元麗花

摘 要：為了解草魚Ctenopharyngodon idellus養(yǎng)殖過程中維氏氣單胞菌Aeromonas veronii的流行季節(jié)及不同時期維氏氣單胞菌毒力基因攜帶情況及防治方法，從福建省順昌縣某養(yǎng)殖場患病草魚肝臟、腎臟、脾臟等組織分離得到7株致病菌進行研究。通過細菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢、生化鑒定、毒力基因、藥敏試驗、16S rRNA與gyrB基因測序?qū)Ψ蛛x菌株進行分析。結(jié)果顯示，從草魚體內(nèi)分離到的7株致病菌在培養(yǎng)基中呈圓形、表面濕潤光滑、邊緣整齊的淡黃色菌落;菌落周圍呈β-溶血;革蘭氏鏡檢呈陰性短桿菌;16S rRNA 、gyrB基因序列分析結(jié)合生化鑒定及質(zhì)譜鑒定，鑒定結(jié)果均為維氏氣單胞菌;8種毒力基因擴增結(jié)果顯示，分離菌株均攜帶Lip 、Act、aerA、Alt、Exu及Fla 6種毒力基因;藥敏試驗結(jié)果顯示，各菌株對8種抗菌藥物敏感性一致，對鹽酸土霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺甲噁唑、磺胺二甲氧嘧啶、交沙霉素及恩諾沙星7種藥物相對敏感，對氨芐西林鈉、硫酸新霉素、磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、強力霉素及紅霉素6種藥物相對耐藥。

關(guān)鍵詞：草魚;維氏氣單胞菌;毒力基因;藥敏試驗

中圖分類號：S 917.1?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2022）03-0013-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2022.03.003

Analysis on the Virulence Genes and Drug Resistance of Aeromonas veroniiin Ctenopharyngodon idellus

YUAN Li-hua

（Fujian Station of Fishery Technology Eextension， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract： In order to understand the epidemic season of Aeromonas veronii and the virulence gene carrying situation of Aeromonas veronii in different periods and its prevention and control methods during the aquaculture process of Ctenopharyngodon idellus， seven strains of pathogenic bacteria were isolated from the tissues of diseased Ctenopharyngodon idellus， such as liver， kidney， and spleen in the aquaculture farm of Shunchang County， Fujian Province. The isolated strains were analyzed by using the bacterial isolation & culture， gram staining microscopic examination， biochemical identification， virulence genes， drug sensitivity test， 16S rRNA and gyrB gene sequencing. The results showed that the seven pathogenic bacteria isolated from Ctenopharyngodon idellus showed the round yellowish bacterial colony with smooth moist surface and neat edge in the culture medium. β-hemolysis was observed around the colony， and the gram staining microscopic examination showed the negative brevibacterium. Through the 16S rRNA and gyrB gene sequencing analysis combined with the biochemical identification and mass spectrum identification， the identification results were all Aeromonas veronii. The PCR result of the eight kinds of virulence genes showed that all the isolated strains all carried 6 kinds of virulence genes including Lip， Act， aerA， Alt， Exu and Fla. The results of drug sensitivity test showed that all the strains had the same sensitivity to the eight kinds of antibiotics， and were relatively sensitive to the seven kinds of antibiotics， such as oxytetracycline hydrochloride， thiamphenicol， flufenicol， sulfamethoxazole， sulfadimethoxine， josamycin and enrofloxacin， while were relatively resistant to the six kinds of antibiotics， such as ampicillin sodium， neomycin sulfate， sulfadiazine， sulfamonomethoxine， doxycycline and erythromycin.

Key words： Ctenopharyngodon idellus; Aeromonas veronii; Virulence genes; Drug sensitivity test

