周中馳，徐志龍，陳學(xué)紅，姜金晨，孫會剛

（徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，江蘇徐州 221018）

近年來，隨著農(nóng)藥學(xué)、植物病理學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展以及學(xué)科相互交融，植物源殺菌劑的研究開發(fā)取得了極大進(jìn)步，包括抑菌活性成分的分析、作用方式和抑菌機(jī)理研究、抑菌譜和應(yīng)用效果研究等[1]。開發(fā)天然、高效、安全、無毒、性能穩(wěn)定、價格優(yōu)惠和廣泛適應(yīng)環(huán)境的天然防腐劑已成為現(xiàn)代食品科學(xué)技術(shù)研究及其應(yīng)用的一個重要熱點(diǎn)。石榴葉和甘薯葉本身含有大量的活性抗菌物質(zhì)，加快開發(fā)與利用石榴葉和甘薯葉，不僅可以有效減少資源浪費(fèi)，還能有效降低天然抑菌劑價格，同時還能為我國天然抑菌劑提供新的來源。

石榴葉為石榴科石榴屬植物石榴的葉子，具有清熱燥濕、澀腸等功效。近年來，通過對石榴葉成分的分析，發(fā)現(xiàn)了30多種化合物，其中多酚類和黃酮類物質(zhì)是石榴葉的主要功能性成分，可以作為抗真菌劑、抗生素、止血劑、殺寄生蟲藥使用。相比于維他命C、蘆丁等物質(zhì)，石榴葉提取物表現(xiàn)出更好的自由基清除能力及抗氧化活性。馮珍鴿等[2]使用索氏提取法以甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯為提取溶劑，對番石榴葉進(jìn)行提取，確定最佳提取條件為甲醇、乙醇、正丁醇分別在料液比為1∶16，提取時間為5 h時，番石榴葉提取液最佳；乙酸乙酯在料液比為1∶18、提取時間為5 h時，番石榴葉提取液最佳，并對所提得的番石榴葉提取液進(jìn)行抑菌實(shí)驗，結(jié)果表明番石榴葉提取物有較強(qiáng)的抗菌活性。王紅妹等[3]選取了石榴9個不同部位進(jìn)行研究，用抑菌圈法測定各部位的抑菌活性，研究結(jié)果表明石榴葉、石榴皮、酸石榴籽為有效抑菌部位，具有一定的研究開發(fā)價值。

甘薯葉中含有多種營養(yǎng)成分且富含多種活性多糖、黃酮類化合物和綠原酸。綠原酸是通過咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸，是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)過莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，綠原酸具有多種生物活性[4-5]。蘇萌萌等[6]用雞肉腐敗菌熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌作為指示菌，通過測量經(jīng)過綠原酸處理前后細(xì)胞外的ATP和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，并使用掃描電鏡觀察和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察指示菌經(jīng)過綠原酸處理前后細(xì)胞膜的變化，說明綠原酸是通過作用于細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜受損嚴(yán)重，導(dǎo)致膜電位被破壞，胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏，從而達(dá)到抑菌作用。張鞍靈等[7]發(fā)現(xiàn)綠原酸具有抗氧化、抗菌、抗病毒作用；向國昌等[8]采用了浸提法、超聲波法、浸提法加超聲波法、傳統(tǒng)水煎法和乙醇回流法等5種方法對甘薯葉中的綠原酸進(jìn)行提取，并通過多種方法比較，發(fā)現(xiàn)最適合甘薯葉、莖中綠原酸提取的方法是浸提法和超聲波法的綜合使用，最佳提取條件是pH為4，提取溶液為50%的甲醇或乙醇，浸提時間為24 h，超聲時間為1.0～1.5 h，溫度為40 ℃。

由于石榴葉活性抗菌物質(zhì)和甘薯葉活性抗菌物質(zhì)都能被甲醇、乙醇等極性有機(jī)溶劑所提取，而且甲醇極性比乙醇大，更容易提取到所需的活性抗菌物質(zhì)，故本實(shí)驗將以甲醇作為提取溶劑。

1 材料與方法

1.1 原料

石榴葉，產(chǎn)地為廣東省揭陽市；甘薯葉，產(chǎn)地為福建省漳州市。

1.2 指示菌種與試劑

細(xì)菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），均為徐州工程學(xué)院生物芯片實(shí)驗室保藏菌種；甲醇；LB培養(yǎng)基；肉湯瓊脂培養(yǎng)基；枯草芽孢桿菌常用培養(yǎng)基；瓊脂等。

