鐘藝煊 王彥紅 楊成根 鄒 輝 顧建紅 袁 燕 卞建春 劉學(xué)忠*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州 225009； 2.揚(yáng)州大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009； 3.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009)

農(nóng)藥是一類(lèi)多相化學(xué)物質(zhì)，可以通過(guò)控制病菌的危害來(lái)減少生物毒素的產(chǎn)生和食源性疾病微生物的污染，保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。20世紀(jì)90年代以來(lái)，新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑已成為世界上使用最頻繁的殺蟲(chóng)劑之一。根據(jù)中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，截止到2017年7月，新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑已占據(jù)我國(guó)殺蟲(chóng)劑市場(chǎng)份額的1/4以上。其中，作為第一代新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑代表的吡蟲(chóng)啉(IMI)，使用最為廣泛。IMI是一種尼古丁類(lèi)神經(jīng)毒性殺蟲(chóng)劑，通過(guò)煙堿型乙酰膽堿受體(NAChR)阻斷神經(jīng)傳遞，導(dǎo)致昆蟲(chóng)麻痹死亡。通常用于農(nóng)作物、水果和蔬菜中，以防治刺吸式口器害蟲(chóng)。IMI對(duì)昆蟲(chóng)具有急性毒性，因其可在哺乳動(dòng)物體內(nèi)蓄積，IMI對(duì)哺乳動(dòng)物的亞致死性損傷作用也日益凸顯，長(zhǎng)期暴露會(huì)影響人和動(dòng)物的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等。目前有研究表明，IMI對(duì)非靶標(biāo)生物體的不利影響，包括對(duì)人體的不利影響，取決于暴露量。因此，對(duì)于IMI殘留的檢測(cè)顯得尤為重要。

目前，新煙堿類(lèi)農(nóng)藥殘留常規(guī)檢測(cè)方法有氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS)和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)，這些常規(guī)檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)耗力，過(guò)度依賴(lài)儀器和專(zhuān)業(yè)檢測(cè)人員，不適合進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此,人們迫切希望有一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏及價(jià)廉的ELISA檢測(cè)技術(shù)能在室外和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行大批量的篩選試驗(yàn)。

IMI分子量為255.66，是一種小分子物質(zhì)。只具備反應(yīng)原性而不具備免疫原性，只有與載體蛋白偶聯(lián)以后，才具備免疫原性。一般來(lái)說(shuō)，具有活性基團(tuán)的小分子，可以與載體蛋白直接進(jìn)行偶聯(lián)。因?yàn)镮MI不具備與載體蛋白直接進(jìn)行偶聯(lián)的活性基團(tuán)，與載體蛋白的連接較困難，所以需要先對(duì)IMI分子進(jìn)行衍生。這主要依賴(lài)其分子結(jié)構(gòu)中的 3 個(gè)活性位點(diǎn)，分別是：吡啶環(huán)上α-Cl、咪唑環(huán)上亞胺基H原子和-NO。目前，朱國(guó)念等和姚蕾珺主要是通過(guò)親和取代反應(yīng)替換吡啶環(huán)上α-Cl；馬寅生等和Lee等主要是通過(guò)將-NO還原成-NH，使其與載體蛋白直接偶聯(lián)；通過(guò)吸電子效應(yīng)取代咪唑環(huán)上亞胺基H原子這一方法理論可行，實(shí)際操作則會(huì)大大降低該化合物與乙酰膽堿受體的結(jié)合能力。其中，親和取代反應(yīng)法最早被用于IMI人工半抗原的合成，且應(yīng)用最為廣泛。半抗原從-Cl衍生簡(jiǎn)單碳鏈，對(duì)吡蟲(chóng)啉的結(jié)構(gòu)改動(dòng)小，且Cl原子位于分子識(shí)別的遠(yuǎn)端，能使IMI的抗原決定簇充分暴露，合成半抗原的抗體非常靈敏。

