短鏈脂肪酸對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化及組蛋白乙?；降挠绊憿?/h1>
2022-05-18 08:53:58楊光露潘婭嵐劉孟敏吳承杰涂鵬程
中國(guó)免疫學(xué)雜志 2022年6期
楊光露 郭 楊 馬 勇 潘婭嵐 劉孟敏 吳承杰 涂鵬程
（南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023）
近年大量報(bào)道稱腸道菌群不僅參與人類多種疾病（如糖尿病、結(jié)腸癌、肥胖等）發(fā)生發(fā)展過程，還可能參與全身性炎癥反應(yīng)，甚至下調(diào)全身和腦部炎癥反應(yīng)［1-6］。腸道菌群主要發(fā)酵產(chǎn)物短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFAs）包括乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽等，可參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在“腦腸軸”中具有重要意義［7］。而小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦組織中的巨噬細(xì)胞，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后功能恢復(fù)尤為重要［8］。研究表明SCFAs 可通過血腦屏障與小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用從而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)［9］。
目前研究多數(shù)基于某一類或總的SCFAs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的作用，如乙酸鹽可通過誘導(dǎo)組蛋白乙酰化增加脂多糖刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞中脂肪酸含量［10］；丁酸鹽可減弱老齡小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子表達(dá)［11］；SCFAs 可通過循環(huán)的淋巴細(xì)胞介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化改善卒中后恢復(fù)［12］。但具體濃度及種類的SCFAs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞帶來多大影響尚不明確。本研究通過選取組蛋白乙?；畛Ｒ娢稽c(diǎn)，從6 種SCFAs 的3 個(gè)濃度中篩選最能反映組蛋白乙?；降慕M別及干預(yù)時(shí)間，從而探討SCFAs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化及組蛋白乙?；淖饔?。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 小鼠永生化小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞（拜瑞，江蘇）。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 乙?；M蛋白H3、H4 抗體試劑盒（#9927、#8346，CST）；引發(fā)髓性細(xì)胞受體表達(dá)2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）兔多克隆抗體（#YN2124，Immuno Way）；RIPA 裂解液（強(qiáng)）（#P0013B，碧云天）；小鼠IL-4、IL-13、IL-10、TNF-α ELISA 試劑盒（#FMS-ELM004、#FMS-ELM014、#FMS-ELM009、#FMS-ELM028，福麥斯）；小鼠一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）ELISA 試劑盒（#KE1426，Immuno Way）；RNA 提取試劑盒（#RC101，Vazyme）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（#R223，Vazyme）；所有引物均由上海生工合成。
1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 高速冰凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Peking Elmer）；實(shí)時(shí)熒光定量分析儀（美國(guó) ThermoFisher）；WB 設(shè)備（美國(guó)Bio-Rad）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus）。
1.2 方法
1.2.1 永生化BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及分組 采用含胎牛血清、雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基37 ℃常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行1∶2 傳代。根據(jù)SCFAs相對(duì)分子量配制不同濃度SCFAs的高糖培養(yǎng)基，細(xì)胞分為以下組別：對(duì)照組、乙酸組、丙酸組、丁酸組、異丁酸組、戊酸組、異戊酸組、SCFAs 組、組蛋白去乙?；敢种苿┣琶顾兀╰richostatin A，TSA）組，除對(duì)照組外各組均設(shè)置1、10、100 mmol/L 3種濃度。上述實(shí)驗(yàn)均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。