草魚是我國重要的淡水經(jīng)濟魚類，產(chǎn)量占淡水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量的1/5，是我國淡水養(yǎng)殖魚類中產(chǎn)量最大的品種[1]。我國草魚養(yǎng)殖主體仍采用傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式，由于養(yǎng)殖密度過大以及缺乏科學(xué)的管理，草魚病害問題日益凸顯，給養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟損失[2]。維氏氣單胞菌隸屬弧菌科、氣單胞菌屬，在環(huán)境中廣泛存在，特別是水體環(huán)境[3]，是一種條件致病菌，當草魚免疫力降低或體表有創(chuàng)傷時更容易感染，主要癥狀為體表潰爛、出血、腸炎、腹水，嚴重時可引起較高的死亡率[4-5]。維氏氣單胞菌攜帶多種毒力基因，多種毒力基因的共同作用會造成魚體損傷、死亡，因此對維氏氣單胞菌引起的水產(chǎn)養(yǎng)殖病害應(yīng)高度重視[6]。本研究在1～12月對福建省順昌縣某養(yǎng)殖場維氏氣單胞菌的發(fā)病情況進行監(jiān)測。監(jiān)測結(jié)果表明，維氏氣單胞菌的發(fā)病季節(jié)為8月至10月，與維氏氣單胞菌流行季節(jié)相符，患病草魚主要癥狀為體表出血、潰爛、肝臟腫大、腹水及腸炎，與維氏氣單胞菌感染特征一致。本試驗對分離得到的7株草魚源致病菌進行培養(yǎng)鑒定、毒力基因檢測和抗菌藥物敏感性分析，旨在探索不同時期草魚源維氏氣單胞菌毒力基因攜帶情況，并依據(jù)藥敏試驗結(jié)果為草魚養(yǎng)殖過程中維氏氣單胞菌的防控和治療提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病草魚樣品取自福建省順昌縣某養(yǎng)殖場，體重（1 000±50）g，體長（25±5）cm。大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）及綿羊血瓊脂培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;革蘭氏染色液試劑盒購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;細菌鑒定生化試劑條ID 32E購自生物梅里埃美國股份有限公司;PCR premix試劑盒、核酸提取試劑盒均購自寶生物工程有限公司;引物由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成;藥物敏感性試驗所需原料藥由全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離純化 無菌操作從瀕死的患病草魚肝臟、腎臟及脾臟蘸取組織，用無菌環(huán)分別劃線接種于TSA培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落劃線接種于TSA培養(yǎng)基，得到純培養(yǎng)菌落。挑取單個純培養(yǎng)菌落于TSB培養(yǎng)基中28℃恒溫震蕩培養(yǎng)18～24 h后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細菌形態(tài)觀察及生理生化鑒定 從純培養(yǎng)后的TSA培養(yǎng)基上挑取生長良好的單個菌落于載玻片上進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài);取純培養(yǎng)后的單個菌落劃線接種于血瓊脂平板，觀察其溶血性，并從血瓊脂平板上挑取單個菌落進行ID 32E生化鑒定，37℃培養(yǎng)24 h后，使用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)進行菌株的生化鑒定。

1.2.3 細菌16S rRNA及gyr B基因序列分析 取純化菌液，按照核酸提取試劑盒說明書提取DNA作為PCR擴增模板。16S rRNA及gyr B基因引物信息見表1，引物均由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成。16S rRNA PCR反應(yīng)體系（共50 uL）為：DNA 2 uL，上下游引物（10 umol·L-1）各1.5 uL，Premix Taq預(yù)混試劑 25 uL，ddH2O 20 uL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min 20 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)，最后72℃再延伸5 min，4℃保溫[7]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將陽性產(chǎn)物送至福州尚亞生物技術(shù)有限公司進行測序，并將測得的基因序列在NCBI中進行同源性比對分析。

1.2.4 菌株質(zhì)譜鑒定 將純化后的菌株劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h后挑選單個菌落均勻涂布于靶板，待干燥后加基質(zhì)液覆蓋，通過VITEK MS Plus質(zhì)譜儀進行菌株鑒定。

1.2.5 毒力基因序檢測 參照Nawaz等[8]方法，以提取的DNA為模板，通過PCR擴增對細胞毒性腸毒素（Act）、氣溶素（aerA）、脂酶（Lip）、核酶（Exu）、鞭毛（Fla）、絲氨酸蛋白酶（Ser）、熱不穩(wěn)定性腸毒素（Alt）、溶血素（hlyA）等毒力基因進行檢測，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。引物序列信息及擴增片段大小見表1。

1.2.6 藥物敏感性試驗 藥物敏感性試驗采用96孔板微量肉湯稀釋法。挑取單個菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫搖床培養(yǎng)24 h制備為菌懸液。將14種抗生素藥物配制成200 ug·L-1的濃度;按照倍比稀釋法將抗菌藥物稀釋至第11孔，形成11個藥物梯度;再依次加入濃度為106 CFU·mL-1的菌懸液;每種藥物做2個平行;28℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察各孔培養(yǎng)液中細菌的生長情況，以抑制細菌生長的藥物最高稀釋度作為供試藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)及生理生化特征分析