通過(guò)親和取代反應(yīng)取代IMI吡啶環(huán)上α-Cl這一半抗原合成方法以朱國(guó)念等發(fā)表的最為成熟。雖然此方法為目前最為常用的IMI人工半抗原合成方法，但也存在很多缺點(diǎn)，如：試驗(yàn)過(guò)程中使用高?；瘜W(xué)試劑，易造成火災(zāi)、半抗原合成過(guò)程容易產(chǎn)生較多雜質(zhì)、免疫后小鼠血清抗體效價(jià)低等。本研究旨在減少常規(guī)IMI半抗原合成方法中雜質(zhì)的產(chǎn)生，提高免疫后小鼠血清抗體效價(jià)，最終提高IMI單克隆抗體制備過(guò)程中融合細(xì)胞的陽(yáng)性率，獲得高質(zhì)量、高產(chǎn)量的IMI單克隆抗體細(xì)胞株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

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實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康狀況良好的7周齡雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠(編號(hào)為202103799)，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

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主要試劑及儀器

95%的吡蟲(chóng)啉原藥(江蘇紅太陽(yáng)集團(tuán)有限公司)，N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺、98% 3-巰基丙酸、N-羥基琥珀酰亞胺(Sigma-Aldrich)，4-二甲基吡啶(上海源葉生物科技有限公司)，二甲亞砜、薄層層析硅膠版GF254型(揚(yáng)州必幫生物技術(shù)有限公司)，氫氧化鉀、二氯甲烷、乙酸乙酯等其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純或優(yōu)級(jí)純。

maXis超高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、AVANCE 600核磁共振波譜儀NMR(Bruker Daltonics)，通風(fēng)廚(揚(yáng)州天輝鋼木制品公司)，電熱套、化學(xué)用升降臺(tái)(揚(yáng)州必幫生物技術(shù)有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)等。

1.2 試驗(yàn)方法

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試驗(yàn)原理

如圖1所示：以IMI原藥和3-巰基丙酸為原料，在熱堿的作用下，通過(guò)親和取代反應(yīng)，合成IMI人工半抗原。

圖1 IMI人工半抗原合成路線(xiàn)圖Fig.1 Roadmap of IMI artificial semi-antigen synthesis

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IMI半抗原合成方法的優(yōu)化

IMI半抗原常規(guī)合成方法參照朱國(guó)念等報(bào)道的方法如下：稱(chēng)取IMI 5.15 g，用20 mL DMSO溶解，再加入KOH 2.25 g；另稱(chēng)取3-巰基丙酸2.10 g，用10 mL DMSO溶解；在攪拌下將3-巰基丙酸溶液緩慢滴加到三口燒瓶中，于油浴上使之緩慢升溫至100 ℃，保溫2 h后；撤去油浴，待產(chǎn)物自然冷卻至室溫。取反應(yīng)體系5 mL，加入8 mL雙蒸水，以6 mol/L HCL溶液調(diào)節(jié)pH為3；用4 mL二氯甲烷在分液漏斗中萃取，收集下層。用3 mL NaHCO水溶液萃取，收集上層；用少量乙醚洗滌水相，棄去乙醚層；用6 mol/L HCL溶液調(diào)節(jié)水相pH為3，然后用3 mL乙酸乙酯分萃取，合并乙酸乙酯提取液。用少量蒸餾水洗滌乙酸乙酯，棄水層。提取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮。加入少量丙酮溶液溶解,靜置過(guò)夜,有黃色晶體析出，即為IMI半抗原。

