歐陽(yáng)祝，談安群，周琦，易鑫，程玉嬌，黃林華，王華*

1(西南大學(xué)柑桔研究所，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶,400712)2(國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶,400712)

柑橘是世界上第一大宗水果，其品種主要有甜橙、寬皮柑橘、柚、檸檬和雜柑等[1]。柑橘果皮作為柑橘鮮食和加工的主要副產(chǎn)物，富含類黃酮、香豆素、膳食纖維等多種活性物質(zhì)[2]。其中柚皮苷是柑橘果皮中最為常見(jiàn)的黃酮類物質(zhì)之一[3]。柚皮苷是由4′,5,7-三羥基二氫黃酮苷元與鼠李糖苷[2-O-(6-脫氧-α-L-甘露聚糖)-β-D-葡萄糖]構(gòu)成的化合物[4](圖1-a)，具有抗癌[5]、抗氧化[6]、抗炎[7]、降低膽固醇[8]等多種生物藥理活性，具有作為人類膳食補(bǔ)充劑和畜禽天然抗生素的潛力。

目前，已有較為成熟的技術(shù)將柑橘皮渣中的柚皮苷提取并純化，但由于其溶解度較低，味道偏苦，很少被直接使用，因此提高柚皮苷的溶解度，增加其生物利用度顯得尤為重要。研究表明將活性成分與環(huán)糊精、環(huán)果糖、殼寡糖、磷脂等配體分子間通過(guò)共價(jià)鍵或氫鍵結(jié)合，可改善天然產(chǎn)物的溶解性[9]。殼寡糖是由2～20個(gè)氨基葡萄糖通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成的糖鏈(圖1-b)，具有良好的生物降解、抗氧化和抑菌活性[10-11]。研究報(bào)道殼寡糖的分子質(zhì)量是影響其功能性質(zhì)的主要因素[12]，分子質(zhì)量<1 000 Da和>3 000 Da的殼寡糖功能活性存在很大差異[13]。CAO等[14]采用噴霧干燥和冷凍干燥的方法制備蘆丁-殼寡糖復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)其能增加蘆丁的溶解性和抗氧化活性。WANG等[15]采用低分子質(zhì)量殼寡糖制備三苯基膦-殼寡糖-姜黃素偶聯(lián)物，發(fā)現(xiàn)其能去除急性肝損傷期間產(chǎn)生的過(guò)多活性氧，減輕氧化應(yīng)激損傷。BI等[16]采用平均分子質(zhì)量為1 500的殼寡糖制備殼寡糖香葉醇衍生物，結(jié)果表明其有良好的水溶性，可抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，可作為新型抑菌劑用于食品防腐。目前關(guān)于柚皮苷與殼寡糖復(fù)合物的制備及其功能活性的探究鮮有報(bào)道。

a-柚皮苷；b-殼寡糖圖1 柚皮苷和殼寡糖的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of naringin and oligochitosan

為了提高柚皮苷原有功能活性，增加其溶解度和生物利用度。本文以柚皮苷和殼寡糖為原料，按一定比例分別制備柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物和柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物，分析比較兩類(共計(jì)10種)復(fù)合物與柚皮苷的溶解度、抗氧化和抑菌活性，確定適宜殼寡糖分子質(zhì)量和混合比例。以期為柚皮苷在醫(yī)療保健、膳食補(bǔ)充和畜禽飼料方面的研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為柑橘果皮的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柚皮苷、鄰菲羅啉、殼寡糖A(分子質(zhì)量2 000～3 000 Da)、殼寡糖B(分子質(zhì)量800～1 000 Da)(純度>97%)，上海源葉生物科技有限公司；DPPH、FeSO4、磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，重慶市北碚區(qū)旭科化學(xué)試劑經(jīng)營(yíng)部；大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)，重慶市寶欣泰生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate3000高效液相色譜儀，美國(guó)戴安公司；BRUKER TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)布魯克；Phenom Pro掃描電鏡，荷蘭飛納；X′Pert3 Powder X射線衍射儀，荷蘭帕納特；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；3020-352酶標(biāo)儀，賽默飛；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 柚皮苷-殼寡糖復(fù)合物的制備

