蔣健 左云 倪晨 朱惠平

在我國(guó)，胃癌發(fā)病率和死亡率分別位于所有惡腫瘤的第2位和第3位[1-2]。因我國(guó)胃癌的早期篩查普及率仍較低，目前臨床上多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期，治療方式主要有姑息手術(shù)、化療、放療、分子靶向治療及不同治療手段聯(lián)合。放療常作為胃癌根治術(shù)后的輔助及姑息治療手段，INT0116研究[3]已證實(shí)可切除胃癌術(shù)后同步放化療可以提高5年生存率并降低復(fù)發(fā)率，這也為胃癌的術(shù)后輔助放化療奠定了基礎(chǔ)。但是在治療過(guò)程中，腫瘤對(duì)放療耐受和抵抗成為制約患者預(yù)后的關(guān)鍵。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是多種實(shí)體腫瘤調(diào)節(jié)血管形成最重要的信號(hào)分子。既往研究顯示，放療與抗血管生成類藥物聯(lián)用可抑制腫瘤細(xì)胞增殖[4]。阿帕替尼是一種口服的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）的小分子酪氨酸激酶抑制劑，主要用于晚期胃癌的治療。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞的放射增敏作用，以期為晚期胃癌的綜合治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及儀器

胃癌細(xì)胞HGC-27購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。阿帕替尼（純度：98%）、CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自以色列BI公司，胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，人VEGF酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（ELISA KIT）購(gòu)自武漢華美公司，兔抗人磷酸化組蛋白H2AX抗體、羊抗兔IgG購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自江蘇凱基公司，AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒、流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，正置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司，直線加速器購(gòu)自美國(guó)瓦里安公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及照射方法

HGC-27細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將處理好的細(xì)胞培養(yǎng)皿置于1.5 cm厚有機(jī)玻璃板上，以6 MV-X射線對(duì)細(xì)胞進(jìn)行垂直照射，源皮距為100 cm，框架角度為180°，劑量率為450 cGy/min。

1.3 ELISA法檢測(cè)HGC-27細(xì)胞中VEGF的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HGC-27細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，分別給予不同劑量（2 Gy、4 Gy、6 Gy、10 Gy、20 Gy）照射后，繼續(xù)培養(yǎng)18 h、24 h、48 h，取各組細(xì)胞上清液；對(duì)照組細(xì)胞不做處理（0 Gy）。然后將各組上清液分別加入包被有VEGF抗體的酶標(biāo)板中，按照ELISA試劑盒檢測(cè)方法進(jìn)行操作，并根據(jù)各樣本的吸光度（A）值，分別計(jì)算出各組細(xì)胞VEGF的分泌量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 CCK-8檢測(cè)HGC-27細(xì)胞的增殖能力

1.4.1 不同濃度阿帕替尼對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖能力的影響 實(shí)驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組和藥物組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC-27細(xì)胞，用胰酶消化后制成濃度為5×103/μL細(xì)胞懸液，對(duì)照組和藥物組分別取100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中，空白組僅加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁后，藥物組更換為預(yù)先用RPMI-1640培養(yǎng)基配置的不同濃度（5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L）阿帕替尼溶液。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的A值，并根據(jù)A值計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率，以及不同時(shí)間點(diǎn)的50%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制濃度（IC50）。細(xì)胞增殖抑制率（%）=[1-（藥物組A值-空白組A值）/（對(duì)照組A值-空白組A值）]×100%。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4.2 阿帕替尼聯(lián)合不同劑量照射對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖能力的影響 實(shí)驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組、單照組（2 Gy、6 Gy照射）和聯(lián)合組（10 μmol/L阿帕替尼分別聯(lián)合2 Gy、6 Gy照射）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC-27細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，空白組僅加入100 μL培養(yǎng)基，其他組按2×104/孔的細(xì)胞濃度接種于96孔板中；待細(xì)胞貼壁后更換溶液，空白組、對(duì)照組和單照組細(xì)胞分別添加RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，聯(lián)合組細(xì)胞添加10 μmol/L的阿帕替尼培養(yǎng)。24 h后，單照組和聯(lián)合組分別置于2 Gy和6 Gy的X線下照射，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的A值。相對(duì)細(xì)胞活性（%）=[（單照組或聯(lián)合組A值-空白組A值）/（對(duì)照組A值-空白組A值）]×100%。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HGC-27細(xì)胞的凋亡能力和細(xì)胞周期