IMI半抗原合成方法的優(yōu)化(下文稱(chēng)為優(yōu)化方法)如下：稱(chēng)取IMI 1.3 g于三口燒瓶中，用15 mL DMSO溶解，得到A液；稱(chēng)取篩選出的最適比例的KOH和3-巰基丙酸(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺篊N202110772955.0)，用5 mL DMSO溶解，得到B液；打開(kāi)電熱套，將A液緩慢升溫至100 ℃；通入氮?dú)?；緩慢向其中滴加B液，邊加邊攪拌；100 ℃保溫3 h；撤去電熱套，待反應(yīng)體系冷卻至室溫。取反應(yīng)體系5 mL，用8 mL雙蒸水溶解，6 mol/L稀鹽酸調(diào)pH至3.0；用4 mL二氯甲烷在分液漏斗中萃取，收集下層；下層用3 mL NaHCO水溶液萃取，收集上層；上層用3 mL乙酸乙酯萃取，收集下層；下層用6 mol/L稀鹽酸調(diào)pH至3.0，用3 mL乙酸乙酯萃取，收集上層，產(chǎn)品在上層中。取30 mL產(chǎn)品用DDW萃取后加入1.2 g無(wú)水硫酸鈉干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)得到IMI半抗原。

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IMI半抗原結(jié)構(gòu)鑒定

IMI半抗原的分子結(jié)構(gòu)采用薄層層析色譜(TLC)法、質(zhì)譜(MS-ESI)法和核磁共振(H-NMR)法進(jìn)行確證。

1.2.3.1 薄層層析色譜(TLC)法

采用微量毛細(xì)管進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣前，先用鉛筆在薄層板上距末端1 cm處輕輕畫(huà)一橫線(xiàn)，然后用毛細(xì)管吸取樣液在橫線(xiàn)上輕輕點(diǎn)樣。將點(diǎn)樣的薄層板放在展開(kāi)劑中展開(kāi)，待位移至2/3處，取出薄層板。展開(kāi)后的薄層板干燥后，用紫外光燈照射，檢出斑點(diǎn)。展開(kāi)分離后，化合物在薄層板上的位置用比移值R(溶質(zhì)移動(dòng)的距離/溶液移動(dòng)的距離)來(lái)表示。

1.2.3.2 質(zhì)譜(MS-ESI)法

采用電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對(duì)IMI人工合成半抗原進(jìn)行分析, 負(fù)離子模式，電噴霧電壓3 000 V,毛細(xì)管電壓為60 V,離子源溫度105 ℃,輔助氣溫度350 ℃,進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描,獲取母離子質(zhì)荷比,對(duì)IMI半抗原進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.3.3 核磁共振(H-NMR)法

將合成的IMI人工半抗原用CDSO溶解后掃描其H-NMR譜，根據(jù)不同H原子的化學(xué)位移和不同位移處NMR譜峰的積分比例，分析合成的IMI人工半抗原中H原子的數(shù)目及分布，以確定IMI人工半抗原合成情況。

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完全抗原偶聯(lián)鑒定

將常規(guī)方法合成獲得的IMI半抗原和優(yōu)化方法合成獲得的IMI半抗原通過(guò)親和取代反應(yīng)分別與相同載體蛋白(BSA)進(jìn)行偶聯(lián)得到完全抗原。偶聯(lián)得到的完全抗原(IMI-BSA)進(jìn)行3 d的透析純化。采用薄層析色譜法(方法同1.2.3.1)，鑒定IMI-BSA是否偶聯(lián)成功。

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吡蟲(chóng)啉完全抗原免疫小鼠及血清抗體效價(jià)的測(cè)定

用鑒定后的完全抗原按照表1的免疫程序?qū)?周齡雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，并于三免和五免7 d之后斷尾采血，按照李剛等方法，對(duì)小鼠血清采用間接ELISA法測(cè)定其抗體效價(jià)。

表1 吡蟲(chóng)啉完全抗原免疫小鼠的免疫程序
Table 1 Immunization program in mice immunized with imidacloprid complete antigen

