和耀威 黃靜 向準(zhǔn) 熊雪 李鵬 楊彝華

(貴州省生物研究所，貴州 貴陽(yáng) 550009)

黑木耳(Auricularia heimuer)是國(guó)內(nèi)外最常食用的真菌之一，在食用菌中具有極高的地位，也是中國(guó)實(shí)現(xiàn)人工栽培最早的食用菌[1]，栽培方式有段木栽培和代料栽培，口感良好，味道鮮美，其所含的多糖作為重要的活性成分，能夠降低血脂和血糖、增強(qiáng)人體免疫力及起到抗氧化的作用[2-4]，是生活中健康營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的良好來(lái)源，也是食、藥兩用的珍稀食用菌[5]；因其適宜生長(zhǎng)范圍廣泛，國(guó)內(nèi)外都具有良好的市場(chǎng)潛力；其在國(guó)內(nèi)脫貧攻堅(jiān)中起了良好的作用，目前處于脫貧攻堅(jiān)與鄉(xiāng)村振興有效銜接的階段，黑木耳也定能發(fā)揮重要的作用。對(duì)于引進(jìn)的菌株，在不同的環(huán)境下其生長(zhǎng)所需的條件會(huì)有所不同，因此本文通過(guò)對(duì)其生物學(xué)特性的研究，及時(shí)掌握其最適生長(zhǎng)條件，旨在為其走向市場(chǎng)并大范圍推廣奠定基礎(chǔ)，降低示范推廣風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

供試黑木耳菌株來(lái)源見表1。

1.1.2 PDA培養(yǎng)基

上海博微生物科技有限公司生產(chǎn)的250g規(guī)格產(chǎn)品。

1.1.3 固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基

20g瓊脂，20g葡萄糖，2g硫酸銨，1g磷酸二氫鉀，0.5g七水硫酸鎂，10mg維生素B1，去離子水1000mL。

1.1.4 液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基

1g磷酸二氫鉀，0.5g七水硫酸鎂，10mg維生素B1，去離子水1000mL。

表1 黑木耳供試品種

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

制備12個(gè)PDA培養(yǎng)基，按照超凈工作臺(tái)試驗(yàn)規(guī)程將母種從試管轉(zhuǎn)接到備用平板PDA培養(yǎng)基中心位置，供試菌株分別轉(zhuǎn)接3個(gè)平板，接種后放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7～10d備用。

1.2.2 拮抗試驗(yàn)

將4個(gè)菌株每2個(gè)為1組進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。在超凈工作臺(tái)采用5mm的打孔器將菌落打成圓片或用接種刀切成大小一致的菌塊，按照“：”形在平板上進(jìn)行接種，兩兩間距保持相等，約為3cm。放置在25℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7d，觀察兩兩之間的拮抗情況。

1.2.3 溫度試驗(yàn)

選取菌絲長(zhǎng)勢(shì)均勻且長(zhǎng)滿的活化平板，用5mm的打孔器在菌落邊緣位置依次打?yàn)閳A片，將圓片轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上并進(jìn)行菌株號(hào)等信息標(biāo)注，將轉(zhuǎn)接平板分別放置在4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，供試菌株不同溫度設(shè)5個(gè)重復(fù)梯度，以2d1次對(duì)菌絲生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察和記錄。

1.2.4 pH試驗(yàn)

在PDA培養(yǎng)基中加入配好的0.1moL·L-1HCL和0.1moL·L-1NaOH，分別調(diào)整pH，分別設(shè)置設(shè)pH為3、4、5、6、7、8、9、10 8個(gè)梯度，每個(gè)梯度5次重復(fù)，按1.2.3溫度試驗(yàn)的選取和接種方法，將轉(zhuǎn)接平板放置在25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，每1個(gè)pH梯度設(shè)5次重復(fù)，每2d對(duì)菌絲生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察和記錄。最終綜合菌落直徑和菌絲濃密情況確定最適pH。