1.2.2 Dot blot 篩選與TREM2 關(guān)聯(lián)的組蛋白乙?；稽c(diǎn)及SCFAs濃度 取各組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BV2細(xì)胞，加入RIPA 裂解液（含1%PMSF）裂解細(xì)胞，細(xì)胞刷刮下細(xì)胞，離心，取上清，BCA 測(cè)定各組蛋白含量，配平后加入總量1/4 的上樣緩沖液（5×）混勻，95 ℃煮沸10 min。用鉛筆在硝酸纖維膜上畫0.25 cm2小格，將 1 μl 樣本點(diǎn)進(jìn)小格，各樣本重復(fù)2 次，用含5%BSA 的TBST 溶 液 封 閉 1 h，加 入 一 抗 孵 育30 min，加入二抗孵育30 min，曝光觀察圖像。
1.2.3 Western blot 驗(yàn)證篩選出的乙?；稽c(diǎn)及SCFAs 濃度 蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，TBST 溶液（含5%脫脂奶粉）封閉2 h，加入TREM2、GAPDH、H3、H4、H3K27、H4K8 等一抗 4 ℃孵育過夜，次日回收一抗，快速搖洗3 遍，加入二抗室溫孵育2 h，快速搖洗3遍，曝光顯像，采用Image J軟件定量分析蛋白條帶。
1.2.4 CCK8 法檢測(cè)不同濃度 SCFAs 對(duì) BV2 細(xì)胞活性的影響 取各組藥物干預(yù)24 h 的BV2 細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，110 μl/孔加入現(xiàn)配的 DMEM 培養(yǎng)基及CCK8 溶液混合液37 ℃避光孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm及650 nm處吸光度。
1.2.5 免疫熒光染色檢測(cè)不同濃度SCFAs 對(duì)BV2細(xì)胞特異性標(biāo)志物Iba1 熒光表達(dá)的影響 取各組藥物干預(yù)24 h 后的BV2 細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定 10 min，0.2%Triton X-100 通透 5 min，PBS 清洗，加入一抗4 ℃孵育過夜，加入熒光二抗室溫孵育 1 h，DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，PBS 清洗，熒光倒置顯微鏡下觀察Iba1染色情況。
1.2.6 ELISA 檢測(cè)不同濃度 SCFAs 對(duì) BV2 細(xì)胞炎癥因子分泌的影響 取各組藥物干預(yù)24 h后的BV2細(xì)胞培養(yǎng)上清，1 000 g離心10 min，收集上清。根據(jù)說明書配制溶液，將樣本和各濃度標(biāo)準(zhǔn)品按100μl/孔加入相應(yīng)孔，37 ℃孵育90 min，4次洗板后按100 μl/孔加入生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min，4 次洗板后按100 μl/孔加入酶結(jié)合物工作液37 ℃孵育30 min，4 次洗板后加入顯色液，37 ℃避光孵育20 min，加入終止液，吹打均勻后酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm及630 nm處吸光度。
1.2.7 qRT-PCR 檢測(cè)不同藥物干預(yù) 1 h 和 24 h 對(duì)BV2細(xì)胞表型標(biāo)志物及相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響取各組藥物干預(yù)1 h 和24 h 后的BV2 細(xì)胞，加入裂解液消化、裂解，反復(fù)吹打混勻，柱提法提取總RNA，將 M1 表型相關(guān)基因 TNF-α、iNOS、M2 表型相關(guān)基因IL-10、精氨酸酶1（arginase1，Arg1）及小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物TREM2、表面模式識(shí)別受體巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型C 型凝集素受體（monocyte-inducible C-type lectin，Mincle）mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，PCR 擴(kuò)增，2-ΔΔCt法處理PCR數(shù)據(jù)。引物序列見表1。
表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Sidak檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 Dot blot 篩選與TREM2 關(guān)聯(lián)較強(qiáng)的乙?；稽c(diǎn) H4K8、H3K27 及相關(guān) SCFAs 濃度 Dot blot 條帶如圖1。以GAPDH、H3、H4分別作為TREM2、H3K9、H3K14、H3K18、H3K27、H3K56、H4K5、H4K8、H4K12 內(nèi)參，根據(jù)目的蛋白間相關(guān)性繪制聚類熱圖，如圖2。結(jié)果顯示，不同藥物干預(yù)1 h 后，H4K12、H4K8 與 TREM2 蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)性最大，干預(yù)24 h 后，H4K5、H4K8、H4K12 與 TREM2 蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)性最大。由于H3 中無特別突出位點(diǎn)，課題組選擇H4 突出位點(diǎn)H4K8 及相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)的H3 突出位點(diǎn) H3K27［13］，其中丙酸組（10 mmol/L）、戊酸組（1、10 mmol/L）、異戊酸組（1、10 mmol/L）、SCFAs 組（1、10、100 mmol/L）、TSA 組（50、100、200 nmol/L）中H3K27、H4K8 蛋白表達(dá)與TREM2 蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)性最大。
圖1 Dot blot 檢測(cè)各組藥物干預(yù)后各乙酰化位點(diǎn)蛋白表達(dá)情況Fig.1 Dot blot detected protein expression of acetylation sites after drug intervention in each group