免疫時(shí)間Immune time免疫原 Immunogen常規(guī)方法Conventionalmethod優(yōu)化方法Optimizationmethod免疫劑量Immune dose免疫途徑Immune route首免First immunizationIMI-BSA+弗氏完全佐劑優(yōu)化IMI-BSA+弗氏完全佐劑50 μg/0.1 mL/只腹腔注射二免(間隔三周)Second immunization(Three-week interval)IMI-BSA+弗氏不完全佐劑優(yōu)化IMI-BSA+弗氏不完全佐劑50 μg/0.1 mL/只腹腔+皮下三點(diǎn)注射三免(間隔兩周)Third immunization(Two-week interval)IMI-BSA+弗氏不完全佐劑優(yōu)化IMI-BSA+弗氏不完全佐劑50 μg/0.1 mL/只腹腔+皮下三點(diǎn)注射四免(間隔兩周)Fourth immunization(Two-week interval)IMI-BSA+弗氏不完全佐劑優(yōu)化IMI-BSA+弗氏不完全佐劑50 μg/0.1 mL/只腹腔+皮下三點(diǎn)注射五免(間隔兩周)Fifth immunization(Two-week interval)IMI-BSA+弗氏不完全佐劑優(yōu)化MI-BSA+弗氏不完全佐劑50 μg/0.1 mL/只腹腔+皮下三點(diǎn)注射沖擊免疫(融合前3 d)Shock immunity(Three days before integration)IMI-BSA+生理鹽水優(yōu)化IMI-BSA+生理鹽水50 μg/0.1 mL/只腹腔注射

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的鑒定

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薄層層析色譜法檢測(cè)分析

根據(jù)圖2薄層層析色譜圖計(jì)算各物質(zhì)的比移值R(溶質(zhì)移動(dòng)的距離/溶液移動(dòng)的距離)，結(jié)果顯示：IMI、反應(yīng)體系、有機(jī)相和水相的R值分別為0.55、0.23、0.50和0。產(chǎn)品萃取后保留在有機(jī)相中，在相同展開(kāi)劑中，產(chǎn)品的R值與IMI、反應(yīng)體系、和水相均不相同，且紫外下可見(jiàn)熒光反應(yīng)，判定IMI半抗原合成成功。

A:IMI；B:反應(yīng)體系;C:有機(jī)相;D:水相 A: Imidacloprid; B: Reaction system; C: Organic phase; D: Aqueous phase圖2 TLC法檢測(cè)半抗原偶聯(lián)反應(yīng)Fig.2 TLC method for detection of semi-antigenic coupling reactions

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質(zhì)譜法分析結(jié)果

圖3 IMI半抗原質(zhì)譜法分析結(jié)果顯示：M，m/z，326，且其余分子離子峰的解釋也較為合理，因此可以判斷，該碎片離子峰為IMI人工半抗原的分子離子峰[M]。

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核磁共振法分析結(jié)果

圖4 IMI半抗原核磁共振法分析結(jié)果顯示，該化合物H-NMR譜(400 MHz，DMSO-D)為：δ12.36 (1H, s, COOH)，8.89 (1H, s, NH)，8.38～8.39(1H, d, Pry：H)，7.52～7.81 (1H, q, Pry：H)，8.37～8.98 (1H, t, Pry：H)，4.47(2H, s, CH)，4.02(2H, q, CH)，2.50～2.90 (2H, q, CH)，1.24(2H, m, CH)，與文獻(xiàn)報(bào)道的IMI半抗原核磁結(jié)果相符。

圖3 IMI 半抗原質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of imidacloprid hapten

圖4 IMI半抗原核磁圖Fig.4 Nuclear magnetic resonance (NMR) of imidacloprid hapten

2.2 完全抗原的偶聯(lián)鑒定

采用薄層層析色譜法對(duì)完全抗原偶聯(lián)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。根據(jù)圖5薄層層析色譜圖計(jì)算各物質(zhì)的比移值R(溶質(zhì)移動(dòng)的距離/溶液移動(dòng)的距離)，結(jié)果顯示：IMI-BSA和BSA的R值分別為0.43和0.85。在相同的展開(kāi)劑下，具有不同的R，判斷有新物質(zhì)生成，而當(dāng)加入BSA后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間樣點(diǎn)消失，判斷物質(zhì)偶聯(lián)完全，可初步驗(yàn)證IMI和BSA反應(yīng)良好，初步判定IMI-BSA免疫原偶聯(lián)成功。