稱取柚皮苷2.32 g，殼寡糖A 6 g，分別溶于適量95%乙醇中，將兩者等量混合，渦旋振蕩5 min。復(fù)合物在45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分溶劑，于60 ℃真空干燥，粉碎過(guò)篩[17]即得柚皮苷與殼寡糖A物質(zhì)的量比為2∶1的柚皮苷-殼寡糖復(fù)合物A。按上述方法分別制得物質(zhì)的量比為1∶1、1∶2、1∶3和1∶5的柚皮苷-殼寡糖復(fù)合物B、C、D、E。同時(shí)制備柚皮苷與殼寡糖B的復(fù)合物a、b、c、d、e。

1.3.2 掃描電鏡分析

在銅板上黏貼導(dǎo)電膠，取適量60 ℃真空干燥樣品于導(dǎo)電膠上噴金處理后，在300倍率的條件下用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察柚皮苷、殼寡糖A、殼寡糖B和復(fù)合物晶體形態(tài)，確定是否形成復(fù)合物。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

取適量柚皮苷、殼寡糖A、殼寡糖B、柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物和柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物與KBr以質(zhì)量比1∶200混合壓片，將壓片好的樣品于傅里葉紅外光譜儀上進(jìn)行500～4 500 cm-1的檢測(cè)。

1.3.4 X射線衍射分析

將樣品均勻鋪放X射線衍射儀衍射槽內(nèi)，在掃描范圍2θ=5～60°，步長(zhǎng)0.02°，電流40 mA，電壓40 kV的條件下測(cè)定樣品結(jié)晶度。

1.3.5 溶解度的測(cè)定

將柚皮苷分別與殼寡糖A、殼寡糖B按物質(zhì)的量1∶1混合制成物理混合物，分別將過(guò)量樣品和混合物溶于超純水中，渦旋振蕩5 min，37 ℃下振蕩溶解24 h后于4 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行HPLC分析。溶解量為測(cè)得柚皮苷含量與溶液應(yīng)有柚皮苷含量比。

檢測(cè)條件：Venusil MPC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相1%冰乙酸(A)～甲醇(B)；進(jìn)樣量10 μL；流速1 mL/min。

1.3.6 抗氧化活性分析

將柚皮苷、殼寡糖A、殼寡糖B、柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物和柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物溶于蒸餾水中，制成1.0 g/L的樣品溶液，參考XU等[18]的方法對(duì)樣品DPPH自由基、·OH和ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性進(jìn)行測(cè)定，并用1.0 g/L 抗壞血酸溶液作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.7 抑菌活性分析

1.3.7.1 實(shí)驗(yàn)菌液制備

抑菌實(shí)驗(yàn)參考李莉等[19]的方法，將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌于瓊脂平板培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h活化后，培養(yǎng)稀釋至106CFU/mL的菌液作為實(shí)驗(yàn)菌液。

1.3.7.2 樣品抑菌液配制

將柚皮苷、殼寡糖A、殼寡糖B、柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物、柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物和土霉素用無(wú)菌水倍比稀釋，配制質(zhì)量濃度為320、160、80、40、20、10、5、2.5 mg/mL的抑菌液。

1.3.7.3 無(wú)菌濾紙片的制備

將濾紙制成直徑為6 mm的紙片，121 ℃高壓滅菌15 min后，分別浸泡于20 mg/mL柚皮苷、復(fù)合物及土霉素溶液中12 h備用。

1.3.7.4 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

取1.3.7.1制備好的實(shí)驗(yàn)菌液50 μL均勻涂布在瓊脂平板上，將浸泡后的濾紙片鋪于瓊脂平板上，每個(gè)平板4片，做好標(biāo)記，間距均勻。用土霉素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，普通濾紙片為陰性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。

1.3.7.5 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)實(shí)驗(yàn)

