs之間的DEGs注釋到106條GO條目(GO term)上，其中生物過程(Biological process, BP)類別(Category)46條，細胞組成(Cellular component, CC)類別25條，分子功能(Molecular function, MF)類別35條。在BP分類中，信號傳導(dǎo)(Signal transduction)、運輸(Transport)和生物過程(Biological process)等GO條目最為顯著富集；在CC分類中，細胞組分(Cellular component)、蛋白質(zhì)復(fù)合物(Protein complex)和細胞膜(Plasma membrane)等GO 條目最為顯著富集；在MF分類中，結(jié)構(gòu)分子活性(Structural molecule activity)、酶調(diào)節(jié)劑活性(Enzyme regulator activity)和脂質(zhì)結(jié)合(Lipid binding)等GO 條目最為顯著富集。每個分類中前20條GO條目見圖3。

表3 牦牛中卵泡與大卵泡卵丘卵母細胞復(fù)合體的前10位上調(diào)基因和下調(diào)基因
Table 3 Top 10 up- and down-regulated DEGs between yak COCs from medium and large follicles

基因Gene登錄號Gene IDlog2倍比log2FCP值P value基因描述Description上調(diào)基因 Up-regulated genes NPBBmuPB0119479.188 62.87×10-8神經(jīng)肽B Neuropeptide B SRRM2BmuPB0212578.817 32.23×10-7絲氨酸/精氨酸相關(guān)核基質(zhì)蛋白2Serine/arginine repetitive matrix protein 2-like TUC1/NCS6BmuPB0213298.637 26.35×10-7胞質(zhì)tRNA2-硫代化蛋白1Cytoplasmic tRNA 2-thiolation protein 1 SEZ6LBmuPB0162168.374 92.45×10-6癲癇樣相關(guān)蛋白6 Seizure related 6 homolog like TRIM68BmuPB0159878.316 23.54×10-6三結(jié)構(gòu)域蛋白家族 Tripartite motif containing 68 MGAM2BmuPB0217968.223 35.19×10-6麥芽糖化酶 Probable maltase-glucoamylase 2 HIST2H3BE-LBmuPB0148268.089 59.48×10-6組蛋白H2BHistone H2B type 3-B-like RHOXF1LBmuPB0193097.980 31.80×10-5Rhox同源框家族成員1樣Rhox homeobox family member 1-like LRRIQ4BmuPB0110547.820 53.57×10-5富含亮氨酸重復(fù)蛋白Q4Leucine rich repeats and IQ motif containing 4 SPERTBmuPB0025867.777 64.53×10-5精細胞相關(guān)蛋白 Spermatid associated下調(diào)基因 Down-regulated genes ANKRD1BmuPB006185-9.661 22.07×10-9錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白1 Ankyrin repeat domain 1 HOXD10BmuPB017774-9.040 78.64×10-8同源異形盒D10 Homeobox D10 ADAMTS1BmuPB015735-8.342 03.54×10-6去整合素金屬蛋白酶1ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 1 NR4A2BmuPB000369-8.249 26.32×10-6細胞核受體第4亞科A組成員2Nuclear receptor subfamily 4 group A member 2 S100A12BmuPB018458-8.200 47.72×10-6鈣結(jié)合蛋白S100A12S100 calcium binding protein A12 KIAA1257BmuPB019629-8.200 47.72×10-6KIAA1257同源基因 KIAA1257 ortholog SGK1BmuPB007356-8.150 09.48×10-6人絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Sgk1Serine/threonine-protein kinase Sgk1 ZNF333BmuPB010215-8.097 71.17×10-5鋅指蛋白333 Zinc finger protein 333 TSPYL1BmuPB020407-7.987 12.25×10-5睪丸特異編碼蛋白1Testis-specific Y-encoded protein 1-like RRHBmuPB008986-7.928 42.82×10-5視網(wǎng)膜色素上皮衍生的視紫紅質(zhì)同系物Retinal pigment epithelium-derived rhodopsin homolog

注：logFC倍比表示log大卵泡COCs基因表達量/中卵泡COCs基因表達量。

Note: logFC represents log gene expression of large COCs to medium COCs.