2.3 小鼠血清抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

三免和五免7 d之后斷尾采血，測(cè)定小鼠血清抗體效價(jià)，如圖6所示：使用常規(guī)方法合成的IMI半抗原進(jìn)行免疫的小鼠，血清抗體效價(jià)在三免后僅達(dá)到1∶800，五免后勉強(qiáng)達(dá)到1∶12 800；而使用優(yōu)化方法合成的IMI半抗原進(jìn)行免疫的小鼠，血清抗體效價(jià)在三免后均可達(dá)到1∶12 800，五免后可達(dá)到1∶51 200。

A:IMI-BSA; B:反應(yīng)體系 A: Imidacloprid； B: Reaction system圖5 TLC法檢測(cè)完全抗原偶聯(lián)反應(yīng)Fig.5 TLC method for detection of complete antigenic coupling reactions

圖6 小鼠血清抗體效價(jià)測(cè)定Fig.6 Detection of antibody titers of mouse serum

3 討 論

3.1 調(diào)整使用試劑對(duì)試驗(yàn)安全性的影響

IMI半抗原合成過(guò)程，反應(yīng)需持續(xù)加熱。常規(guī)方法使用油浴加熱，導(dǎo)熱效果好，能使物質(zhì)均勻受熱且保持恒溫，但操作過(guò)程需十分謹(jǐn)慎，以防因油外溢而燙傷或因升溫過(guò)高而引起火災(zāi)。優(yōu)化方法選用恒溫電熱套代替油浴，升溫更快、可控性更好，且可以很好地避免燙傷和失火。

常規(guī)方法使用的乙醚等高?；瘜W(xué)試劑，操作人員長(zhǎng)期低濃度接觸會(huì)透皮吸收，因毒性蓄積而出現(xiàn)一系列不適癥狀。優(yōu)化方法使用乙酸乙酯替換乙醚，降低了化學(xué)試劑對(duì)試驗(yàn)人員的毒性，提高了試驗(yàn)操作的安全性。

3.2 調(diào)整反應(yīng)順序和試劑比例對(duì)半抗原合成過(guò)程雜質(zhì)產(chǎn)生的影響

常規(guī)IMI半抗原合成方法，雖然能夠得到最終產(chǎn)品，但合成的半抗原含雜質(zhì)較多，會(huì)產(chǎn)生較多3-巰基丙酸的氧化副產(chǎn)物和其他碎片離子。并且，在普通實(shí)驗(yàn)室，每次合成的半抗原數(shù)量有限，往往需要進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)才可獲得足夠量的半抗原進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

優(yōu)化方法在3-巰基丙酸加入反應(yīng)之前預(yù)先通入氮?dú)猓⒕S持到整個(gè)反應(yīng)結(jié)束，以此排出氧氣，一定程度減少了氧氣與3-巰基丙酸發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生氧化副產(chǎn)物。同時(shí)，篩選出最適3-巰基丙酸反應(yīng)比例，一方面保證3-巰基丙酸能夠完全反應(yīng)，保證IMI人工半抗原的產(chǎn)量，另一方面防止3-巰基丙酸過(guò)剩而與其他物質(zhì)反應(yīng)生成氧化副產(chǎn)物或者有大量3-巰基丙酸殘留而產(chǎn)生過(guò)多的雜質(zhì)。優(yōu)化方法質(zhì)譜結(jié)果顯示質(zhì)荷比為326的峰是IMI半抗原的分子離子峰，符合質(zhì)譜分析中有機(jī)物的含氮規(guī)則。相較于李廣領(lǐng)的方法，其余碎片離子峰數(shù)量有了很大程度的減少。一方面，說(shuō)明優(yōu)化方法合成的半抗原雜質(zhì)減少，另一方面，溶劑峰的減少和下降，也說(shuō)明了IMI半抗原合成反應(yīng)更為徹底。優(yōu)化方法核磁結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符，相較于朱國(guó)念等的方法，12.36處的3-巰基丙酸的氧化副產(chǎn)物峰明顯下降，說(shuō)明3-巰基丙酸的氧化副產(chǎn)物減少，進(jìn)一步說(shuō)明優(yōu)化方法合成的人工半抗原雜質(zhì)減少。但是，由于專(zhuān)業(yè)純度檢測(cè)儀器的限制，尚未準(zhǔn)確測(cè)出半抗原純度，具體提升值尚不明確，后續(xù)可作進(jìn)一步檢測(cè)。