在96孔板上設(shè)置實(shí)驗(yàn)孔為50 μL培養(yǎng)基+10 μL實(shí)驗(yàn)菌液+60 μL不同濃度樣品抑菌液；陽(yáng)性對(duì)照孔為50 μL培養(yǎng)基+10 μL實(shí)驗(yàn)菌液+60 μL不同濃度土霉素溶液；陰性對(duì)照孔為110 μL培養(yǎng)基+10 μL實(shí)驗(yàn)菌液；培養(yǎng)基對(duì)照孔為120 μL培養(yǎng)基；抑菌液對(duì)照孔為120 μL不同濃度樣品抑菌液；空白對(duì)照孔為60 μL培養(yǎng)基+60 μL不同濃度樣品抑菌液。每組平行4個(gè)孔取平均值。用酶標(biāo)儀在630 nm處測(cè)定各孔吸光度值，并結(jié)合肉眼觀察確定各抑菌液最低抑菌濃度。

1.3.7.6 最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的各孔培養(yǎng)液各50 μL，涂布于瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察有無(wú)菌落長(zhǎng)出，平板上菌落數(shù)少于5個(gè)的最小稀釋度的抑菌液濃度為最低殺菌濃度。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2018和ChemDraw17.0處理作圖；采用Excel 2019和SPSS 26.0對(duì)抗氧化和抑菌能力進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，ANOVA進(jìn)行Duncan差異分析；所有樣品平行實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描電鏡分析

將復(fù)合物通過(guò)噴金處理后，在場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察其形態(tài)。由圖2可知，柚皮苷顆粒呈棒狀結(jié)晶，而殼寡糖顆粒均呈空心的球狀結(jié)構(gòu)，且殼寡糖A晶體較殼寡糖B晶體大。柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物和柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物呈不規(guī)則多面體結(jié)構(gòu)，且柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物晶體較柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物晶體大，兩者相比柚皮苷和殼寡糖晶體形態(tài)發(fā)生了明顯變化，且未在復(fù)合物掃描電鏡圖中發(fā)現(xiàn)柚皮苷或殼寡糖的晶體。

圖2 柚皮苷、殼寡糖及其復(fù)合物掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrographs of naringin, chitooligosaccharide and its complexes 注：a-柚皮苷；b-殼寡糖A；c-殼寡糖B；d、e、f、g、h為復(fù)合物A、B、C、D、E；i、j、k、l、m為復(fù)合物a、b、c、d、e(圖3同)

此外，柚皮苷晶體原有的顏色為淡黃色，而復(fù)合物晶體顏色為均勻的深棕色或深褐色(圖3)。以上結(jié)果表明，柚皮苷與殼寡糖在乙醇溶劑中相互結(jié)合反應(yīng)形成了新的復(fù)合物。

圖3 柚皮苷、殼寡糖及其復(fù)合物圖片F(xiàn)ig.3 Pictures of naringin, chitooligosaccharide and its complexes

2.2 傅里葉紅外光譜分析

1-柚皮苷；2-殼寡糖A；3～7-復(fù)合物A～E圖4 柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物傅里葉紅外光譜分析圖Fig.4 Fourier infrared spectroscopic analysis of naringin-chitooligosaccharide A complex

1-柚皮苷；2-殼寡糖B；3～7-復(fù)合物a～e圖5 柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物傅里葉紅外光譜分析圖Fig.5 Fourier infrared spectroscopic analysis of naringin-chitooligosaccharide B complex