1.3 主要儀器

SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA2140N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HPX-16085H-Ⅲ恒溫恒濕箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；303-1電熱恒溫培養(yǎng)，紹興市銀河機(jī)械儀器有限公司；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器，德國Christ公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化有限公司；SH-Ⅲ型循環(huán)真空泵，上海亞榮生化有限公司；250 mL規(guī)格提取筒，江蘇匯達(dá)醫(yī)療器械有限公司；250 mL規(guī)格蛇形冷凝管，江蘇匯達(dá)醫(yī)療器械有限公司；立式高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology公司等。

1.4 實(shí)驗方法

1.4.1 石榴葉抑菌活性物質(zhì)的提取

石榴葉清洗后烘干至恒重后，用粉碎機(jī)粉碎成粉，過50目篩。稱取5 g石榴葉粉末，倒入已折好的濾紙包中，組裝好索氏提取器，將濾紙包放入提取筒中，在提取筒里倒入100 mL甲醇，使甲醇能超過一次虹吸管，溫度設(shè)置在80 ℃，回流萃取5 h。將原料的提取液放入旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中，溫度50 ℃，將提取液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮至25 mL，得到原液。

1.4.2 甘薯葉抑菌活性物質(zhì)的提取

甘薯葉清洗后烘干至恒重，用粉碎機(jī)粉碎成粉，過50目篩。稱取2 g甘薯葉粉末，加入200 mL濃度為50%的甲醇，在室溫下靜置24 h，放入超聲波清洗器中，溫度為40 ℃，時間為60 min，功率設(shè)置在80 W進(jìn)行超聲波提取。待原料提取完成后，將提取液進(jìn)行抽濾，將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在溫度為50 ℃下濃縮至10 mL，得到原液。

1.4.3 指示菌的活化

將保藏的4種指示菌接種于相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行活化，其中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，蠟樣芽孢桿菌使用肉湯瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌使用枯草芽孢桿菌常用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后挑選生長狀況較好的菌落接入新的培養(yǎng)基上，重復(fù)進(jìn)行上述步驟3次，從而得到生長良好的菌落，然后挑選生長狀況較好的菌落各接入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，放于搖床中37 ℃培養(yǎng)12 h后，取出備用。

1.4.4 抑菌實(shí)驗

在無菌環(huán)境下，用生理鹽水將4種指示菌液的濃度分別稀釋為10-1、10-2、10-3和10-4，分別吸取100 μL 10-3、10-4濃度的菌液并滴加在相應(yīng)的培養(yǎng)基上并涂布均勻，其中大腸桿菌菌液和金黃色葡萄球菌菌液滴加在LB培養(yǎng)基上，枯草芽孢桿菌菌液滴加在枯草芽孢桿菌常用培養(yǎng)基上，蠟樣芽孢桿菌菌液滴加在肉湯瓊脂培養(yǎng)基上。然后將直徑為1 cm的打孔器在酒精燈的火焰上燒熱滅菌，冷卻后，在每個培養(yǎng)基上各打3個孔，分別注射200 μL的甘薯葉活性抑菌物質(zhì)提取液、石榴葉活性抑菌物質(zhì)提取液和無菌水，且將甘薯葉活性抑菌物質(zhì)的提取液和石榴葉活性抑菌物質(zhì)的提取液按照1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1的比例分別進(jìn)行復(fù)配，同時培養(yǎng)基所打孔中注射的活性抑菌液為按以上的比例混合均勻的復(fù)配液，37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察抑菌效果并測量抑菌圈的直徑。重復(fù)實(shí)驗3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，抑菌液中僅甘薯葉提取物對枯草芽孢桿菌無抑菌效果，其余提取液均有抑菌效果，且石榴葉提取液的抑菌圈均大于甘薯葉提取液。當(dāng)復(fù)配液為4∶6時，僅對大腸桿菌有最大的抑菌圈，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑均小于石榴葉提取液的抑菌圈，而當(dāng)復(fù)配液比例為2∶8時，其對于4種指示菌的抑菌圈均大于石榴葉提取液的抑菌圈。表1所有抑菌液中甘薯葉提取液∶石榴葉提取液比例為2∶8復(fù)配液具有最佳的抑菌效果。

表1 不同種類提取液對供試菌種的抑菌圈直徑（單位：cm）

3 結(jié)論

本實(shí)驗表明了抑菌活性大小順序為甘薯葉提取液∶石榴葉提取液比例為2∶8復(fù)配液＞石榴葉提取液＞甘薯葉提取液。由于本實(shí)驗所用指示菌為常見的食品加工污染菌，故對植物源防腐劑的研發(fā)具有一定的意義。但要將石榴葉與甘薯葉的活性抗菌物質(zhì)提取液應(yīng)用到食品防腐上時，由于蒸發(fā)濃縮時不能保證甲醇完全被蒸發(fā)，而且甲醇對人體有危害，應(yīng)將提取溶劑換為對人體危害小且提取效果相似的其他溶劑。