陳文庭，俞 淑，林毅侃

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233）

低聚半乳糖（Galacto-Oligosaccharides，GOS）是一種功能性的低聚糖，1～7個(gè)半乳糖基半乳糖或葡萄糖通過糖苷鍵鏈接。在自然界中，動(dòng)物的乳汁中存在微量的低聚半乳糖，而母乳中低聚半乳糖含量較多[1]。低聚半乳糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群[2]、改善腸道功能[3]、提高人體免疫力[4]等功能。由于低聚半乳糖是一個(gè)多聚合度的混合物，沒有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品可進(jìn)行定性和定量，導(dǎo)致目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)行業(yè)中低聚半乳糖檢測(cè)的技術(shù)方案成熟度較低，難以有新的技術(shù)突破，也沒有相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)際方面針對(duì)低聚半乳糖已發(fā)布了《離子色譜法檢測(cè)食品中的低聚半乳糖》（AOAC.2001.02）[5-8]。該方法采用β-半乳糖苷酶將食品中的低聚半乳糖酶解為半乳糖，使用離子色譜法測(cè)定食品中的半乳糖含量，減去已知含量的乳糖酶解后產(chǎn)生的半乳糖，得出低聚半乳糖酶解所產(chǎn)生的半乳糖的量，并通過半乳糖含量和低聚半乳糖平均聚合度計(jì)算出折算因子k值，得出產(chǎn)品中低聚半乳糖的含量。由于AOAC.2001.02并未明確規(guī)定折算因子k值，因此聚合度折算因子k值的確定是該方法的難點(diǎn)，嚴(yán)重影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。本研究擬從低聚半乳糖原料入手，使用高效液相色譜示差折光檢測(cè)器法和離子色譜法兩種方法對(duì)低聚半乳糖各個(gè)組分進(jìn)行分離、定量，計(jì)算出10個(gè)原料產(chǎn)品的低聚半乳糖平均聚合度，為折算因子k值的確定提供參考依據(jù)，提高食品中低聚半乳糖檢測(cè)的準(zhǔn) 確性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

氫氧化鈉（色譜純）；乙酸鈉（色譜純）；亞鐵氰化鉀（分析純）；乙酸鋅（分析純）；麥芽五糖標(biāo)準(zhǔn) 品；麥芽四糖標(biāo)準(zhǔn)品；麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品；乳糖標(biāo)準(zhǔn)品；1,3(4)-β-D-半乳二糖標(biāo)準(zhǔn)品；異乳糖標(biāo)準(zhǔn)品。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent-1260高效液相色譜儀（配四元泵、柱溫箱、餾分收集器、示差折光檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司）；ICS-6000離子色譜儀（配四元梯度泵、脈沖安培檢測(cè)器，美國(guó)Thermo公司）；5910R高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.1.3 溶液配制

①亞鐵氰化鉀溶液。稱取15.00 g亞鐵氰化鉀，用水溶解并定容至100.0 mL，室溫保存，可使用3個(gè)月。②乙酸鋅溶液。稱取30.00 g乙酸鋅，用水溶解并定容至100.0 mL，室溫保存，可使用3個(gè)月。參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中牛磺酸的測(cè)定》（GB 5009.169—2016）對(duì)乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液保質(zhì)期的規(guī)定，即在室溫下3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定。 ③0.5 mol/L氫氧化鈉溶液。量取26.1 mL 50%的氫氧化鈉溶液，超純水定容至1 L，超聲混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。④0.5 mol/L乙酸鈉溶液。稱取41.02 g的乙酸鈉，超純水溶解后定容至1 L，超聲混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取0.1 g麥芽五糖標(biāo)準(zhǔn)品、0.1 g麥芽四糖標(biāo)準(zhǔn)品、0.1 g麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品和0.1 g乳糖標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。吸取各標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖和乳糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 mg/L）供液相色譜法測(cè)試。

準(zhǔn)確稱取0.1 g 1,3(4)-β-D-半乳二糖標(biāo)準(zhǔn)品、 0.1 g乳糖標(biāo)準(zhǔn)品、0.1 g異乳糖標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于100 mL 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。吸取各標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成1,3(4)-β-D-半乳二糖、乳糖、異乳糖標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 mg/L）供離子色譜法測(cè)試。

1.2.2 樣品前處理

稱取5.00 g（精確到0.000 1 g）低聚半乳糖原料于50.0 mL刻度具塞管或離心管中，加入約40.0 mL水振蕩搖勻。加入4.0 mL乙酸鋅溶液和4.0 mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，靜置10 min，沉淀蛋白質(zhì)。用水定容至50.0 mL，6 000 r/min離心5 min，上清液用 0.22 μm濾膜過濾，供高效液相色譜和離子色譜。