圖2 各組藥物干預(yù)1 h、24 h后各乙酰化位點(diǎn)蛋白表達(dá)情況Fig.2 Protein expressions of acetylation sites in each group after drug intervention for 1 h and 24 h
2.2 Western blot 驗(yàn)證相關(guān) SCFAs 濃度下 H3K27、H4K8 與 TREM2 蛋 白表 達(dá) Western blot 條 帶如圖3A、圖4A，以GAPDH、H3、H4 分別作為TREM2、H3K27、H4K8 內(nèi)參，根據(jù)目的蛋白間相關(guān)性繪制聚類熱圖，如圖3B、圖4B。結(jié)果顯示，H3K27、H4K8與TREM2關(guān)聯(lián)性較大，聚類較好；各組藥物干預(yù)1 h后BV2細(xì)胞蛋白與對(duì)照組表達(dá)差異較大的有：H4K8表達(dá)中異戊酸組（10 mmol/L）、TSA 組（50、100、200 nmol/L）、SCFAs 組（100 mmol/L），TREM2 表達(dá)中TSA 組（100、200 nmol/L）、SCFAs 組（100 mmol/L），H3K27 表達(dá)中異戊酸組（10 mmol/L）、TSA 組（50 nmol/L）；各組藥物干預(yù)24 h 后蛋白與對(duì)照組表達(dá)差異較大的有：H4K8表達(dá)中除丙酸組（10 mmol/L）、戊酸組（10 mmol/L）外的其余各組，TREM2 表達(dá)中戊酸組（1 mmol/L）、異戊酸組（10 mmol/L）、TSA 組（200 nmol/L）、SCFAs組（100 mmol/L），H3K27表達(dá)中除丙酸組（10 mmol/L）、戊酸組（10 mmol/L）外的其余各組。
圖3 各組藥物干預(yù) 1 h 后 BV2 細(xì)胞 H3K27、H4K8 蛋白表達(dá)情況Fig.3 Protein expressions of H3K27 and H4K8 in BV2 cells after drug intervention in each group for 1 h
圖4 各組藥物干預(yù) 24 h 后 BV2 細(xì)胞 H3K27、H4K8 蛋白表達(dá)情況Fig.4 Protein expressions of H3K27 and H4K8 in BV2 cells after drug intervention in each group for 24 h
2.3 CCK8 顯示高濃度SCFAs 抑制BV2 細(xì)胞活性以對(duì)照組為參照計(jì)算各組藥物干預(yù)24 h 后BV2細(xì)胞相對(duì)增殖率，結(jié)果顯示，10 mmol/L 丙酸、戊酸、異戊酸和SCFAs，100 mmol/L SCFAs，100、200 nmol/L TSA均可抑制BV2細(xì)胞活性（P＜0.01，表2）。
表2 各組藥物干預(yù)24 h后BV2細(xì)胞相對(duì)增殖率（）Tab.2 Relative proliferation rate of BV2 cells after 24 h of drug intervention in each group（）
Note：Compared with Control group，1）P＜0.01.
Relative proliferation rate of BV2 cells/%100.000±5.405 64.376±5.4701）99.261±6.185 61.679±2.7281）96.042±5.253 64.593±3.9361）92.692±6.902 75.990±3.9711）22.358±0.9021）100.217±5.544 78.425±3.6181）67.508±0.3301）Groups Control 10 mmol/L propionate 1 mmol/L valerate 10 mmol/L valerate 1 mmol/L isovalerate 10 mmol/L isovalerate 1 mmol/L SCFAs 10 mmol/L SCFAs 100 mmol/L SCFAs 50 nmol/L TSA 100 nmol/L TSA 200 nmol/L TSA
2.4 免疫熒光染色顯示SCFAs 可隨時(shí)間延長(zhǎng)增強(qiáng)對(duì)BV-2 細(xì)胞增殖的抑制作用 各組藥物干預(yù)1、3、5 d 后 BV2 細(xì)胞 Iba1 免疫熒光染色如圖 5。Image J處理圖像，以相對(duì)熒光強(qiáng)度衡量各組藥物干預(yù)效果，結(jié)果顯示，第1 天10 mmol/L 丙酸及100 nmol/L TSA 組Iba1 平均熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05），第3 天無明顯變化，第 5 天除 10 mmol/L 丙酸、1 mmol/L 戊酸、200 nmol/L TSA 外其余各組Iba1 平均熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05，表 3）。表明調(diào)節(jié) Iba1 表達(dá)時(shí)，各濃度SCFAs 作用與TSA 類似，且可隨著時(shí)間延長(zhǎng)增強(qiáng)對(duì)BV2細(xì)胞活性的抑制作用。
表3 各組藥物干預(yù)BV2 細(xì)胞后Iba1 染色平均熒光強(qiáng)度（）Tab.3 Average fluorescence intensity of Iba1 staining of BV2 cells after intervention of drugs in each group（）
表3 各組藥物干預(yù)BV2 細(xì)胞后Iba1 染色平均熒光強(qiáng)度（）Tab.3 Average fluorescence intensity of Iba1 staining of BV2 cells after intervention of drugs in each group（）
Note：Compared with Control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01.