分離菌株在TSA上形成圓形、表面濕潤光滑、邊緣整齊的淡黃色菌落（圖1）;在綿羊血瓊脂平板上可見半透明、邊緣整齊的灰白色菌落，菌落周圍產(chǎn)生β-溶血環(huán)（圖2）;革蘭氏染色鏡檢為兩端鈍圓的陰性短桿菌（圖3）;分離得到的菌株生化鑒定結(jié)果見表2，與標準菌株的符合概率為99%，鑒定結(jié)果為維氏氣單胞菌;各菌株質(zhì)譜鑒定出現(xiàn)相同的特征峰（圖4），質(zhì)譜鑒定結(jié)果為維氏氣單胞菌。結(jié)合細菌形態(tài)和生理生化結(jié)果，7株菌株初步判定為維氏氣單胞菌。

2.2 16S rRNA及gyrB基因序列分析

PCR擴增得到的16S rRNA目的條帶大小約1 500 bp，看家基因gyrB大小約746 bp，與預(yù)期擴增條帶一致。將測序所得序列在NCBI中進行同源性比對，結(jié)果顯示，分離菌株16S rRNA及gyrB基因與維氏氣單胞菌同源性均>99%。結(jié)合分離菌株形態(tài)特征、生理生化鑒定、質(zhì)譜鑒定（圖4）、16S rRNA及gyrB基因序列分析，最終確定分離菌株為維氏氣單胞菌。

2.3 毒力基因檢測

由表3可知，分離7個菌株的Lip 、Act、aerA、Alt、Exu及Fla毒力基因PCR擴增結(jié)果條帶大小與預(yù)期片段相符，檢出率為100%;對hlyA毒力基因的攜帶則表現(xiàn)不同，檢出率為71.43%，均未攜帶Ser毒力基因。

2.4 藥物敏感性試驗

采用微量肉湯稀釋法（96孔板）測定分離菌株對14種抗生素類藥物的敏感性，結(jié)果見表4。由測定結(jié)果可知，分離菌株均對鹽酸土霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺甲噁唑、磺胺二甲氧嘧啶、恩諾沙星及交沙霉素7個藥物相對敏感，對氨芐西林鈉、硫酸新霉素、磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、強力霉素及紅霉素6種藥物相對耐藥，對鹽酸環(huán)丙沙星表現(xiàn)為中介。

3 討論與結(jié)論

維氏氣單胞菌是一種人、獸、水生動物共患的條件致病菌，淡水魚感染后可引起出血、腸炎、腹水等癥狀，人感染后可引起敗血癥、腸胃炎、腹膜炎等疾病[9-11]，現(xiàn)已被國家列為食品和水體安全的檢測對象。本研究在1月至12月對福建省順昌縣某養(yǎng)殖場草魚源維氏氣單胞菌發(fā)病情況進行監(jiān)測，結(jié)果表明魚源維氏氣單胞菌發(fā)病時間為8月至10月，發(fā)病特征為體表出血、潰爛、肝臟腫大、腹水及腸炎，與維氏氣單胞菌的流行季節(jié)及流行特征一致。從患病草魚體內(nèi)共分離到7株維氏氣單胞菌，菌株形態(tài)與高彩霞等[12]、覃華斌等[13]研究結(jié)果一致，與斑點叉尾鮰[14]、克氏原螯蝦[15]等品種上分離到的維氏氣單胞菌細菌形態(tài)也表現(xiàn)出一致性，這說明不同地區(qū)及不同品種的維氏氣單胞菌培養(yǎng)特性無明顯差異。