1.2.3 儀器條件

（1）高效液相色譜條件。色譜柱：Agilent Ag+色譜柱（200 mm×10 mm）；流動(dòng)相：100%水；柱溫：80 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：100 μL。色譜柱升溫時(shí)使用0.1 mL/min水淋洗，待柱溫升至80 ℃后，將流速設(shè)置為0.3 mL/min。

（2）離子色譜條件。Dionex CarboPac PA1色譜柱（250 mm×4 mm）；Dionex CarboPac PA1保 護(hù) 柱 （50 mm×4 mm）；流速為1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量25 μL。檢測(cè)器：脈沖安培檢測(cè)器，金工作電極，Ag/AgCl參比電極，糖四電位波形。淋洗液A為超純水，B為0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，C為0.5 mol/L乙酸鈉溶液，使用前通氮?dú)?0 min，梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.4 保留時(shí)間確定實(shí)驗(yàn)

將配制好的麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作液注入超高效液相色譜儀，記錄其出峰時(shí)間，分別用于定性低聚半乳糖DP=5，低聚半乳糖DP=4，低聚半乳糖DP=3。將配制的1,3(4)-β-D-半乳二糖、乳糖、異乳糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 mg/L）注入離子色譜儀，記錄其出峰時(shí)間。

1.2.5 計(jì)算方法

聚合度2（含乳糖）、3、4、5、6（含6以上）低聚半乳糖分別占總糖比例的計(jì)算公式如下：

式中：Wi為試樣中不同聚合度的低聚半乳糖（2、3、4、5、≥6）占總低聚半乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；Ai為試樣中待測(cè)低聚半乳糖聚合度的峰面積，mAU·s；ADP2為試樣中低聚半乳二糖的峰（含乳糖）面積，mAU·s；ADP3為試樣中低聚半乳三糖的峰面積，mAU·s；ADP4為試樣中低聚半乳四糖的峰面積，mAU·s；ADP5為試樣中低聚半乳五糖的峰面積，mAU·s；ADP≥6為試樣中低聚半乳六糖（含聚合度6以上）的峰面積，mAU·s。

1,3(4)-β-D-半乳二糖或異乳糖占總二糖比例的計(jì)算公式如下：

式中：Wi為試樣中1,3(4)-β-D-半乳二糖或異乳糖占二糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；Ai為試樣中1,3(4)-β-D-半乳二糖或異乳糖的峰面積，nC·min；A1為試樣中1,3(4)-β-D-半乳二糖的峰面積，nC·min；A2為試樣中乳糖的峰面積，nC·min；A3為試樣中異乳糖的峰面積，nC·min。

1,3(4)-β-D-半乳二糖或異乳糖占總二糖比例的計(jì)算公式如下：

式中：r2為聚合度為2的低聚半乳糖在總糖中的百分比含量，%；w1為由式（2）得出的1,3(4)-β-D-半乳二糖占二糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；w2為由式（2）得出的異乳糖占二糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；w3為由式（1）得出的低聚半乳糖二糖（含乳糖）占總低聚半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法的選擇

市面上大部分的低聚半乳糖原料產(chǎn)品主要是乳糖及不同聚合度的低聚半乳糖的混合物，由于組分結(jié)構(gòu)相似，不易進(jìn)行分離和純化?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法包括毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法、分光光度法、高效液相色譜法和離子色譜法等[9]。毛細(xì)管電泳法對(duì)分離帶電荷的糖類具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但該儀器檢測(cè)靈敏度較低，市場(chǎng)普及性不高，應(yīng)用前景不佳[10]。氣相色譜法檢測(cè)糖類物質(zhì)需先將目標(biāo)物質(zhì)衍生轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)物質(zhì)后進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟煩瑣，易造成實(shí)驗(yàn)誤差。

本文采用液相色譜配置示差檢測(cè)器，可有效分離低聚半乳糖原料中不同聚合度的糖類，操作簡(jiǎn)單、靈敏度較高、重現(xiàn)性好[11]?？紤]到原料產(chǎn)品中，可能夾雜著聚合度同樣為2的乳糖，對(duì)低聚半乳二糖的數(shù)據(jù)造成干擾，本方法采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法單獨(dú)檢測(cè)低聚半乳二糖。由于糖類化合物有弱酸性及親水性的特性，可在較強(qiáng)的堿性溶液中以陰離子形態(tài)存在，可使用強(qiáng)堿性溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行陰離子交換分離，有效分離不同種類的低聚半乳二糖與乳糖[12-13]。

