白詩(shī)睿, 馬志杰*，李廣禎，楊振菲，陳生梅，謝銀祿，郭東風(fēng)，陳 立

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海省高原家畜遺傳資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；2.青海省格爾木市畜牧獸醫(yī)站，青海 格爾木 816000；3.青海省格爾木市唐古拉山鎮(zhèn)獸醫(yī)站，青海 格爾木 816099)

牦牛是青藏高原特有、古老而原始的牛種，享有“高原之舟”的美譽(yù)，其能在高寒牧區(qū)負(fù)重馳騁，是當(dāng)?shù)啬撩癫豢苫蛉钡纳詈蜕a(chǎn)資料[1]。青海省位于青藏高原的東北部和我國(guó)的西北部，平均海拔3 000 m以上，現(xiàn)有牦牛500多萬(wàn)頭，是牦牛存欄數(shù)最多的省份，被譽(yù)為“世界牦牛之都”。格爾木市位于青海省中西部的海西蒙古族藏族自治州，地處青藏高原腹地，轄區(qū)內(nèi)擁有豐富的自然資源，其豐富的動(dòng)植物遺傳資源對(duì)三江源區(qū)生態(tài)保護(hù)和維持起著重要作用。畜牧業(yè)是格爾木市的主要產(chǎn)業(yè)之一，而牦牛業(yè)在該地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展中有著舉足輕重的作用。線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遵循母系遺傳和突變率高等特點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于哺乳動(dòng)物母系遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育等研究[2]。近年來(lái)，基于線粒體基因組序列變異對(duì)牦牛遺傳多樣性的研究相對(duì)較多，且mtDNA D-loop區(qū)序列的運(yùn)用最為廣泛[3-4]。賴松家等[5]首次測(cè)定了我國(guó)5個(gè)牦牛品種35個(gè)個(gè)體的mtDNA D-loop區(qū)全序列，分析表明其總的單倍型多樣度為0.970±0.018且有2個(gè)支系，提示這5個(gè)牦牛品種母系遺傳多樣性豐富且有2個(gè)母系起源。郭松長(zhǎng)等[6]分析了我國(guó)10個(gè)家牦牛品種296個(gè)個(gè)體的mtDNA D-loop區(qū)部分序列，表明我國(guó)家牦牛具有豐富的母系遺傳多樣性且品種間存在顯著的遺傳多樣性差異，其中環(huán)湖牦牛擁有最高的單倍型多樣度(0.985±0.040)，而巴州牦牛單倍型多樣度最低(0.800±0.083)；聚類分析顯示，家牦牛存在2個(gè)聚類簇，推測(cè)有2個(gè)母系起源。Z. F. Wang等[7]分析了405頭家牦牛和47頭野牦牛的D-loop區(qū)序列，結(jié)果顯示家、野牦牛總的單倍型多樣度分別為0.916±0.009和0.967±0.013；系統(tǒng)發(fā)育分析表明牦牛存在3個(gè)支系，其中家、野牦牛共享Ⅰ和Ⅱ支系，第Ⅲ支系僅有少量野牦牛分布。鐘金城等[8]測(cè)定了西藏11個(gè)牦牛群體的mtDNA D-loop區(qū)、Cytb基因和COⅢ基因的核苷酸序列，其中D-loop區(qū)計(jì)算的單倍型多樣度介于0.927～1.000之間，有2個(gè)聚類簇，表明西藏牦牛具有較豐富的遺傳多樣性且有2個(gè)母系起源。成述儒等[9]基于D-loop序列探究了甘肅省6個(gè)牦牛群體的遺傳多樣性，表明甘南州的3個(gè)牦牛群體(即瑪曲、碌曲和夏河)的遺傳多樣性較豐富,單倍型多樣度分別為0.911±0.021，0.902±0.033和0.883±0.024，而天祝白牦牛群體單倍型多樣度最低(0.662±0.031)；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示6個(gè)牦牛群體有2個(gè)支系，可能具有2個(gè)母系起源。官久強(qiáng)等[10]分析了四川4個(gè)牦牛品種(即昌臺(tái)、金川、木里和麥洼牦牛)的215條mtDNA D-loop區(qū)序列，并與西藏、青海、新疆等地的品種(群體)及野牦牛進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，表明昌臺(tái)牦牛在四川4個(gè)群體中具有最高的單倍型多樣度(0.883±0.020)，木里牦牛具有最低的單倍型多樣度(0.621±0.109)；四川牦牛與其他地區(qū)牦牛品種(群體)擁有明顯的2個(gè)支系。X. P. Yue等[11]對(duì)我國(guó)13個(gè)家、野牦牛品種(群體)的742條D-loop序列進(jìn)行分析，表明家牦牛中大通牦牛具有最高的單倍型多樣度(0.945±0.025)，而環(huán)湖牦牛的單倍型多樣度最低(0.785±0.048)。涂世英等[12]測(cè)定分析了15頭中甸牦牛mtDNAD-loop區(qū)全序列，其平均單倍型多樣度和核苷酸多樣度分別為0.983和0.005，表明中甸牦牛的遺傳多樣性較為豐富。李瑞哲等[13]分析了34頭雪多牦牛的mtDNA D-loop序列，其單倍型多樣度為0.900±0.043且有2個(gè)聚類支系，表明雪多牦牛具有豐富的母系遺傳多樣性，推測(cè)其有2個(gè)母系起源。李廣禎等[14]測(cè)定分析了34頭曲麻萊牦牛(即玉樹牦牛)的mtDNA D-loop區(qū)部分序列，其單倍型多樣度為0.952±0.021且有2個(gè)明顯的分支，提示曲麻萊牦牛具有豐富的母系遺傳多樣性且有2個(gè)母系起源。隨后，他還對(duì)31頭門源白牦牛和235頭天祝白牦牛的mtDNA D-loop序列進(jìn)行了比較分析[15]，結(jié)果表明門源白牦牛單倍型多樣度為0.862±0.033，而天祝白牦牛單倍型多樣度為0.946±0.007，提示天祝白牦牛的遺傳多樣性水平高于門源白牦牛；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示56種單倍型可分為2個(gè)明顯的分支(即支系Ⅰ和Ⅱ),表明白牦牛有2個(gè)母系起源。侯孟典等[16]對(duì)64頭玉樹牦牛和4個(gè)西藏牦牛品種(群體)D-loop區(qū)進(jìn)行比較分析，表明玉樹牦牛的單倍型多樣度最低(0.885±0.034)，而申扎牦牛的單倍型多樣度最高(0.956)；5個(gè)牦牛品種(群體)擁有2個(gè)母系分支。最近，X. D. Wang等[17]測(cè)定分析了青海和新疆5個(gè)牦牛品種(群體)的111條全線粒體基因組序列，表明雪多牦牛(0.992±0.015)、帕米爾牦牛(0.990±0.014)、玉樹牦牛(0.963±0.033)、祁連牦牛(0.948±0.036)和環(huán)湖牦牛(0.905±0.048)的單倍型多樣度均較高，具有豐富的母系遺傳多樣性；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示牦牛可聚為3個(gè)分支，而少量雪多牦牛和野牦牛個(gè)體共享第Ⅲ母系支系。與此同時(shí)，Z. J. Ma等[18]基于84條mtDNA D-loop區(qū)序列和24條全線粒體基因組序列的綜合分析，系統(tǒng)探究了野牦牛的母系遺傳多樣性和支系組成，表明野牦牛具有豐富的母系遺傳多樣性，其中D-loop序列和全基因組序列獲得的群體單倍型多樣度分別為0.962±0.008和0.993±0.014；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示野牦牛擁有3個(gè)母系支系，提示其有3個(gè)母系起源。