2.3 X射線衍射分析

X射線衍射是分析材料晶體結(jié)構(gòu)或形態(tài)的常用技術(shù)[24],將復(fù)合物置于衍射槽內(nèi)，在2θ=5～60°掃描，其掃描結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7，柚皮苷在2θ為5～30°時(shí)具有一系列尖銳、強(qiáng)烈的特征衍射峰，符合其晶體特性[25]。2種分子質(zhì)量的殼寡糖均無(wú)尖銳的特征峰，衍射圖譜呈現(xiàn)寬峰，證明了殼寡糖非晶體的性質(zhì)。在柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物中，復(fù)合物A在2θ為9.19、9.87、15.12、15.68、25.46°有尖銳的特征峰，與柚皮苷相對(duì)比其大多數(shù)特征峰消失。同理，在柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物中，復(fù)合物a在2θ為9.25、9.91、15.16、15.71、20.08、21.08、25.48°有尖銳的特征峰，復(fù)合物b在2θ為15.16、15.75°有尖銳的特征峰。此外，其余復(fù)合物(復(fù)合物B、復(fù)合物C、復(fù)合物D、復(fù)合物E、復(fù)合物c、復(fù)合物d、復(fù)合物e)的衍射圖譜和殼寡糖相似，且柚皮苷的特征峰幾乎全部消失，表明柚皮苷分散于殼寡糖分子中，結(jié)晶度降低或消失[26]。

1-柚皮苷；2-殼寡糖A；3～7-復(fù)合物A～E圖6 柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物X射線衍射圖譜Fig.6 X-ray diffraction pattern of naringin- chitooligosaccharide A complex

1-柚皮苷；2-殼寡糖B；3～7-復(fù)合物a～e圖7 柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物X射線衍射圖譜Fig.7 X-ray diffraction pattern of naringin- chitooligosaccharide B complex

2.4 不同比例復(fù)合物的溶解度比較

取復(fù)合物溶解，經(jīng)振搖24 h后發(fā)現(xiàn)柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物的溶解性較差，有沉淀沉于底部。柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物的溶解性較好，基本全部溶解。采用HPLC對(duì)柚皮苷具體溶解性進(jìn)行分析，利用柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行外標(biāo)法定量分析，得到柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=23.651X-5.301(R2=0.999)。根據(jù)復(fù)合物中柚皮苷含量與高效液相色譜測(cè)得的柚皮苷含量計(jì)算柚皮苷溶解度。由圖8可得，在復(fù)合物中，物質(zhì)的量比為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5的柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物中柚皮苷的溶解度分別為柚皮苷的36.4、14.9、56.2、85.5、80.9倍。而物質(zhì)的量比為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5的柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物中柚皮苷的溶解度是柚皮苷的9.8、15.9、18.1、48.9、53.3倍。相比于柚皮苷，復(fù)合物中柚皮苷的溶解度顯著增加，且柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物中柚皮苷的溶解度優(yōu)于柚皮苷-殼寡糖B。此外，復(fù)合物中柚皮苷的溶解度隨殼寡糖比例的增加而上升，這可能是由于殼寡糖打亂柚皮苷的原有結(jié)晶，使其結(jié)晶度降低從而提高其溶解度[27]。

圖8 柚皮苷-殼寡糖A、柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物 在水中的溶解度Fig.8 Solubility of naringin-chitooligosaccharide A and naringin-chitooligosaccharide B complexes in water

2.5 抗氧化分析

通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定復(fù)合物對(duì)DPPH自由基、·OH和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率。由圖9-a、圖9-b可得，柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物對(duì)DPPH自由基的清除率(59.52%～74.34%)和柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物對(duì)DPPH自由基的清除率(57.66%～86.97%)相對(duì)于柚皮苷對(duì)DPPH自由基的清除率20.13%顯著提高。由圖9-c、圖9-d可得，除復(fù)合物a外柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物對(duì)·OH的清除率(16.87%～50.42%)和柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物對(duì)·OH的清除率(10.81%～42.23%)與柚皮苷對(duì)·OH的清除率(13.70%)相比，均有所增加。由圖9-e、圖9-f可得，除復(fù)合物D和復(fù)合物E外柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率(10.33%～19.68%)和柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率(13.22%～20.70%)與柚皮苷對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率(12.78%)相比，均有所增加，但增加的程度較DPPH自由基和·OH低。對(duì)DPPH自由基、·OH和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率大小為：復(fù)合物A>復(fù)合物B>復(fù)合物C>復(fù)合物D>復(fù)合物E，復(fù)合物e>復(fù)合物d>復(fù)合物c>復(fù)合物b>復(fù)合物a。雖然殼寡糖A的抗氧化活性低于殼寡糖B，但就整體而言柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物、柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物的抗氧化活性相差不大，且相比于單一柚皮苷均有所提高。已有研究表明，類黃酮的抗氧化活性與其分子中羥基的個(gè)數(shù)和位置有關(guān)[28]，引入殼寡糖分子中羥基從而提高了復(fù)合物抗氧化能力[29]。