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、單照組（2 Gy、6 Gy照射）和聯(lián)合組（10μmol/L阿帕替尼分別聯(lián)合2 Gy、6 Gy照射）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC-27細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按5×105/孔的密度接種于6孔板中。待細(xì)胞貼壁后更換溶液，對(duì)照組和單照組細(xì)胞中加入RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，聯(lián)合組細(xì)胞中加入10 μmol/L阿帕替尼培養(yǎng)；24 h后，單照組和聯(lián)合組分別置于2 Gy和6 Gy的X線下照射，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組細(xì)胞用胰酶消化、PBS沖洗后，各取部分細(xì)胞分別用PBS重懸為1×106/mL的單細(xì)胞懸液，然后根據(jù)FITC Annexin V/PI雙染法試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；各組另一部分細(xì)胞分別用PBS重懸為1×106/mL的單細(xì)胞懸液后，加入75%冰乙醇并置于-20℃冰箱中固定過(guò)夜，再根據(jù)PI單染法試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)HGC-27細(xì)胞中γ-H2AX的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、6 Gy單照組和6 Gy聯(lián)合組（10 μmol/L阿帕替尼聯(lián)合6 Gy照射）。3組細(xì)胞的處理措施同方法1.5。6 Gy單照組和6 Gy聯(lián)合組細(xì)胞均在6 Gy的X線下照射，并分別于照射1 h、24 h時(shí)收集細(xì)胞。用PBS漂洗細(xì)胞3次后，加入預(yù)冷的4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次；用0.5% Triton-100通透孵育10 min，PBS漂洗3次；滴加免疫熒光染色專用封閉液，封閉15 min，加入γ-H2AX抗體（一抗），4℃下孵育過(guò)夜；用PBS洗滌，滴加羊抗兔IgG（熒光二抗），再用PBS漂洗3次；用含DAPI抗熒光淬滅封片劑封片，在正置熒光顯微鏡下觀察核內(nèi)焦點(diǎn)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，后續(xù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度阿帕替尼對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度（5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L）阿帕替尼對(duì)HGC-27細(xì)胞均有增殖抑制作用，且與5 μmol/L組相比，其余濃度組隨著阿帕替尼藥物濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，相應(yīng)的細(xì)胞增殖抑制率逐漸增強(qiáng)（均P＜0.05），見(jiàn)表1。阿帕替尼作用24 h、48 h和72 h的IC50分別為14.12 μmol/L、11.32 μmol/L和8.69 μmol/L，為保證一定量的存活細(xì)胞，本研究選擇10 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用藥濃度，觀察時(shí)間點(diǎn)選取24 h。

表1 不同濃度阿帕替尼對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effect of different concentration Apatinib on the proliferation of HGC-27 cells(±s)

表1 不同濃度阿帕替尼對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effect of different concentration Apatinib on the proliferation of HGC-27 cells(±s)

aP＜0.05,compared with 5 μmol/L;bP＜0.05,compared with 10 μmol/L;cP＜0.05,compared with 15 μmol/L

Apatinib(μmol/L)0 5 1 0 15 20 n 3 3 3 3 3 Inhibition rate(%)24 h 0 12.58±2.72 23.21±3.83 53.07±3.88ab 73.20±11.27abc 48 h 0 16.55±7.24 35.28±8.44a 63.60±6.38ab 85.54±6.77abc 72 h 0 25.75±3.55 51.23±8.67a 77.29±7.29ab 89.73±9.43abc

2.2 不同照射劑量對(duì)HGC-27細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同劑量（2 Gy、4 Gy、6 Gy、10 Gy和20 Gy）分別照射18 h、24 h和48 h后HGC-27細(xì)胞中的VEGF分泌量均顯著增加，且隨著照射劑量升高和照射時(shí)間延長(zhǎng)，VEGF分泌越明顯（均P＜0.01），見(jiàn)圖1。各時(shí)間點(diǎn)曲線中，VEGF的表達(dá)均在10 Gy時(shí)上升最明顯，然后逐漸趨于平穩(wěn)，故選擇2 Gy和6 Gy進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同照射劑量下HGC-27細(xì)胞的VEGF表達(dá)水平Fig.1 Expression level of VEGF in HGC-27 cells under different doses of irradiation

