薛紅瑋，羅偉敏，沈 棚

（1.上海營(yíng)家生物科技有限公司，上海 201703；2.營(yíng)家健康科技（廣東）有限公司，廣東東莞 523808； 3.上海康諾執(zhí)信食品有限公司，上海 201703）

本試驗(yàn)選用的功能型蛋白粉是一種具有增強(qiáng)免疫力作用的保健食品，主要在原有蛋白質(zhì)組分的基礎(chǔ)上增加了維生素、膳食纖維等功能型原料，以提升蛋白粉的綜合功效。功能型蛋白粉的主要成分為蛋白質(zhì)，特別添加了維生素E。蛋白質(zhì)是構(gòu)成和修復(fù)組織的主要原料，身體的生長(zhǎng)發(fā)育、衰老組織的更新、疾病和造成創(chuàng)傷后組織細(xì)胞的修復(fù)，都離不開(kāi)蛋白質(zhì)[1]。因此，人體需每天攝入一定量的蛋白質(zhì)作為構(gòu)成和修復(fù)組織的最重要的材料[2]。維生素E是主要的脂溶性抗氧化物，可阻止大分子發(fā)生氧自由基損傷，從而避免很多癌癥的發(fā)生；維生素E可阻止氧化低密度脂蛋白的形成，從而防止動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的發(fā)生[3]；維生素E還可清除腦組織等細(xì)胞的脂褐質(zhì)并改善皮膚彈性，改善記憶力。將維生素E添加到蛋白粉中，可提高蛋白粉增強(qiáng)免疫力的功效。維生素E作為功能型蛋白粉的主要功效成分，其有效成分的含量對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)定非常重要[4]。

測(cè)量不確定度是與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，表征了可以合理地賦予被測(cè)量的量值分散程度[5]。通常由實(shí)驗(yàn)室測(cè)試得到的單個(gè)檢測(cè)結(jié)果并不能代表樣品中目標(biāo)物質(zhì)的真實(shí)含量，需用測(cè)量不確定度評(píng)估真值分布的范圍。為準(zhǔn)確地表達(dá)出樣品中目標(biāo)物質(zhì)的含量，本試驗(yàn)通過(guò)分析測(cè)試過(guò)程，找出各不確定度分量，建立一套合理、完整的評(píng)定方案，得到更精確的表達(dá)測(cè)定結(jié)果[6-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

功能型蛋白粉，營(yíng)家健康科技（廣東）有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）；抗壞血酸（分析純）；氫氧化鉀（分析純）；石油醚（分析純）；無(wú)水硫酸鈉（分析純）；甲醇（色譜純）；2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（分析純）；維生素E標(biāo)準(zhǔn)品（α-生育酚，純度99.5%）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器，安捷倫科技）；752G型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海儀電分析設(shè)備有限公司）；AUW 120D分析天平[島津（中國(guó)）有限公司]；JA1004電子天平（上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司）；SHA-B恒溫水浴振蕩器（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；LC-RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海力辰邦西儀器科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

（1）皂化。稱(chēng)取2 g（精確至0.01 g）蛋白粉試樣于250 mL具塞三角瓶中，加入20 mL溫水，再加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g BHT（2,6-二叔丁基對(duì)甲酚），加入30 mL無(wú)水乙醇，加入10 mL氫氧化鉀溶液（50%），邊加邊振搖，混勻后80 ℃恒溫水浴振蕩皂化30 min，皂化后立即用冷水冷卻至 室溫。

（2）提取。將皂化液用30 mL水轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚，振蕩萃取5 min，將下層轉(zhuǎn)移至另一個(gè)250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚再次萃取，合并醚層。

