謝文靜 江裕 陳溶微 林丹琪 馬國斌

【摘要】 目的 探討血清微小RNA223（miR-223）、微小RNA155（miR-155）檢驗對小兒肺炎支原體感染的診斷價值，為其臨床診治提供參考。

方法 選擇福州市第二醫(yī)院2019年2月至2020年12月收治的100例小兒肺炎支原體感染患兒（觀察組）作為研究對象，另取同期體檢的50名健康兒童作為對照組。比較兩組受試者血清降鈣素原（PCT）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素6（IL-6）及miR-223、miR-155水平，采用Pearson法對血清miR-223、miR-155水平與PCT、CRP、IL-6水平的相關(guān)性進(jìn)行分析，并通過受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-223、miR-155檢驗對小兒肺炎支原體感染的診斷價值。

結(jié)果 觀察組患兒血清miR-223、miR-155表達(dá)及PCT、CRP、IL-6水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，小兒肺炎支原體感染患者血清miR-223、miR-155水平與血清PCT、CRP、IL-6呈正相關(guān)（P<0.05）。經(jīng)ROC分析顯示，miR-223+miR-155的AUC為0.926，明顯高于miR-223和miR-155（P<0.05）;且miR-223與miR-155的截斷值分別為11.29、4.35。

結(jié)論 miR-223與miR-155在小兒肺炎支原體感染患者中均呈現(xiàn)高表達(dá)，且與血清PCT、CRP、IL-6水平呈正相關(guān)，對小兒肺炎支原體感染具有較高的臨床診斷價值，初步證實(shí)了miR-223與miR-155具有成為預(yù)防小兒肺炎支原體肺炎新靶點(diǎn)的潛力。

【關(guān)鍵詞】 miR-223;miR-155;小兒肺炎支原體感染;診斷

中圖分類號：R563.1+5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.04.006

Analysis of diagnostic value of serum miR-223 and miR-155 tests in children with Mycoplasma pneumoniae infection

XIE Wenjinga， JIANG Yua， CHEN Rongweia， LIN Danqia， MA Guobinb▲

（a.Department of Laboratory Medicine， b. Department of Cardiology， The Second Hospital of Fuzhou City， Fuzhou 350007， Fujian， China）

【Abstract】 Objective To explore the diagnostic value of serum microRNA223 （miR-223） and microRNA155 （miR-155） tests in children with Mycoplasma pneumoniae infection， so as to provide reference for its clinical diagnosis and treatment.

Methods 100 children with Mycoplasma pneumoniae infection admitted to The Second Hospital of Fuzhou City from February 2019 to December 2020 were selected as research objects （observation group）， and 50 healthy children who came to hospital for physical examination during the same period were selected as control group. And then， the serum levels of procalcitonin （PCT）， C-reactive protein （CRP）， interleukin 6 （IL-6）， miR-223 and miR-155 were compared between the two groups. Pearson method was used to analyze correlation between serum miR-223， miR-155 levels and PCT， CRP， IL-6 levels. And the diagnostic value of serum miR-223 and miR-155 in children with Mycoplasma pneumoniae infection was analyzed by receiver operating characteristic （ROC） curve.

Results The expression of serum miR-223， miR-155 and the levels of PCT， CRP and IL-6 in the observation group were significantly higher than those in the control group， and difference was statistically significant（P<0.05）. Pearson correlation analysis showed that serum miR-223 and miR-155 levels in children with Mycoplasma pneumoniae infection were positively correlated with serum PCT， CRP， and IL-6 （P<0.05）. ROC analysis showed that the AUC of miR-223+miR-155 was 0.926， significantly higher than that of miR-223 and miR-155 （P<0.05）. And the cutoff values of miR-223 and miR-155 were 11.29 and 4.35， respectively.

Conclusion Both miR-223 and miR-155 are highly expressed in children with Mycoplasma pneumoniae infection， and are positively correlated with serum PCT， CRP and IL-6 levels， they have high clinical diagnostic values for children with Mycoplasma pneumoniae infection， which have been preliminarily confirmed to have the potential to become new targets for the prevention of MPP.

【Key words】 miR-223; miR-155; children with Mycoplasma pneumoniae infection; diagnosis