16S rRNA基因序列分析是細菌種屬鑒定的常用方法，大約有2 500個種的16S rRNA全序列已經(jīng)被報道。但16S rRNA基因序列具有高度保守性，包含的信息量較少，在區(qū)分親緣關(guān)系較近的菌株準確性較差，存在一定的局限性[16]。gyrB基因是普遍存在于細菌內(nèi)編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的基因，是蛋白編碼基因的典型代表，不會發(fā)生頻繁的水平轉(zhuǎn)移，在不同的蛋白及蛋白的不同位點，其氨基酸替代率也不同，在區(qū)分親緣關(guān)系較近的菌株更加準確。質(zhì)譜鑒定通過分析分子離子的質(zhì)量電荷比（m/z）來鑒定和定量檢測分子，將不同種微生物經(jīng)質(zhì)譜分析所形成的質(zhì)量圖譜與數(shù)據(jù)庫中的參考圖譜進行比較， 從而實現(xiàn)對目標微生物種或菌株的區(qū)分和鑒定，與傳統(tǒng)的生化表型鑒定方法和分子生物學(xué)方法相比，質(zhì)譜鑒定具有操作簡單、快速、準確和經(jīng)濟的特點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域。為保證試驗結(jié)果的準確性，本研究采用16S rRNA及gyrB基因進行序列分析，結(jié)合生理生化鑒定及質(zhì)譜鑒定確定分離菌株為維氏氣單胞菌。

毒力基因常作為細菌毒力強弱的判斷標準之一，維氏氣單胞菌能產(chǎn)生Act、aerA、Fla、Alt、Lip等多種毒力基因[17]，其強致病性與毒力基因的種類、數(shù)量及復(fù)雜的致病機制存在一定的相關(guān)性。本試驗檢測了維氏氣單胞菌的8種毒力基因，其中aerA能改變細胞膜的通透性，使宿主細胞凋亡，可引起宿主內(nèi)臟器官與體表出血，是維氏氣單胞菌有無致病性的標志之一[18-19];Fla基因是細菌的重要毒力因子，參與細菌的吸附、侵襲與定植，進而引起草魚腸炎[20];hlyA可導(dǎo)致宿主細胞的滲透性裂解和完全溶血，在維氏氣單胞菌的致病過程中起到關(guān)鍵的作用[21];Lip能溶解宿主脂質(zhì)，參與宿主細胞膜的變化;Act、Alt可引發(fā)細胞凋亡。毒力基因檢測結(jié)果顯示，8月至10月分離得到的維氏氣單胞菌Lip、Act、aerA、Alt、Exu及Fla6種毒力基因檢出率為100%，hlyA毒力基因檢出率為71.43%。本研究患病草魚出現(xiàn)體表出血及腸炎等癥狀，與患病草魚攜帶aerA、Fla等毒力基因密切相關(guān);患病草魚均有腹水的癥狀，但未見資料表明是由某個毒力基因引發(fā)的，可能是多種毒力基因協(xié)同作用的結(jié)果;在不同月份分離到的菌株在hlyA毒力基因上有所差異，未呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，但對草魚的致病性基本一致，這與各菌株含有多種毒力基因且致病機制復(fù)雜有關(guān)，個別毒力基因的差異并不能明顯表現(xiàn)出各菌株致病性的差異;各菌株均未攜帶Ser毒力基因，與張飄等[22]研究結(jié)果不一致，這可能是由于不同地區(qū)分離得到的菌株所攜帶的毒力基因有所差異。

由藥敏試驗結(jié)果可知，7株菌株對14種抗生素類藥物的敏感性無明顯差異，均對鹽酸土霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺甲噁唑、磺胺二甲氧嘧啶、恩諾沙星及交沙霉素7個藥物相對敏感，對氨芐西林鈉、硫酸新霉素、磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、強力霉素及紅霉素6種藥物相對耐藥，這表明在同一養(yǎng)殖場不同月份分離到的菌株對同一種抗生素類藥物的敏感性是一致的。致病菌株的藥物敏感性與養(yǎng)殖地區(qū)、養(yǎng)殖環(huán)境及用藥習(xí)慣有很大關(guān)系，在草魚養(yǎng)殖過程中應(yīng)依據(jù)藥敏試驗結(jié)果對病害防控進行科學(xué)指導(dǎo)。

本研究于8月至10月從患病草魚體內(nèi)分離得到的7株維氏氣單胞菌均含有多種毒力基因，不同月份分離到的維氏氣單胞菌毒力基因種類有所差異未呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，其差異原因有待進一步研究。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中應(yīng)依據(jù)藥敏試驗結(jié)果為草魚養(yǎng)殖過程中維氏氣單胞菌的預(yù)防控制及治療提供科學(xué)精準的用藥指導(dǎo)，可采用輪換用藥和聯(lián)合用藥，避免耐藥菌株的產(chǎn)生，確保水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色健康可持續(xù)性發(fā)展。

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（責任編輯：柯文輝）