綜上所述，研究者已基于mtDNA序列變異對(duì)我國(guó)多個(gè)牦牛品種(群體)進(jìn)行了母系遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析[5-18]。而在先前牦牛的父系遺傳研究中，Z. J. Ma等[19]對(duì)9個(gè)青海省牦牛品種(群體)父系遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)及起源的分析表明，格爾木牦牛群體(即郭勒木德牦牛群體)具有最高的Y染色體單倍型多樣度(0.706±0.038)，提示其具有豐富的父系遺傳多樣性。然而，當(dāng)前尚未見(jiàn)對(duì)青海省格爾木牦牛群體母系遺傳方面的研究報(bào)道。鑒于此，本研究基于mtDNA D-loop區(qū)序列變異對(duì)格爾木牦牛進(jìn)行母系遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析，以明確其母系遺傳多樣性水平、群體結(jié)構(gòu)組成和母系遺傳背景，為其遺傳資源的分子評(píng)估、合理保護(hù)和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

在青海省海西蒙古族藏族自治州格爾木市郭勒木德鎮(zhèn)共采集49頭牦牛的血液樣品，ACD抗凝，帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。采樣前仔?xì)詢問(wèn)牧戶有關(guān)牦牛群的選育背景信息并查閱系譜記錄，采用分戶隨機(jī)采樣方式，確保樣品間無(wú)親緣關(guān)系且具有代表性。用血液基因組DNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取基因組DNA，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，所得基因組DNA -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成、PCR擴(kuò)增與測(cè)序