1.2.5 碳源篩選試驗(yàn)

以固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對(duì)照(CK)；試驗(yàn)組，基本培養(yǎng)基中的葡萄糖分別被等量的可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麥麩浸提液、麥芽糖和木屑浸提液取代，作為不同碳源的培養(yǎng)基。每個(gè)處理接種3個(gè)重復(fù)平板。用5mm的打孔器將菌絲長(zhǎng)滿的活化平板在平板邊緣處打成圓盤狀，然后將其接種在平板中心。在25℃下暗培養(yǎng)，每24h觀察1次菌絲的生長(zhǎng)情況，從菌絲發(fā)芽開始，記錄菌絲的發(fā)芽時(shí)間，用“十字”法測(cè)量菌絲的生長(zhǎng)速度。菌絲體的日平均生長(zhǎng)速度則以萌發(fā)后菌落的日平均直徑增長(zhǎng)來(lái)計(jì)算。當(dāng)菌絲體覆蓋滿平板時(shí)，觀察和記錄平板內(nèi)菌落形態(tài)特征、顏色情況、菌絲生長(zhǎng)速度和尖端特征等?！?”和“-”用來(lái)表示菌絲的生長(zhǎng)情況。“+”越多，說(shuō)明菌絲體生長(zhǎng)得越好、越強(qiáng)、越均勻；“-”則表示菌絲無(wú)生長(zhǎng)情況。

1.2.6 氮源篩選試驗(yàn)

對(duì)照組(CK)在固體基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在基本培養(yǎng)基中分別用等量的玉米漿、豆粕粉、酵母粉、尿素、蛋白胨(濃度為3.0g·L-1)代替CK內(nèi)的硫酸銨。每個(gè)氮源培養(yǎng)基設(shè)置3次重復(fù)。用5mm的打孔器將菌絲長(zhǎng)滿的活化平板在平板邊緣處打成圓盤狀，然后將其接種在平板中心。在25℃下觀察菌絲生長(zhǎng)情況。后續(xù)程序?yàn)?.2.5。

1.2.7 最佳碳氮源濃度組合試驗(yàn)

選定適宜碳源木屑浸提液(碳源1)、麥麩浸提液(碳源2)，氮源玉米漿(氮源1)、豆粕粉(氮源2)，采用L9(34)正交表進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，以不含碳源、氮源的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過(guò)不同組合形成供試培養(yǎng)基，見表2。分別以因素(碳源1和2及氮源1和2)開展試驗(yàn)，各因素以含量為梯度設(shè)計(jì)3個(gè)水平，形成9個(gè)試驗(yàn)組，每試驗(yàn)組設(shè)3重復(fù)，接種于250mL錐形瓶，每瓶接種4個(gè)直徑5mm的菌塊，置30℃、150rpm的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)8d，每日觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)、濃密程度、均勻程度、是否污染，最終測(cè)定菌絲生物量。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上所得數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

拮抗試驗(yàn)可以直觀地顯示各菌株種群之間的親緣關(guān)系，當(dāng)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、完全獨(dú)立的雜合或基因型不同的菌株時(shí)，各菌株種群之間會(huì)發(fā)生非親和反應(yīng)，表現(xiàn)出拮抗現(xiàn)象；相反，親緣關(guān)系較近或基因型相同的菌株之間則不會(huì)表現(xiàn)出拮抗現(xiàn)象。由4個(gè)黑木耳菌株的拮抗試驗(yàn)可以看出，見表3，H5和H10之間沒(méi)有表現(xiàn)出拮抗現(xiàn)象，H15和H24之間也無(wú)拮抗現(xiàn)象，說(shuō)明H5和H10親緣關(guān)系近，H15和H24之間親緣關(guān)系也近，而H5和H15、H24之間有拮抗現(xiàn)象，H10和H15、H24之間也有拮抗現(xiàn)象，說(shuō)明H5和H10為一類群，H15和H24為另一類群。