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae）感染引起的小兒肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是一種臨床較為常見的獲得性肺部感染性疾病，全年均可發(fā)病，且發(fā)病率最高的季節(jié)為秋冬季[1]。調(diào)查顯示[2]，兒童獲得性肺炎中，MPP占比25%左右。主要以厭食、咳嗽、咽痛、發(fā)熱及畏寒等為臨床表現(xiàn)，可致使患兒出現(xiàn)神經(jīng)損傷、扁桃體發(fā)炎及中耳炎等，對患兒身體的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，嚴(yán)重者甚至可造成死亡。支原體感染是其主要發(fā)病機(jī)制，支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之中的微生物，通過對支原體感染情況進(jìn)行檢測，制定相應(yīng)方案對癥治療具有一定療效[3]。目前臨床上主要通過微生物培養(yǎng)和血清學(xué)檢查對疾病進(jìn)行診斷，雖方便快捷，但準(zhǔn)確率仍未達(dá)到預(yù)期。微小RNA是一種長度在20～24 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，其通過對特異性mRNA分子進(jìn)行降解或者抑制，從而對基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控進(jìn)行介導(dǎo)，在細(xì)胞多種生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，與諸多疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。近年來有研究顯示[4～5]，MPP患兒體內(nèi)存在部分miRNA的異常表達(dá)，基因組學(xué)檢測結(jié)果也間接證實(shí)了miRNA異常表達(dá)有可能作為MPP診斷的潛在標(biāo)志物。故探討血清微小RNA223（miR-223）、微小RNA155（miR-155）檢驗對小兒肺炎支原體感染的診斷價值具有重要意義，可為其臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2019年2月至2020年12月收治的100例小兒肺炎支原體感染患兒作為研究對象，另取同期來我院體檢的50名健康兒童作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①觀察組符合《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識（2015 版）》中關(guān)于MPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];②無心包炎、心肌炎及哮喘等相關(guān)炎性疾病者;③入院前未進(jìn)行大環(huán)內(nèi)酯類抗生素或者類固醇激素治療者;④臨床資料完整者;⑤研究經(jīng)本院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)實(shí)施（180612）;⑥患兒家屬同意并簽署知情協(xié)議書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重智力障礙或者精神疾病者;②合并肺部器質(zhì)性病變及內(nèi)外科其他嚴(yán)重疾病者;③合并先天性心臟病、支氣管發(fā)育不良等先天性疾病;④合并敗血病、吸入性肺炎者;⑤細(xì)菌、病毒及衣原體等呼吸系統(tǒng)疾病;⑥依從性差，中途退出者。

對照組男35人，女15人，年齡2～8歲，平均（4.36±0.26）歲;觀察組男68例，女32例，年齡2～9歲，平均（4.51±0.24）歲，病程（2.76±0.35）d，春季38例，夏季6例，秋季40例，冬季16例。兩組受試者在年齡、性別等一般資料方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血清PCT、CRP、IL-6水平

抽取兩組受試者清晨5 mL的空腹靜脈血，離心機(jī)（LB-3000型號，江蘇克萊斯克生物技術(shù)有限公司）在3000 r/min的條件下離心15min，取上清-75℃條件下冰箱保存，待用。采用免疫比濁法對血清C反應(yīng)蛋白（CRP）水平進(jìn)行測定;通過酶標(biāo)儀（ST-380型，上?？迫A實(shí)驗系統(tǒng)有限公司），采用酶聯(lián)免疫吸附法對血清白細(xì)胞介素6（IL-6）水平進(jìn)行測定;通過全自動熒光免疫分析儀（DISKFLU，四川微康樸瀾醫(yī)療科技有限責(zé)任公司）對血清降鈣素原（PCT）水平進(jìn)行測定，試劑盒均購于武漢賽培生物科技有限公司，具體操作方法嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.2.2 血清miR-223、miR-155水平

采用Trizol試劑（貨號MN562J2，美國Sigma公司）對患兒的血清總RNA進(jìn)行提取，RNA的純度和濃度采用分光光度計（UV3672，美國Sigma公司）進(jìn)行測定，RNA完整性采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗。之后以RNA為模板，通過PrimeScript RT reagent試劑盒（ND6527J，北京中衫金橋公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，具體操作按照說明書執(zhí)行。以cDNA為模板，通過SYBR Premix ExTaq試劑盒（N5643MJ，美國Sigma公司）進(jìn)行PCR反應(yīng)檢驗。反應(yīng)體系20 μL：4.0 μL 的ddH2O，2.0 μL的上下游引物，2.0 μL的cDNA模板（25 ng/μL），10.0 μL的2UltraSYBR mixture。反應(yīng)條件：95℃條件下，預(yù)變性30 s;95℃條件下，變性5 s;60℃條件下，退火30 s;72℃條件下，延伸20 s;共進(jìn)行40個循環(huán)。引物由百奧邁科生物技術(shù)公司設(shè)計提供，U6作為miR-155、miR-223的內(nèi)參基因，具體見表1。之后血清中的miR-155、miR-223相對表達(dá)水平采用2-△△Ct法進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，服從正態(tài)分布的計量資料描述為（±s），比較行配對t檢驗（組內(nèi)比較）或成組t檢驗（組間比較）;計數(shù)資料以例數(shù)描述，比較行χ2檢驗;采用Pearson法對血清miR-223、miR-155水平與PCT、CRP、IL-6水平的相關(guān)性進(jìn)行分析，并通過受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-223、miR-155檢驗對小兒肺炎支原體感染的診斷價值，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)? 果

2.1 兩組受試者血清miR-223、miR-155水平

觀察組患兒血清miR-223、miR-155表達(dá)水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。見表2。