（3）洗滌。用約100 mL水洗滌醚層，約重復(fù)3次，直至將醚層洗至中性（用pH試紙檢測(cè)下層溶液pH值），去除下層水相。

（4）濃縮。將洗滌后的醚層轉(zhuǎn)移至250 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至近干，用甲醇分次將蒸發(fā)瓶中殘留物轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度。溶液過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜后供液相色譜測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確稱(chēng)取維生素E標(biāo)準(zhǔn)品（α-生育酚）50.0 mg，用無(wú)水乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，定容至刻度，溶液的濃度約為1.00 mg/mL，制得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。將溶液轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，密封后，在-20 ℃下避光保存，有效期6個(gè)月。臨用前將溶液回溫至20 ℃，并進(jìn)行濃度校正。濃度校正方法為取維生素E（α-生育酚）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 500 μL于10 mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，混勻，分別用1 cm石英比色皿，以無(wú)水乙醇為空白參比，在292 nm處測(cè)定吸光度值。

（2）標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。準(zhǔn)確吸取維生素E（α-生育酚）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液5.00 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。在-20 ℃下避光保存，有效期半個(gè)月。

（3）標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。準(zhǔn)確吸取維生素E（α-生育酚）標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL和6.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，其中維生素E（α-生育酚）的濃度分別為5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、 20.0 μg/mL、40.0 μg/mL和60.0 μg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 液相色譜儀器條件

色譜柱：Agilent C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 柱 溫：25 ℃；流 動(dòng) 相：100%甲 醇；流 速： 0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為：294 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.4 建立數(shù)學(xué)模型

試樣中的維生素E（α-生育酚）的含量計(jì)算公式如下：

式中：X為試樣中維生素E的含量，mg/100 g；c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的試樣中維生素E的濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；f為換算因子，為 0.001；100為試樣中的量以100 g計(jì)算的換算系數(shù)；m為試樣的稱(chēng)樣量，g。

1.3.5 不確定度來(lái)源分析

參照試驗(yàn)方法及數(shù)學(xué)模型，影響檢測(cè)結(jié)果的不確定度來(lái)源主要有測(cè)量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程、樣品稱(chēng)量、試樣定容及加標(biāo)回收率等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量的評(píng)定

2.1.1 測(cè)量結(jié)果重復(fù)性引入的不確定度u0

在相同的條件下，對(duì)試樣進(jìn)行10次獨(dú)立測(cè)定，結(jié)果如表1所示。測(cè)量結(jié)果重復(fù)性引入的不確定度屬于A類(lèi)不確定度，可用10次重復(fù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，即單次測(cè)定引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。因此，測(cè) 量結(jié)果重復(fù)性引入的的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表1 蛋白粉中維生素E的測(cè)定結(jié)果

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的不確定度u1

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(1)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)顯示，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度為99%，擴(kuò)展不確定度為U為0.5%，k=2，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(2)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量采用十萬(wàn)分之一天平，稱(chēng)量50.2 mg維生素E標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分析天平的檢定證書(shū)顯示最大允許誤差為0.5 mg，為均勻分布，取k=3，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量引入的不確定度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（3）儲(chǔ)備液定容過(guò)程中引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(3)。儲(chǔ)備液配制過(guò)程中的不確定度主要來(lái)源于容量瓶的容量允差、溫度校正及濃度校正。儲(chǔ)備溶液定容用到50 mL的A級(jí)容量瓶，在20 ℃下容量允差為±0.05 mL，假設(shè)為三角分布，取k為，定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。實(shí)驗(yàn)室溫度控制在（20±5）℃下，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4mL/℃，假設(shè)為矩形分布，取k為，溫度校正引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度則定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u1(3)=。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（4）濃度校正引入的不確定度u1(4)。同一樣品用紫外分光光度計(jì)測(cè)定10次，結(jié)果見(jiàn)表2。則濃度校正引入的不確定度可用標(biāo)準(zhǔn)偏差代替。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液重復(fù)校正引入的不確定度屬于A類(lèi)不確定度，可用10次校正的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，即單次測(cè)定測(cè)定的，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表2 重復(fù)校正10次得到的儲(chǔ)備液濃度