表3 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

2.2 溫度試驗(yàn)結(jié)果

從圖1可看出，供試菌株的菌絲在4℃暗培養(yǎng)時(shí)菌絲受抑制不生長(zhǎng)，當(dāng)溫度為10～35℃溫度梯度內(nèi)則菌絲生長(zhǎng)不受抑制，在10～30℃速度和溫度呈正相關(guān)；H10、H15和H24在30℃時(shí)菌絲長(zhǎng)速最快，之后長(zhǎng)速有所下降，而H5則到35℃時(shí)才達(dá)到最快，但H5菌絲長(zhǎng)速在30℃與35℃間差異極小；綜合以上情況可以看出，供試菌株適宜溫度在30～35℃。

圖1 不同溫度對(duì)供試菌株菌絲長(zhǎng)速的影響

2.3 pH試驗(yàn)結(jié)果

從圖2可以看出，H10和H15 2個(gè)菌株的菌絲在pH 3～10的范圍內(nèi)都可以生長(zhǎng)，而H5和H24則不能在pH 3上生長(zhǎng)，其余梯度可以生長(zhǎng)，說(shuō)明H10和H15 2個(gè)菌株的酸堿度適應(yīng)范圍比H5和H24更大。H15在pH 3時(shí)菌絲長(zhǎng)速最快，其余菌株菌絲在pH 6的堿性條件下日均長(zhǎng)速最快，而且除H15外，其余菌株表現(xiàn)出的長(zhǎng)速變化趨勢(shì)基本一致，表明H15菌株更能適應(yīng)酸性條件。從整體酸堿條件看，在pH4～6內(nèi)的菌絲生長(zhǎng)速度明顯高于pH7～10的區(qū)間，說(shuō)明4個(gè)黑木耳菌株更適宜在偏酸環(huán)境下生長(zhǎng)；pH適宜范圍在5～6。

圖2 不同pH對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 碳源篩選試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)菌株在不同碳源處理中都能正常生長(zhǎng)，且在生長(zhǎng)速度和菌絲長(zhǎng)勢(shì)上不同碳源間存在顯著差異(p<0.05)，4個(gè)菌株在不同碳源下的變化基本一致，菌絲長(zhǎng)速和菌絲長(zhǎng)勢(shì)上都是麥麩浸提液、木屑浸提液和可溶性淀粉三者依次排前3，乳糖和麥芽糖效果墊底。說(shuō)明麥麩浸提液和木屑浸提液更適合作為菌絲培養(yǎng)的碳源，乳糖和麥芽糖則不適宜。

表4 不同碳源對(duì)供試菌株生長(zhǎng)的影響

由表5可以看出，各菌株在6種不同氮源處理中都能生長(zhǎng)，且在菌絲長(zhǎng)速和長(zhǎng)勢(shì)上達(dá)到顯著差異(p<0.05)；但是硫酸銨和尿素作為氮源時(shí)菌絲長(zhǎng)速和長(zhǎng)勢(shì)都表現(xiàn)最差，與其他4種差異大，菌絲長(zhǎng)速很慢，長(zhǎng)勢(shì)差，表明其不適合作為菌絲培養(yǎng)時(shí)氮源添加物；豆粕粉和玉米漿在長(zhǎng)速和長(zhǎng)勢(shì)上排名前2，適合作為菌絲培養(yǎng)時(shí)氮源添加物。