2.2 兩組受試者血清PCT、CRP、IL-6水平

觀察組患兒血清PCT、CRP、IL-6水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。見表3。

2.3 肺炎支原體感染患兒血清miR-223、miR-155水平與PCT、CRP、IL-6的相關(guān)性

經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析，肺炎支原體感染患兒血清miR-223、miR-155水平與血清PCT、CRP、IL-6呈正相關(guān)（P<0.05）。見表4。

2.4 血清 miR-223 與 miR-155 對小兒肺炎支原體感染的診斷價值

經(jīng)ROC分析顯示，miR-223+miR-155的AUC為0.926，明顯高于miR-223和miR-155（P<0.05）。見表5、圖1。且此時miR-223與miR-155的截斷值分別為11.29、4.35，并以此截斷值作為診斷MPP的標(biāo)準(zhǔn)，高于上述截斷值即為陽性。

3 討? 論

近些年隨著對MPP研究的不斷深入，越來越多的研究證實(shí)細(xì)胞免疫及體液免疫中存在大量的炎癥因子，對MPP的發(fā)病起到重要介導(dǎo)作用[7～8]。而患兒因自身免疫系統(tǒng)防疫能力相對較差，炎癥因子在支原體感染過程中的炎癥反應(yīng)和免疫發(fā)生機(jī)制仍存在一定程度的爭議，需要進(jìn)一步探討。而對于PCT、CRP、IL-6值及相關(guān)性分析結(jié)果，這可能是由于miRNA對介質(zhì)及炎癥因子表達(dá)均具有一定程度的調(diào)控作用。血清miR-223、miR-155是近年新發(fā)現(xiàn)的微小RNA，可通過對下游PCT、CRP、IL-6等炎癥因子的表達(dá)產(chǎn)生影響，從而對相應(yīng)疾病的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用。田偉等人[9]研究證實(shí)，miR-155可參與體內(nèi)免疫應(yīng)答反應(yīng)，在T淋巴細(xì)胞免疫抑制反應(yīng)中作用顯著，對肺炎的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)效果。LI等[10]研究顯示，在MPP血清中miR-223、miR-155也呈現(xiàn)高表達(dá)，是造成MPP發(fā)病的獨(dú)立危險因素。以上研究均與本研究結(jié)果相符。

miRNA靶向主要是通過miRNA5端與mRNA的非翻譯區(qū)和編碼區(qū)內(nèi)的位點(diǎn)之間特異性堿基對相互作用來完成的[11]。且miRNA在維持人體正常免疫穩(wěn)態(tài)、正常功能以及免疫細(xì)胞譜系的成熟、分化及發(fā)生中扮演著重要的角色。有研究顯示[12]，miR-223、miR-155在支原體感染肺炎模型小鼠、肺炎繼發(fā)膿毒癥患者中均具有較高的診斷價值。故而推測miR-223、miR-155的異常表達(dá)可致使小兒肺炎支原體感染的發(fā)生。而本研究對肺炎支原體感染患兒miR-223、miR-155水平表達(dá)進(jìn)行探討，并與微生物培養(yǎng)診斷相比較，以期尋找快速、有效、準(zhǔn)確的MPP診斷新方法。顏保松等[13]研究顯示，與健康人相比，肺結(jié)核患者的血清miR-223水平相對較高，且對肺結(jié)核具有顯著的診斷價值。文中血清miR-223水平結(jié)果，提示miR-223可能與MPP的發(fā)生發(fā)展存在一定相關(guān)性。這主要是由于miR-223可以對下游的IL-10、IL-6等炎癥因子表達(dá)產(chǎn)生影響，從而對MPP疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定的促進(jìn)作用。而文中血清miR-155水平結(jié)果也驗證了miR-155在MPP發(fā)病中的作用。這可能是由于miR-155可通過對中性粒細(xì)胞趨化因子（CCL3、CXCL2）以及IL-6的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化，進(jìn)而造成肺部損傷。另外，其還可通過對巨噬細(xì)胞內(nèi)核因子κB活性進(jìn)行增強(qiáng)，提高相關(guān)促炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而造成MPP疾病的發(fā)生。而經(jīng)ROC分析顯示，miR-223與miR-155的截斷值分別為11.29、4.35，且聯(lián)合的陽性診斷率明顯高于微生物培養(yǎng)檢測，提示miR-223+miR-155對MPP具有更高的診斷價值，miR-223與miR-155可能成為預(yù)防和治療MPP的潛在靶點(diǎn)和標(biāo)志物。

綜上所述，miR-223與miR-155在小兒肺炎支原體感染患者中均呈現(xiàn)高表達(dá)，且與血清PCT、CRP、IL-6水平呈正相關(guān)，對小兒肺炎支原體感染具有較高的臨床診斷價值，初步證實(shí)了miR-223與miR-155具有成為預(yù)防小兒肺炎支原體肺炎新靶點(diǎn)的潛力。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-12-28 修回日期：2022-03-01）

（編輯：潘明志）