2.3 阿帕替尼聯(lián)合不同劑量照射對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，2 Gy單照組、2 Gy聯(lián)合組、6 Gy單照組和6 Gy聯(lián)合組的細(xì)胞增殖率分別為95.67%±1.53%、62.00%±3.00%、88.67%±2.08%、43.00%±3.06%，其中6 Gy單照組的細(xì)胞增殖率低于2 Gy單照組（t=3.431，P=0.009）；2 Gy聯(lián)合組和6 Gy聯(lián)合組的細(xì)胞增殖率均低于相應(yīng)單照組（t=16.495，22.538，均P＜0.001），且 6 Gy聯(lián)合組的增殖率低于2 Gy聯(lián)合組（t=25.968，P＜0.001）。表明不同劑量照射均可降低細(xì)胞增殖能力，阿帕替尼能增強(qiáng)放射線對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖2 阿帕替尼對(duì)不同劑量照射下HGC-27細(xì)胞增殖的影響（±s）Fig.2 Effect of Apatinib on the proliferation of HGC-27 cells under different doses of irradiation

2.4 阿帕替尼聯(lián)合不同劑量照射對(duì)HGC-27細(xì)胞凋亡和周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、2 Gy單照組、2 Gy聯(lián)合組、6 Gy單照組和6 Gy聯(lián)合組細(xì)胞的凋亡率分別為1.20%±0.26%、4.40%±0.80%、14.80%±1.15%、7.20%±1.14%、20.10%±1.25%，G2/M期細(xì)胞比例分別為10.50%±0.82%、15.10%±1.54%、33.00%±1.59%、22.90%±2.17%、40.70%±1.37%，其中單照組及聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.01），聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率高于相應(yīng)單照組（均P＜0.001），且6 Gy聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率高于2 Gy聯(lián)合組（P＜0.001），見(jiàn)圖3；聯(lián)合組滯留于G2/M期的細(xì)胞比例明顯高于單照組（均P＜0.001），且6 Gy聯(lián)合組的G2/M期細(xì)胞比例高于2 Gy聯(lián)合組（P＜0.001），見(jiàn)圖4。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿帕替尼能夠增強(qiáng)照射導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡并促使照射后的細(xì)胞更多的停滯于G2/M期，且高劑量聯(lián)合組細(xì)胞的凋亡率和G2/M期細(xì)胞比例更高。

圖3 阿帕替尼對(duì)不同劑量照射下HGC-27細(xì)胞凋亡的影響（±s）Fig.3 Effect of Apatinib on apoptosis of HGC-27 cells under different doses of irradiation

圖4 阿帕替尼對(duì)不同劑量照射下HGC-27細(xì)胞周期的影響（±s）Fig.4 Effect of Apatinib on HGC-27 cell cycle under different doses of irradiation

2.5 阿帕替尼聯(lián)合不同劑量照射對(duì)HGC-27細(xì)胞中γ-H2AX表達(dá)的影響

免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，照射1 h后，6 Gy單照組和6 Gy聯(lián)合組細(xì)胞均可見(jiàn)γ-H2AX核內(nèi)焦點(diǎn)出現(xiàn)，隨后6 Gy單照組的核內(nèi)焦點(diǎn)逐漸減少且在24 h后達(dá)到照射前水平，而6 Gy聯(lián)合組的核內(nèi)焦點(diǎn)淬滅延遲，24 h后仍未恢復(fù)到照射前水平。說(shuō)明阿帕替尼可干擾照射誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks，DSBs）修復(fù)。

圖5 阿帕替尼聯(lián)合照射對(duì)HGC-27細(xì)胞中γ-H2AX表達(dá)的影響（×200）Fig.5 Effect of Apatinib combined with radiation on expression of γ-H2AX in HGC-27 cells(×200)