圖3 小卵泡與中卵泡卵丘卵母細胞復(fù)合體的差異表達基因GO分類注釋圖Fig.3 Gene ontology classification of DEGs between COCs from small and medium follicles

牦牛中卵泡與大卵泡COCs之間的DEGs注釋到114條GO條目上，其中BP 55條、CC 26條和MF 33條。不同發(fā)育階段不僅GO條目上富集的基因數(shù)量和二級條目的數(shù)量不同，而且二級條目的排列順序有一定的差異。例如，從小卵泡發(fā)育到中卵泡的過程中BP類別中基因富集排列第2和第3的GO條目分別是運輸和生物過程，而在中卵泡發(fā)育到大卵泡的排列順序正好相反。在BP類別的前20條GO條目只有第1、4、16、19條在2個發(fā)育階段的排列順序完全一致；在CC類別的前20條GO條目只有第1、2、9、10條在2個發(fā)育階段的排列順序完全一致；在MF類別的前20條GO條目只有第1、2、3、4、5、12條在2個發(fā)育階段的排列順序完全一致(圖4)。

圖4 中卵泡與大卵泡卵丘卵母細胞復(fù)合體的差異表達基因GO分類注釋圖Fig.4 Gene ontology classification of DEGs between COCs from medium and large follicles

2.5 差異基因KEGG通路分析

牦牛卵泡發(fā)育過程中COCs差異表達基因KEGG分析表明，小卵泡與中卵泡COCs的DEGs富集在254條通路，包括：神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、細胞因子-細胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)和細胞粘附分子(Cell adhesion molecules, CAMs)等重要通路。中卵泡與大卵泡COCs的DEGs富集在276條通路，包括：神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣離子信號通路(Calcium signaling pathway)和cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)等重要通路。2個發(fā)育階段

P

<0.05且DEGs富集程度最高的前20條通路見圖5。

圖5 牦牛卵泡發(fā)育過程中COCs差異表達基因KEGG富集分析散點圖Fig.5 Scatter diagram of KEGG enrichment analysis for DEGs of yak COCs during follicle development

3 討 論

文庫構(gòu)建和測序質(zhì)量評估結(jié)果顯示，本研究文庫構(gòu)建質(zhì)量和測序質(zhì)量高，測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。雖然中卵泡COCs的Clean reads比較低，但在不同組織中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，大于 6×10條reads的測序文庫就能夠檢測到組織中大部分表達的基因。因此,認為中卵泡32 905 166條Clean reads的測序深度是足夠的，能夠客觀反映牦牛卵泡發(fā)育過程中COCs的基因表達情況。由于本研究用的牦牛COC的RNA量少，不能滿足進一步開展q-PCR驗證的需求，因此，本研究對測序結(jié)果未作進一步的qRT-PCR驗證。

本研究通過對基因表達分析，發(fā)現(xiàn)小卵泡與中卵泡COCs之間有879個DEGs，其中，435個基因上調(diào)，444個基因下調(diào)；中卵泡與大卵泡COCs之間有1 560個DEGs，其中，590個基因上調(diào)，970個基因下調(diào)。2個階段DEGs中，尤其是中卵泡發(fā)育到大卵泡過程中，COCs下調(diào)基因數(shù)量高于上調(diào)基因數(shù)量，說明卵巢中COCs的發(fā)育能力整體上是逐漸減弱，這與前人關(guān)于卵泡發(fā)育動態(tài)的研究結(jié)果一致，即在發(fā)情周期的每一個卵泡波中都有幾個到幾十個卵泡發(fā)育，但大多數(shù)卵泡在發(fā)育的不同階段閉鎖退化，最終只有少數(shù)卵泡能發(fā)育到最后成熟排卵。相對于未成熟卵母細胞而言，體外成熟的牦牛卵母細胞中下調(diào)基因的數(shù)量(3 343個)也是高于上調(diào)基因(1 418個)的數(shù)量，這些研究結(jié)果提示，在卵泡發(fā)育進程中COCs表達量下調(diào)基因數(shù)目增加，可能與多數(shù)卵泡和卵母細胞發(fā)育與成熟能力逐漸減弱、趨向閉鎖之間有一定關(guān)聯(lián)性。下丘腦促性腺素釋放激素(GnRH)調(diào)節(jié)腦垂體促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)的合成與釋放，F(xiàn)SH和LH對調(diào)節(jié)有腔卵泡的發(fā)育與成熟起至關(guān)重要的作用。卵巢的卵泡膜細胞、顆粒細胞、卵丘細胞和卵母細胞中一系列基因和蛋白按特定的時空順序表達以及卵丘細胞與卵母細胞分泌因子的互作，最終決定卵泡發(fā)育的命運是成熟排卵還是在發(fā)育的不同階段閉鎖。目前發(fā)現(xiàn)的參與形成卵母細胞/顆粒細胞調(diào)控環(huán)的最重要因子包括GDF-9、BMP-15和KITL等。卵母細胞分泌的GDF-9和BMP-15調(diào)節(jié)卵丘細胞的分裂和KITL的表達，而卵丘細胞分泌的KITL反過來調(diào)節(jié)卵母細胞的發(fā)育與成熟。但是，本研究發(fā)現(xiàn)在牦牛卵泡發(fā)育過程中，COCs中差異表達基因排名靠前的不是這些基因，說明這些基因在牦牛卵泡發(fā)育的不同階段可能都發(fā)揮重要作用，但不是階段性特異調(diào)控基因。