2.2 高效液相色譜條件的優(yōu)化

為有效分離不同聚合度的低聚半乳糖，本文使用液相色譜配置示差檢測(cè)器并連接Ca2+和Ag+兩種色譜柱。根據(jù)配體交換原理分析糖類物質(zhì)，即糖分子端基異構(gòu)碳上所帶羥基可被去質(zhì)子化后帶上強(qiáng)的負(fù)電荷，這些負(fù)電荷與Ag+柱或Ca2+柱填料的樹脂表面金屬離子所帶的正電荷之間相互作用可使糖分子被保留，低聚糖在洗脫時(shí)根據(jù)保留性質(zhì)的強(qiáng)弱和分子量的大小達(dá)到分離[8,14]。兩種色譜柱在流動(dòng)相為純水，柱溫80 ℃的條件下，出峰順序依次是六糖（含聚合度6以上的糖）、五糖、四糖、三糖、二糖、葡萄糖、半乳糖。在相同的色譜條件下，Ag+柱的三糖和二糖的分離度比Ca2+更高。因此，選擇Ag+色譜柱作為液相色譜柱。Ag+色譜柱分離色譜圖見圖1。

圖1 Ag+色譜柱分離色譜圖

2.3 離子色譜條件的優(yōu)化

高效陰離子交換色譜分析糖類化合物時(shí)，所用的淋洗液主要是氫氧化鈉或氫氧化鈉和乙酸鈉的混合液[15]。淋洗液中的OH-作為置換離子，提供強(qiáng)堿性環(huán)境，使弱酸性的糖以陰離子形態(tài)存在，還能起到淋洗離子作用，洗脫并分離糖[15-16]。為獲得較高的靈敏度，要求流動(dòng)相維持高pH：當(dāng)pH增加時(shí)，糖的解離度增加，在色譜柱上的保留能力增強(qiáng)。此外，淋洗能力的增強(qiáng)，也增加了置換離子（OH-）的濃度，使糖的保留時(shí)間縮短[12-15]。在pH高到足以使碳水化合物定量離解前，其與置換離子的作用相互抵消。如果pH繼續(xù)增加，糖的保留時(shí)間將縮短，該pH值取決于糖的pKa值[15-19]。

以往的淋洗方式主要采用單淋洗分離，但單組分淋洗液淋洗方式的分析時(shí)間較長(zhǎng)，且對(duì)保留時(shí)間長(zhǎng)的組分靈敏度不高?？紤]到離子色譜僅有保留時(shí)間一種定性方式，而PA1色譜柱在柱效不穩(wěn)定時(shí)，保留時(shí)間會(huì)有明顯的變化。因此，本方法流動(dòng)相條件設(shè)置為梯度洗脫，在目標(biāo)峰流出后增大流動(dòng)相中堿液的比例徹底清洗色譜柱，以達(dá)到穩(wěn)定保留時(shí)間的目的。在方法儀器條件下的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及樣品色譜圖見圖2和圖3。

圖2 異乳糖、1,3(4)-β-D-半乳二糖離子色譜圖和乳糖色譜圖

圖3 樣品中二糖部分離子色譜圖

2.4 平均聚合度結(jié)果計(jì)算

該研究先運(yùn)用液相色譜配Ag+分析柱將低聚半乳糖原料中的二糖（含乳糖）、三糖、四糖、五糖和六糖（含聚合度6以上的糖）分離，面積歸一法計(jì)算各組分所占百分比。其中二糖部分除了屬于低聚半乳二糖的異乳糖、1,3(4)-β-D-半乳二糖，還包含一定含量的乳糖，會(huì)影響到低聚半乳二糖比例的準(zhǔn)確計(jì)算。因此，為區(qū)分低聚半乳二糖及乳糖，本研究采用離子色譜法配PA1色譜柱進(jìn)行二糖的分離，并用面積歸一化法得到低聚半乳二糖（異乳糖和1,3(4)-β-D-半乳二糖）占二糖（含乳糖）的比例。結(jié)合液相色譜法得到的二糖（含乳糖）占總低聚半乳糖的數(shù)值，計(jì)算低聚半乳二糖占總低聚半乳糖的精確比值。最后根據(jù)AOAC.2001.02方法中提供的折算因子k的計(jì)算公式，從低聚半乳糖的平均聚合度中推算出折算因子k值。使用優(yōu)化后的方法檢測(cè)了國(guó)內(nèi)外主流的6個(gè)低聚半乳糖原料供應(yīng)商的10個(gè)原料產(chǎn)品后，結(jié)果見表2。

表2 不同公司生產(chǎn)的低聚半乳糖原料的組成和占總糖比例

3 結(jié)論

本文采用液相色譜配示差檢測(cè)器分離了低聚半乳糖DP2～DP≥6的糖類成分，采用面積歸一化法確定含量。針對(duì)二糖中含有一定量乳糖的現(xiàn)象，利用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法將二糖中的乳糖和低聚半乳糖二糖進(jìn)行了區(qū)分定量。通過10種不同低聚半乳糖原料的測(cè)定，確定低聚半乳糖的平均聚合度為3.3，為《離子色譜法檢測(cè)食品中的低聚半乳糖》（AOAC.2001.02）中折算因子k值的計(jì)算提供了參考。