3.3 優(yōu)化方法對(duì)免疫后小鼠血清抗體效價(jià)的影響

單抗制備過(guò)程中動(dòng)物的免疫效價(jià)，會(huì)影響其產(chǎn)生特異性抗體的能力，同時(shí)也影響單抗的大量生產(chǎn)。若半抗原偶聯(lián)數(shù)量過(guò)多, 會(huì)因抗原過(guò)量而產(chǎn)生免疫耐受；若半抗原偶聯(lián)數(shù)量過(guò)少, 則會(huì)因抗原不足而不產(chǎn)生抗體。所以, 小分子抗原偶聯(lián)到載體的數(shù)量要適中, 才能使免疫后的小鼠產(chǎn)生高效價(jià)的抗體。

使用優(yōu)化方法合成獲得的半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到完全抗原，用偶聯(lián)的完全抗原免疫小鼠，三免后，小鼠血清抗體效價(jià)均可達(dá)到1∶12 800；五免后，小鼠血清抗體效價(jià)達(dá)到1∶51 200。使用常規(guī)合成方法偶聯(lián)獲得的完全抗原免疫小鼠，五免后，小鼠血清抗體效價(jià)僅達(dá)到1∶12 800。李剛等使用常規(guī)合成方法偶聯(lián)獲得的完全抗原免疫小鼠，小鼠血清抗體效價(jià)最高達(dá)到1∶12 800。說(shuō)明優(yōu)化方法可以刺激小鼠更穩(wěn)定地產(chǎn)生更高滴度的抗體。小鼠血清抗體效價(jià)越高，其針對(duì)抗原的特異性抗體濃度則越高，細(xì)胞融合后篩選出陽(yáng)性的概率也越大，所以單抗制備過(guò)程中，提高小鼠抗體效價(jià)十分重要。不僅免疫的抗原能影響免疫就小鼠血清抗體效價(jià)，不同的免疫途徑和免疫劑量也會(huì)使免疫后小鼠效價(jià)發(fā)生改變。后續(xù)可改變免疫的途徑和免疫的劑量，進(jìn)一步篩選出一套可以刺激小鼠更穩(wěn)定地產(chǎn)生更高效價(jià)的免疫程序，使整個(gè)免疫流程更為高效、便利。

4 展 望

本研究通過(guò)調(diào)整半抗原合成過(guò)程反應(yīng)順序和篩選最適3-巰基丙酸反應(yīng)比例，在相對(duì)安全的試驗(yàn)環(huán)境下，減少了IMI人工半抗原合成過(guò)程中雜質(zhì)的產(chǎn)生，一定程度上提高了IMI人工半抗原純度。免疫后，小鼠能產(chǎn)生更高滴度的抗體。后續(xù)可繼續(xù)進(jìn)行IMI單克隆抗體的制備，研究更高滴度的抗體是否能夠刺激小鼠產(chǎn)生更多的B淋巴細(xì)胞用于后續(xù)細(xì)胞融合，從而提升細(xì)胞融合后的陽(yáng)性率，獲得更高質(zhì)量的IMI單克隆抗體細(xì)胞株。最終，建立起能在室外和室內(nèi)進(jìn)行大批量篩選試驗(yàn)的簡(jiǎn)單、快速、靈敏及性?xún)r(jià)比高的ELISA檢測(cè)技術(shù)。