本研究從基因的差異表達及功能分析發(fā)現(xiàn)一些在以前的研究中沒有關(guān)注到的可能與卵泡發(fā)育相關(guān)的一些階段性特異調(diào)控基因，例如，

S100A9

、

SLC25A47

、

MEPE

、

TUC1/NCS6

、

GRM1

、

NPB

和

HOXD10

等一些在卵泡發(fā)育不同階段差異倍數(shù)大的基因。100A9可以提高

Bcl

-2的表達，抑制細胞凋亡；SLC25A47是一種跨膜蛋白，能調(diào)節(jié)糖、氨基酸、核苷酸、無機離子等物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運，維持細胞正常功能；MEPE保護細胞DNA損傷，對細胞具有保護作用。TUC1/NCS6是硫代tRNA細胞庫的維持和細胞生長必需的物質(zhì)；GRM1抑制細胞生長。NPB與卵巢中孕酮和雌二醇的分泌相關(guān)；HOXD10抑制細胞增殖、遷移，促進細胞凋亡。因此，這些基因在牦牛不同大小卵泡中表達量的差異可能與牦牛卵泡發(fā)育與卵母細胞的成熟有關(guān)。本研究采用Illumina平臺對COCs進行測序，樣本是卵母細胞和卵丘細胞的混合物，雖然結(jié)果能反映出牦牛卵泡發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組的全局性變化，但獲得的數(shù)據(jù)在一定程度上與卵丘細胞占的比例有關(guān)系，因此，為了進一步探明卵母細胞和卵丘細胞在卵泡發(fā)育中的分子調(diào)控機制，有必要進一步開展卵泡在同一個發(fā)育階段的這兩種細胞單獨測序分析。在牦牛卵泡發(fā)育的2個階段，DEGs種類和數(shù)量不同，GO富集條目和KEGG富集也不同，提示在不同大小的卵泡中收集的COCs的體外成熟(

In

vitro

maturation, IVM)要求條件不一樣。目前，在牦牛和普通牛的卵母細胞IVM中，從直徑2～8 mm大小不等的卵泡中收集的COCs都是在相同的IVM液中共同培養(yǎng)。比利時、丹麥和法國等國的研究表明，在相同體外受精(IVF)系統(tǒng)里，牛小卵泡、中卵泡和大卵泡獲得的卵母細胞的卵裂率和囊胚率有顯著差異。因此，如果根據(jù)卵泡大小的發(fā)育特點調(diào)整IVM液的成分，對COCs進行分類培養(yǎng)則有望提高牦牛卵母細胞的成熟率和發(fā)育能力。

本研究KEGG分析發(fā)現(xiàn)，DEGs富集程度高的神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細胞因子-細胞因子受體相互作用、細胞粘附分子、鈣離子信號等通路是牦牛COCs發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控通路。在其他物種的研究證明，這些通路在卵泡的發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控作用。牛屬及其他物種卵母細胞發(fā)育轉(zhuǎn)錄組相關(guān)研究表明，MAPK、Wnt及P13K/Akt凋亡通路在卵母細胞成熟中起了關(guān)鍵調(diào)控作用。TGF-β信號通路、雌激素信號通路、VEGF信號通路、丙酮酸代謝、ErbB信號通路等都參與卵泡發(fā)育調(diào)控，本研究發(fā)現(xiàn)這些通路在牦牛卵泡發(fā)育過程中也發(fā)生富集，說明這些通路在牦牛卵泡發(fā)育中也發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究還發(fā)現(xiàn)DEGs在血小板活化(Platelet activation)通路富集程度高，與在牦牛卵母細胞IVM液中添加適當(dāng)濃度的血小板活化因子(PAF)可以提高牦牛卵母細胞成熟率的研究結(jié)果相吻合。

4 結(jié) 論

本研究運用轉(zhuǎn)錄組學(xué)系統(tǒng)分析了牦牛不同大小的有腔卵泡發(fā)育過程中COC轉(zhuǎn)錄組差異，篩選得到小卵泡與中卵泡COCs之間有879個DEGs，中卵泡與大卵泡COCs之間有1 560個DEGs。這些DEGs主要富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細胞因子-細胞因子受體相互作用、細胞黏附分子、鈣離子信號通路和cAMP信號通路等重要通路，為揭示牦牛卵泡發(fā)育與成熟調(diào)控機制及完善牦牛卵母細胞體外成熟技術(shù)提供了理論依據(jù)。