3 討論

放療是胃癌綜合治療的重要組成部分，但是大多數(shù)實(shí)體腫瘤中存在一定比例的乏氧細(xì)胞，這部分細(xì)胞因?qū)ι渚€有抗拒作用而限制了放療效果，因此選擇合適的放療增敏劑尤為重要。多項(xiàng)國(guó)內(nèi)外臨床研究結(jié)果顯示放療聯(lián)合化療在局部進(jìn)展期、轉(zhuǎn)移性晚期胃癌中對(duì)比單純化療能明顯減少局部復(fù)發(fā)并延長(zhǎng)生存期[5-6]。胃癌放療的劑量及分割方式目前尚無(wú)明確的標(biāo)準(zhǔn)，綜合多項(xiàng)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)分次1.8～2.0 Gy/d，每周5次，總劑量50～60Gy的常規(guī)分割方式與單次3～8 Gy，總劑量30～40 Gy的大分割方式或立體定向放療均能帶來(lái)顯著的療效，且患者均可耐受[7-9]。研究表明，輻射可誘導(dǎo)VEGF表達(dá)增加并激活其受體VEGFR，然后正向調(diào)控腫瘤血管生成，且VEGFR-2較VEGFR-1和VEGFR-3能更顯著增強(qiáng)激酶活性，促使腫瘤細(xì)胞增殖，并通過(guò)多種途徑導(dǎo)致放射敏感性下降[10]。FLICKINGER等[11]用不同劑量（0～10 Gy）單次照射犬黑色素瘤細(xì)胞系，結(jié)果顯示VEGF濃度呈劑量依賴性增加，且在8 Gy和10 Gy時(shí)最明顯，但VEGFR-2的表達(dá)隨劑量升高而下調(diào)。在食管癌、非小細(xì)胞肺癌、腦膠質(zhì)瘤、肝癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)，高選擇性VEGFR-2抑制劑阿帕替尼可有效增強(qiáng)其放射敏感性[12-15]。本研究選取 2 Gy、4 Gy、6 Gy、10 Gy、20 Gy等劑量X線對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行單次照射，發(fā)現(xiàn)單次大劑量照射（＞2 Gy）較2 Gy左右的常規(guī)分割方式更能促進(jìn)VEGF表達(dá)，且在10 Gy時(shí)上升最為明顯，進(jìn)一步證實(shí)輻射可增強(qiáng)VEGF表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成，降低放療敏感性。進(jìn)一步選取10 μmol/L阿帕替尼聯(lián)合不同劑量（2 Gy、6 Gy）照射HGC-27細(xì)胞，結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用較單照組明顯增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率及G2/M期的細(xì)胞比例均高于對(duì)照組及單照組，且高劑量聯(lián)合組表現(xiàn)出更強(qiáng)的作用，說(shuō)明阿帕替尼具有良好的增敏作用，聯(lián)合放療可以進(jìn)一步抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且高劑量輻射可能與阿帕替尼有更好的協(xié)同作用。

電離輻射可誘導(dǎo)真核生物中的DSBs，當(dāng)DSBs形成細(xì)胞即可啟動(dòng)損傷修復(fù)機(jī)制。γ-H2AX是細(xì)胞DNA損傷斷裂后形成的磷酸化染色質(zhì)核小體組蛋白，是電離輻射誘導(dǎo)DNA-DSB的敏感標(biāo)志物，與DSB修復(fù)能力相關(guān)，通常修復(fù)缺陷的細(xì)胞對(duì)放療表現(xiàn)出更高的敏感性[16-17]。在肝癌細(xì)胞研究中，LIAO等[15]發(fā)現(xiàn)阿帕替尼可降低細(xì)胞DNA損傷修復(fù)活性，無(wú)論是單照組還是放療聯(lián)合阿帕替尼組，幾乎所有肝癌細(xì)胞均在照射1 h后出現(xiàn)γ-H2AX焦點(diǎn)，24 h后聯(lián)合組的γ-H2AX焦點(diǎn)明顯增多。γ-H2AX識(shí)別抗體免疫熒光法是檢測(cè)電離輻射致DNA雙鏈斷裂的一項(xiàng)技術(shù)，可利用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，以激光共聚焦顯微鏡為硬件設(shè)備，通過(guò)檢測(cè)γ-H2AX的量反映細(xì)胞的DSBs情況。本研究對(duì)γ-H2AX進(jìn)行熒光標(biāo)記亦觀察到放療1 h后胃癌細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)形成，24 h后核內(nèi)焦點(diǎn)逐漸減少，且聯(lián)合組中γ-H2AX焦點(diǎn)淬滅明顯較單照組延遲，說(shuō)明阿帕替尼可能通過(guò)干擾輻射誘導(dǎo)的DSBs修復(fù)，從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的放療敏感性。

綜上所述，阿帕替尼可增強(qiáng)胃癌HGC-27細(xì)胞的放射敏感性，聯(lián)合放療可增強(qiáng)HGC-27細(xì)胞的增殖抑制能力和細(xì)胞凋亡能力，同時(shí)促使細(xì)胞阻滯于G2/M期，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控γ-H2AX表達(dá)而影響DNA雙鏈修復(fù)實(shí)現(xiàn)，這一結(jié)果為改善胃癌的放療療效提供了新的策略。