參照Z(yǔ). J. Ma等[18]在野牦牛研究中運(yùn)用的引物信息合成一對(duì)引物用以擴(kuò)增格爾木牦牛的mtDNA D-loop區(qū)序列，引物由上海生工生物工程有限公司合成，其中上游引物為5’-GTAAAGAGCCTCACCAGTAT-3’，下游引物為5’-TCCTCTAGCCATTGACTAT-3’。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：2xPreMix 12.5 μL，超純水9.5 μL，上、下游引物各1 μL，基因組DNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，31個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，后4 ℃低溫保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送純化PCR產(chǎn)物到北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序結(jié)果核對(duì)后用BioEdit 7.2.5軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，后用DnaSP 5.10.01軟件確定格爾木牦牛群體的單倍型數(shù)目及其核苷酸序列多態(tài)位點(diǎn)，再用Arlequin 3.5.2.2軟件計(jì)算單倍型多樣度以及核苷酸多樣度大小以揭示格爾木牦牛的群體遺傳多樣性水平。使用MEGA 5.05軟件基于鄰接法(Neighbor-Joining，即NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以揭示不同單倍型(組)間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，進(jìn)而揭示格爾木牦牛的母系遺傳背景。

2 結(jié)果與分析

2.1 格爾木牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列變異分析

通過(guò)測(cè)定49頭格爾木牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列，得到有效分析序列片段長(zhǎng)度為618 bp，其中T、C、A、G 4種核苷酸的含量分別為27.79%，25.15%，30.85%和16.21%，A+T含量為58.64%，G+C含量為41.36%。多序列比對(duì)分析排除1處插入(缺失)位點(diǎn)后，共檢測(cè)到45處多態(tài)位點(diǎn)，約占所分析序列長(zhǎng)度的7.28%；在45處多態(tài)位點(diǎn)中，共有10處單一多態(tài)位點(diǎn)，分別為4，173，209，244，253，282，419，420，562和575位點(diǎn)，占分析序列長(zhǎng)度的1.62%，其余35處(即21，35，42，60，67，83，98，113，119，146，172，174，175，181，182，192，199，201，218，221，234，235，236，240，242，250，251，259，281，316，317，323，366，426和464位點(diǎn))為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，占分析序列長(zhǎng)度的5.66%(圖1)。研究共確定了18種單倍型，其中單倍型H4由10個(gè)個(gè)體共享，為優(yōu)勢(shì)單倍型。單倍型H1由9個(gè)個(gè)體共享，單倍型H2、H3、H6均由4個(gè)個(gè)體共享，H9由3個(gè)個(gè)體共享，H5、H10、H16分別由2個(gè)個(gè)體共享，其余單倍型均由1個(gè)個(gè)體擁有。

注：“.”表示與H1單倍型序列中的核苷酸相同；N表示共享同一單倍型的個(gè)體數(shù)量；Hg表示單倍型組類型。圖1 格爾木牦牛mtDNA D-loop區(qū)18種單倍型核苷酸變異、頻率大小及單倍型組類型

2.2 格爾木牦牛的母系遺傳多樣性分析

對(duì)49頭格爾木牦牛mtDNA D-loop區(qū)部分序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，計(jì)算結(jié)果表明格爾木牦牛群體的單倍型多樣度為0.911±0.022，核苷酸多樣度為0.015±0.008。與此同時(shí)，將格爾木牦牛與已報(bào)道的野牦牛群體及17個(gè)我國(guó)其他家牦牛品種遺傳多樣性指數(shù)值進(jìn)行比較分析(表1)，結(jié)果表明格爾木牦牛群體的遺傳多樣性指數(shù)值較高，表明其具有較豐富的母系遺傳多樣性。

表1 格爾木牦牛與野牦牛及我國(guó)其他17個(gè)家牦牛品種母系遺傳多樣性指數(shù)值比較

2.3 格爾木牦牛的系統(tǒng)發(fā)育分析

將美洲野牛(Bisonbison)mtDNA D-loop序列(GenBank No：EU177871)作為外群，以先前研究報(bào)道中代表牦牛3個(gè)母系支系的D-loop區(qū)序列(即支系I(GenBank No.：FJ548844)、支系II(GenBank No.：FJ548843)和支系III(GenBank No.：DQ139202))作為參考序列[18]，對(duì)格爾木牦牛18種單倍型序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示：格爾木牦牛的18種單倍型序列明顯的和3條參考序列分別聚在一起，形成3個(gè)母系分支(圖2)，其中支系Ⅰ由H4、H6、H9、H15、H2、H1、H11、H8、H16、H17、H18、H10和H12單倍型序列組成，占72.2%；支系Ⅱ由H5、H3、H7和H13單倍型序列組成，占22.2%；而支系Ⅲ只包括H14單倍型序列，占5.6%。從單倍型組構(gòu)成來(lái)看，18種單倍型分別隸屬于A、B、C、D和G 5種單倍型組，分別占50%，22%，17%，5.5%和5.5%，其中A單倍型組包括H1、H2、H4、H6、H8、H9、H11、H15和H16共9種單倍型，B單倍型組包括H10、H12、H17和H18單倍型，C單倍型組包括H3、H13和H17單倍型，而D和G單倍型組分別包括H5和H14單倍型。