2.6 抑菌活性分析

通過(guò)制備復(fù)合物藥敏紙片，測(cè)定復(fù)合物對(duì)3種常見(jiàn)致病菌的抑菌效果。抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，陰性對(duì)照為藥敏紙片直徑，柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物對(duì)大腸桿菌抑制作用明顯，鼠傷寒沙門氏菌次之，對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用較小。在柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物中，復(fù)合物E抑菌效果最為明顯；在柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物中，復(fù)合物d抑菌效果最為明顯。總體而言，復(fù)合物增加了柚皮苷對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。復(fù)合物抑菌效果的增加可能是由于其能與細(xì)菌相互作用，破壞其細(xì)胞膜，使胞內(nèi)成分釋放[26, 29]。柚皮苷-殼寡糖A復(fù)合物對(duì)大腸桿菌的抑制效果更明顯；柚皮苷-殼寡糖B對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果更明顯，兩類復(fù)合物對(duì)沙門氏菌的抑菌效果相當(dāng)。柚皮苷對(duì)沙門氏菌的抑菌效果明顯，復(fù)合物多數(shù)未能增加其對(duì)沙門氏菌的抑菌效果。

a、b-DPPH自由基清除率；c、d-·OH清除率；e、f-ABTS陽(yáng)離子自由基清除率圖9 柚皮苷-殼寡糖A、柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物的抗氧化活性Fig.9 Antioxidant activity of naringin-chitooligosaccharide A and naringin-chitooligosaccharide B complexes

表1 柚皮苷-殼寡糖A、柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物 對(duì)3種致病菌抑菌活性 單位：%

培養(yǎng)24 h后觀察各孔澄清度，若肉眼可見(jiàn)渾濁，且有白色沉淀，則表明有細(xì)菌大量生長(zhǎng)，抑菌效果較差。結(jié)果如表2所示，培養(yǎng)基對(duì)照孔和土霉素對(duì)照孔均保持原有顏色，澄清無(wú)菌落生長(zhǎng)。當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)5 mg/mL時(shí)，復(fù)合物C、復(fù)合物E、復(fù)合物c、復(fù)合物d對(duì)鼠傷寒沙門氏菌有明顯抑制作用，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)10 mg/mL時(shí)，除復(fù)合物b外均對(duì)鼠傷寒沙門氏菌有明顯抑制作用。復(fù)合物b在藥物質(zhì)量濃度達(dá)20 mg/mL時(shí)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌有明顯抑制作用。

表2 柚皮苷-殼寡糖A、柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物 對(duì)鼠傷寒沙門氏菌抑制效果Table 2 Inhibitory effect of naringin-chitooligosaccharide A and naringin-chitooligosaccharide B complexes on Salmonella typhimurium

復(fù)合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果如表3所示，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)5 mg/mL時(shí)，復(fù)合物B、復(fù)合物D、復(fù)合物d對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)10 mg/mL時(shí)，除復(fù)合物c外其余復(fù)合物均對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)20 mg/mL時(shí)，復(fù)合物c對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用。

表3 柚皮苷-殼寡糖A、柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物 對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果Table 3 Inhibitory effect of naringin-chitooligosaccharide A and naringin-chitooligosaccharide B complexes on Staphylococcus aureus