5 d 1.000±0.121 0.933±0.072 0.873±0.078 0.750±0.1071）0.733±0.0641）0.753±0.0551）0.696±0.1422）0.673±0.0552）0.568±0.2142）0.636±0.1252）0.302±0.0052）0.823±0.085 Groups Control 10 mmol/L propionate 1 mmol/L valerate 10 mmol/L valerate 1 mmol/L isovalerate 10 mmol/L isovalerate 1 mmol/L SCFAs 10 mmol/L SCFAs 100 mmol/L SCFAs 50 nmol/L TSA 100 nmol/L TSA 200 nmol/L TSA 1 d 1.000±0.048 0.690±0.0692）0.753±0.205 1.013±0.112 0.855±0.192 0.979±0.071 0.911±0.083 1.017±0.077 0.706±0.247 1.051±0.238 0.629±0.1002）0.964±0.061 3 d 1.000±0.051 1.016±0.072 1.003±0.065 0.931±0.236 0.871±0.209 0.920±0.160 0.966±0.085 0.987±0.119 1.239±0.159 0.862±0.052 0.906±0.060 0.911±0.061
圖5 各組藥物干預(yù)BV2 細(xì)胞后Iba1 熒光染色表達(dá)情況（×100）Fig.5 Expression of Iba1 fluorescence staining in BV2 cells after intervention of drugs in each group（×100）
2.5 SCFAs 可促進(jìn) IL-4、IL-13 釋放，高濃度 SCFAs可減緩IL-10、TNF-α、iNOS 釋放 與對(duì)照組相比，丙酸（10 mmol/L）、戊酸（1、10 mmol/L）、異戊酸（1、10 mmol/L）、TSA（50、100、200 nmol/L）、SCFAs（10、100 mmol/L）可促進(jìn) IL-4 釋放（P＜0.05），SCFAs（1 mmol/L）對(duì)IL-4 釋放無顯著促進(jìn)作用（P＞0.05）；丙酸（10 mmol/L）、戊酸（10 mmol/L）、異戊酸（1、10 mmol/L）、TSA（50、100、200 nmol/L）、SCFAs（10、100mmol/L）可促進(jìn)IL-13釋放（P＜0.05），戊酸（1mmol/L）、SCFAs（1 mmol/L）對(duì)IL-13釋放無顯著影響（P＞0.05）；丙酸（10 mmol/L）、戊酸（1、10 mmol/L）、異戊酸（1、10 mmol/L）、TSA（50、100、200 nmol/L）、SCFAs（1、10、100 mmol/L）可減 緩 IL-10 釋 放（P＜0.05）；丙 酸（10 mmol/L）、戊酸（10 mmol/L）、異戊酸（10 mmol/L）、TSA（200 nmol/L）、SCFAs（1、10、100 mmol/L）可減緩TNF-α 釋放（P＜0.05），但戊酸（1 mmol/L）、異戊酸（1 mmol/L）、TSA（50、100 nmol/L）對(duì) TNF-α 釋放無明 顯 作用（P＞0.05）；丙酸（10 mmol/L）、戊 酸（10 mmol/L）、異 戊 酸（10 mmol/L）、TSA（100、200 nmol/L）、SCFAs 組（1、10、100 mmol/L）均可減緩iNOS 釋放（P＜0.05），但戊酸（1 mmol/L）、異戊酸（1 mmol/L）、TSA（50 nmol/L）對(duì) iNOS 釋放無明顯作用（P＞0.05，表4）。
表4 SCFAs對(duì)BV2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（）Tab.4 Effects of SCFAs on expressions of inflammatory factors in BV2 cells（）
表4 SCFAs對(duì)BV2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（）Tab.4 Effects of SCFAs on expressions of inflammatory factors in BV2 cells（）
Note：Compared with Control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01.