（5）標(biāo)準(zhǔn)系列液配制過(guò)程引入的不確定度u1(5)。標(biāo)準(zhǔn)系列液配制過(guò)程中的不確定度主要來(lái)源于容量瓶的容量允差、溫度校正。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程用到50 mL容量瓶2次，5 mL的分度吸量管3次，10 mL容 量 瓶7次，0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和10.0 mL的分度吸量管各1次。《玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）中在溫度為20 ℃下不同規(guī)格的玻璃量器容量允差及包含因子見(jiàn)表3。假設(shè)為三角分布，取k為，體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算得到的各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表3所示。容量工具引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為： 實(shí)驗(yàn)室的溫度控制在（20±5）℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4mL/℃，假設(shè)為矩形分布，取k為，使用以上容量工具由溫度校正引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，標(biāo)準(zhǔn)系 列液配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1rel(5)=

表3 不同玻璃量器的容量允差

因此，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1rel=

2.1.3 樣品稱(chēng)量引入的不確定度u2

用百分之一天平分別稱(chēng)量5.00 g和5.03 g兩個(gè)平行樣，天平的檢定證書(shū)給出的最大允許誤差為0.05 g，屬于均勻分布，取k=，樣品稱(chēng)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，平均稱(chēng)樣量，則樣品稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.1.4 試樣定容引入的不確定度u3

樣品經(jīng)皂化、提取、洗滌和濃縮后轉(zhuǎn)移至 10 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，此過(guò)程的不確定度主要由容量瓶的容量允差、溫度校正引入。定容用到的10 mL容量瓶為A級(jí)，在20 ℃ 下校正得到的容量允差為±0.02 mL，假設(shè)為三角分布，取k=，則實(shí)驗(yàn)室溫度控制在（20±5）℃下，有機(jī)溶劑的膨脹系數(shù)為1.0×10-4mL/℃，假設(shè)為矩形分布，取k為，溫度校正引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定 度。因此，試 樣定容引入的不確定度為0.00867 mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u3rel=

2.1.5 樣品前處理加標(biāo)回收率引入的不確定度u4

樣品的前處理過(guò)程煩瑣，包含試樣制備、皂化、提取、洗滌和濃縮，不確定度難以評(píng)定，可通過(guò)加標(biāo)回收試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)定，本試驗(yàn)對(duì)同一樣品進(jìn)行6次獨(dú)立的加標(biāo)回收率測(cè)試，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，樣品加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表4 蛋白粉6次獨(dú)立加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 合成不確定度的計(jì)算

綜上所述，高效液相色譜法測(cè)定功能型蛋白粉中的維生素E含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度由測(cè)量重復(fù)性不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度、樣品稱(chēng)量引入的不確定度、樣品定容和樣品的前處理過(guò)程引入的不確定度5個(gè)主要不確定度分量組成。合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

蛋白粉中維生素E的平均含量為8.22 mg/100 g， 因此合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u=8.22×0.013 2= 0.109 mg/100 g。

2.3 擴(kuò)展不確定度

本試驗(yàn)的測(cè)量結(jié)果符合正態(tài)分布，取置信概率P=95%，置信因子k=2，則擴(kuò)展不確定度為U=u×k=0.109×2≈0.22 mg/100 g，蛋白粉中維生素E結(jié)果表述為（8.22±0.22） mg/100 g，k=2。

3 結(jié)語(yǔ)

本文對(duì)高效液相色譜法測(cè)定功能型蛋白粉中維生素E含量的不確定度進(jìn)行了分析評(píng)定，研究表明影響檢測(cè)結(jié)果不確定度的因素主要包括測(cè)量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程、樣品稱(chēng)量、樣品定容和前處理過(guò)程。其中，標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程對(duì)結(jié)果的不確定度影響最大。因此，在測(cè)定過(guò)程中應(yīng)選用證書(shū)齊全的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配制過(guò)程中使用的器皿應(yīng)經(jīng)過(guò)檢定校準(zhǔn)，嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)溶液配制操作規(guī)程，減少測(cè)定過(guò)程的不確定度，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。