復(fù)合物對(duì)大腸桿菌的抑制效果如表4所示，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，復(fù)合物D、復(fù)合物E對(duì)大腸桿菌有明顯抑制作用，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)10 mg/mL時(shí)，復(fù)合物A、復(fù)合物d、復(fù)合物e對(duì)大腸桿菌有明顯抑制作用，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)20 mg/mL時(shí)，復(fù)合物a對(duì)大腸桿菌菌有明顯抑制作用。當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)40 mg/mL時(shí)，復(fù)合物B、復(fù)合物C、復(fù)合物b、復(fù)合物c對(duì)大腸桿菌有明顯抑制作用。

根據(jù)上述肉眼觀察并結(jié)合吸光度值測(cè)定結(jié)果，測(cè)定10種復(fù)合物對(duì)3種常見(jiàn)致病菌的MIC和MBC結(jié)果如表5所示，結(jié)合進(jìn)一步培養(yǎng)觀察，測(cè)得復(fù)合物d對(duì)大腸桿菌的MBC為40 mg/mL，復(fù)合物E及復(fù)合物d對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC為80 mg/mL，復(fù)合物D和復(fù)合物e對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的MBC為40 mg/mL，復(fù)合物A、復(fù)合物E、復(fù)合物d對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的MBC為80 mg/mL。由于藥物濃度限制，其余復(fù)合物對(duì)致病菌的MBC并未測(cè)出。復(fù)合物A、復(fù)合物B、復(fù)合物C、復(fù)合物a、復(fù)合物b、復(fù)合物c的殺菌作用較弱。柚皮苷在質(zhì)量濃度160 mg/mL時(shí)對(duì)3種致病菌具有明顯的抑制作用，在320 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，未測(cè)得其MBC。推測(cè)可能是由于殼寡糖比例的增加，增加了復(fù)合物的殺菌效果，使復(fù)合物MBC較柚皮苷有所下降。

表4 柚皮苷-殼寡糖A、柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物 對(duì)大腸桿菌抑制效果Table 4 Inhibitory effect of naringin-chitooligosaccharide A and naringin-chitooligosaccharide B complexes on Escherichia coli

表5 柚皮苷-殼寡糖A、柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物 對(duì)3種致病菌的MIC及MBCTable 5 MIC and MBC of naringin-chitooligosaccharide A and naringin-chitooligosaccharide B complexes against three pathogens

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用殼寡糖A(分子質(zhì)量2 000～3 000 Da)和殼寡糖B(分子質(zhì)量800～1 000 Da)，制備不同比例的柚皮苷-殼寡糖復(fù)合物，通過(guò)掃描電鏡、紅外光譜和X射線衍射分析比較柚皮苷、柚皮苷-殼寡糖A和柚皮苷-殼寡糖B復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征和溶解度，并分析比較其抗氧化、抑菌活性。柚皮苷與兩類殼寡糖通過(guò)氫鍵或范德華力等非共價(jià)鍵形成穩(wěn)定復(fù)合物。經(jīng)過(guò)HPLC分析復(fù)合物的水溶性，柚皮苷-殼寡糖復(fù)合物在原有柚皮苷的溶解度上提高約54.8倍。復(fù)合物比柚皮苷具有更好的抗氧化活性。復(fù)合物對(duì)自由基的清除率強(qiáng)弱為DPPH自由基>·OH>ABTS陽(yáng)離子自由基。其中復(fù)合物A和復(fù)合物e的抗氧化活性最高。此外，復(fù)合物也增加了柚皮苷對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑制效果，且復(fù)合物D、復(fù)合物E、復(fù)合物d和復(fù)合物e對(duì)致病菌有一定的殺菌效果，是潛在的抑菌劑。綜上，柚皮苷與殼寡糖A在比例為2∶1時(shí)形成的復(fù)合物，抗氧化活性最佳；在比例1∶3和1∶5時(shí)形成的復(fù)合物，柚皮苷溶出率和抑菌活性最佳。柚皮苷與殼寡糖B在比例1∶3和1∶5時(shí)形成的復(fù)合物，其柚皮苷溶出率、抗氧化和抑菌活性均最佳。該研究為柚皮苷在畜禽飼料領(lǐng)域、生物醫(yī)療領(lǐng)域和功能保健食品等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供新思路。