表5 不同氮源對(duì)供試菌株生長(zhǎng)的影響

2.5 最佳碳氮源濃度組合試驗(yàn)結(jié)果

由表6可以看出，4個(gè)供試菌株在2個(gè)碳源和2個(gè)氮源的不同正交組合下均能正常生長(zhǎng)，且所有菌株在組合3下生物量最高，分別為5號(hào)菌株2.91g，10號(hào)菌株2.77g，15號(hào)菌株2.84g，24號(hào)菌株2.89g；與其他組合均達(dá)到顯著差異(p<0.05)，組合1和組合6生物量顯著低于其他組合。通過(guò)對(duì)不同組合下4個(gè)菌株平均生物量的統(tǒng)計(jì)得出圖3，從圖3可以看出，不同組合間生物量達(dá)到顯著差異(p<0.05)，不同組合生物量由高到低為3>7>5>4>8>1>2>9>6，說(shuō)明組合3最適合供試菌株生長(zhǎng)，其次為組合7和組合5等。

表6 不同碳氮源組合對(duì)供試菌株生長(zhǎng)的影響

圖3 不同組合下供試菌株生物量(干重)

3 討論與結(jié)論

在食用菌栽培中，對(duì)菌種基礎(chǔ)生物學(xué)特性研究已經(jīng)有很久的歷史，也是食用菌高質(zhì)量發(fā)展中最基礎(chǔ)最重要的環(huán)節(jié)之一。本文中各供試菌株雖然通過(guò)拮抗實(shí)驗(yàn)被分為2個(gè)類群，但是在菌絲生長(zhǎng)最適溫度和最適pH范圍上高度相近，這可能與供試菌種來(lái)自相同省份，可能存在較為相近的遺傳關(guān)系有關(guān)，具體遺傳關(guān)系需要后續(xù)進(jìn)一步確定；趙梓楠[6]開展的“998”等5個(gè)黑木耳菌種生物學(xué)特性的研究得出，供試菌種最適溫度在25℃左右；李發(fā)盛等[7]開展的“云耳百云6號(hào)”的生物學(xué)特性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，“云耳百云6號(hào)”最適溫度為25～30℃，pH范圍為5.5～6.5，黃豆粉為最佳氮源；郭硯翠等[8]開展的“黑木耳8808”菌株生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，“黑木耳8808”菌株的最適溫度為25～30℃；王燦琴等[9]通過(guò)對(duì)5個(gè)野生云耳菌株生物學(xué)特性的研究發(fā)現(xiàn)，供試菌株最適溫度為30℃，最適酸堿度為pH8～9，最佳氮、碳源分別為酵母膏和葡萄糖；前人相關(guān)研究在溫度上與本研究結(jié)果有所差異，但差異不大，最適pH與李發(fā)盛等研究結(jié)果一致，和王燦琴等研究有所差異，但是具有共性，即供試菌株在最適pH范圍上存在一致性，這也許與來(lái)自同一地方的菌株在某些因子上具有相近的適應(yīng)性有關(guān)，最佳碳源和氮源分別為麥麩浸提液和豆粕粉，和王燦琴等的研究結(jié)果不一致，但是兩者都發(fā)現(xiàn)蔗糖和乳糖不適合作為碳源添加物，硫酸銨不適合作為氮源添加物，在氮源上與李發(fā)盛等研究結(jié)果一致。在最佳碳氮源篩選中，郭硯翠等開展的“黑木耳8808”菌株碳氮源篩選發(fā)現(xiàn)在硬雜木屑、麥麩和豆粉組合中菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌絲黑密，和本研究結(jié)果具有一致性。

通過(guò)對(duì)4個(gè)引進(jìn)的黑木耳菌種進(jìn)行拮抗和基礎(chǔ)生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，供試菌株分為2個(gè)類群，H5和H10為一類群，H15和H24為另一類群，兩類群雖然在遺傳關(guān)系上有差異，但是在最適溫度，最適pH，最佳碳氮源和最佳碳氮源組合上都具有一致性，最適溫度在30～35℃，最適pH為5～6，最佳碳源和氮源為麥麩浸提液和玉米漿，最佳液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基為木屑浸提液23g，麥麩浸提液10g，玉米漿1g，豆粕粉5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，維生素B10.1g，去離子水1000mL。