圖2 格爾木牦牛母系單倍型(組)間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及支系組成

3 討 論

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，家畜的遺傳多樣性豐富程度與人類的生存發(fā)展休戚相關(guān)。牦牛遺傳多樣性的研究不僅有利于牦牛遺傳資源的保護(hù)和開發(fā)利用，更有助于維持青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的平衡，具有深遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)與生態(tài)意義。先前的研究表明，野牦牛及我國(guó)多數(shù)家牦牛品種都具有豐富的母系遺傳多樣性，其中野牦牛群體的單倍型多樣度在0.957～0.967之間[7,18]，而家牦牛品種的單倍型多樣度在0.621～0.985之間[5-16,20]。在本研究中，格爾木牦牛群體的單倍型多樣度為0.911±0.022，核苷酸多樣度為0.015±0.008。與我國(guó)其他牦牛品種(群體)如野牦牛及天祝、甘南、九龍、類烏齊、帕里、斯布、昌臺(tái)、金川、麥洼、木里、中甸、巴州、青海高原、環(huán)湖、大通、雪多和玉樹牦牛相比[5-18，20]，格爾木牦牛的單倍型多樣度和核苷酸多樣度值均較高，表明格爾木牦牛具有較豐富的母系遺傳多樣性。

牦牛的起源和系統(tǒng)發(fā)育研究可以明確其進(jìn)化歷史和遺傳背景，對(duì)其遺傳資源保護(hù)和開發(fā)利用具有重要作用。先前多數(shù)針對(duì)我國(guó)家、野牦牛品種(群體)的系統(tǒng)發(fā)育研究顯示：牦牛擁有2個(gè)母系支系，推測(cè)可能有2個(gè)母系起源[5-6，8-11，13-16]。然而，近年來(lái)部分研究者如Z. F. Wang等[7]、X. D. Wang等[17]和Z. J. Ma等[18]基于線粒體基因組及其D-loop區(qū)、蛋白編碼序列等對(duì)我國(guó)家、野牦牛的系統(tǒng)發(fā)育綜合分析表明，牦牛擁有3個(gè)母系支系，其中共享第Ⅰ、Ⅱ支系的家、野牦牛個(gè)體較多，而第Ⅲ支系中僅有少量野牦牛和雪多牦牛個(gè)體的存在，推測(cè)牦牛有3個(gè)母系起源。值得注意的是，在本研究系統(tǒng)發(fā)育分析中，首次發(fā)現(xiàn)格爾木牦牛的18種單倍型聚為3個(gè)母系分支，其中分支Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ所占比例分別為72.2%，22.2%和5.6%，表明格爾木牦牛由3個(gè)母系支系組成，可能有3個(gè)母系起源，進(jìn)一步支持了牦牛由3大母系支系組成且家、野牦牛共享這3個(gè)母系支系的結(jié)論[17-18]。牦牛的3大母系分支推測(cè)大約在42萬(wàn)年和58萬(wàn)年前分化[22]，這與青藏高原更新世中晚期的冰期事件發(fā)生的時(shí)間吻合，青藏高原的冰期事件促使野牦牛隔離而產(chǎn)生異域分化，冰期結(jié)束后重新聚集形成了高度分化的野牦牛基因庫(kù)，人類在這一基因庫(kù)中選取了部分個(gè)體進(jìn)行了馴化?？紤]到本研究在格爾木牦牛群體中首次檢測(cè)到第Ⅲ母系支系個(gè)體的存在，結(jié)合X. D. Wang等[17]在雪多牦牛中也發(fā)現(xiàn)第Ⅲ母系支系個(gè)體的研究結(jié)果，故認(rèn)為牦牛中稀少的第Ⅲ支系個(gè)體早期也應(yīng)該被馴化了，只是由于個(gè)體數(shù)量較少，目前只有限的分布在雪多牦牛、格爾木牦牛這些家牦牛群體中，這在一定程度上改變了先前Z. F. Wang等[7]研究中認(rèn)為第Ⅲ母系支系只由未馴化的野牦牛個(gè)體組成的觀點(diǎn)。鑒于此，本研究建議加強(qiáng)格爾木牦牛群體遺傳資源的保護(hù)和利用，充分發(fā)掘其遺傳潛力，進(jìn)而開展其保種和選育實(shí)踐工作。此外，本研究中格爾木牦牛的18種單倍型分布在A、B、C、D和G 5種單倍型組中，所占比例依次為50%，22%，17%，5.5%和5.5%，說(shuō)明A單倍型組是其優(yōu)勢(shì)單倍型組，這與野牦牛及其他家牦牛品種(群體)的研究結(jié)果[5-22]基本一致。