iNOS/（ng·ml-1）24.645±6.668 4.560±0.8912）16.685±3.599 1.915±0.0782）24.955±0.870 2.340±0.3252）13.820±1.0182）1.750±0.0572）0.505±0.1482）16.860±1.089 15.060±1.3861）5.560±0.9052）Groups Control 10 mmol/L propionate 1 mmol/L valerate 10 mmol/L valerate 1 mmol/L isovalerate 10 mmol/L isovalerate 1 mmol/L SCFAs 10 mmol/L SCFAs 100 mmol/L SCFAs 50 nmol/L TSA 100 nmol/L TSA 200 nmol/L TSA IL-4/（pg·ml-1）0.000±0.000 73.565±1.4502）21.090±10.3522）74.580±2.8852）26.675±5.3812）79.940±2.8002）2.355±3.330 67.260±4.5252）31.490±1.4282）32.000±0.7072）52.680±0.0002）75.935±2.8642）IL-13/（pg·ml-1）0.630±0.891 27.760±0.8632）6.895±1.039 29.755±0.8412）13.175±0.7852）39.745±1.7322）1.275±1.803 29.560±0.0002）17.260±7.3822）13.095±3.1472）23.125±1.5492）30.730±1.1032）IL-10/（pg·ml-1）154.530±5.798 64.725±14.1352）84.265±9.6662）35.490±2.6452）112.270±3.0972）53.590±1.0752）52.070±3.7622）44.495±1.6052）10.735±3.7972）71.050±6.8312）47.710±0.2692）53.020±1.8812）TNF-α/（pg·ml-1）720.730±4.469 96.675±5.3532）689.665±10.642 273.785±24.7282）698.100±44.336 243.695±0.7712）226.505±18.9292）151.575±6.2012）0.000±0.0001）737.050±3.606 697.645±31.275 285.68±11.5822）
2.6 高濃度 SCFA 可增加 BV2 細(xì)胞 TNF-α、iNOS mRNA表達(dá)，減少TREM2、Mincle、IL-10、Arg1 mRNA表達(dá) 以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算TREM2、TNF-α、iNOS、Mincle、IL-10、Arg1 mRNA表達(dá)，藥物干預(yù)1 h及24 h后各基因表達(dá)如圖6、圖7。結(jié)果顯示，干預(yù)1 h后，丙酸（10 mmol/L）、異戊酸（1 mmol/L）、異戊酸（10 mmol/L）、TSA（50、100、200 nmol/L）、SCFAs（1 mmol/L）可減少TREM2 mRNA 表達(dá)，TSA（50、100、200 nmol/L）可減少 TNF-α mRNA 表達(dá)，SCFAs（100 mmol/L）可減少iNOS mRNA 表達(dá)，SCFAs（1 mmol/L）可增加 Mincle mRNA 表達(dá)，戊酸（10 mmol/L）、異戊酸（1 mmol/L）、SCFAs（100 mmol/L）可增加 IL-10 mRNA 表達(dá)，戊酸（1 mmol/L）、SCFAs（1 mmol/L）可增加Arg1 mRNA 表達(dá)（P＜0.05）；干預(yù) 24 h，丙酸（10 mmol/L）、戊酸（10 mmol/L）、異戊酸（1、10 mmol/L）、TSA（200 nmol/L）、SCFAs（1、100 mmol/L）可減少 TREM2 mRNA 表達(dá)，TSA（50 nmol/L）、戊酸（1 mmol/L）可增加 TREM2 mRNA表達(dá)，TSA（50、100、200 nmol/L）、戊酸（1 mmol/L）可增加TNF-α mRNA 表達(dá)，丙酸（10 mmol/L）、戊酸（1 mmol/L）、TSA（50、100、200 nmol/L）、SCFAs（10、100mmol/L）可增加iNOSmRNA表達(dá)，丙酸（10 mmol/L）、戊酸（10 mmol/L）、異戊酸（1、10 mmol/L）、TSA（200 nmol/L）、SCFAs（1、10、100 mmol/L）可減少M(fèi)incle mRNA 表達(dá)，TSA（50 nmol/L）可增加 Mincle mRNA 表達(dá)，丙酸（10 mmol/L）、戊酸（1 mmol/L）、異戊酸（1 mmol/L）可增加 IL10 mRNA 表達(dá)，戊酸（10 mmol/L）、異 戊酸（10 mmol/L）、SCFAs（10、100 mmol/L）可減少IL-10 mRNA表達(dá)，戊酸（1 mmol/L）、SCFAs（1 mmol/L）可增加 Arg1 mRNA 表達(dá)，丙酸（10 mmol/L）、戊酸（10 mmol/L）、異戊酸（10 mmol/L）、TSA（50、100、200 nmol/L）、SCFAs（10、100 mmol/L）可減少Arg1 mRNA表達(dá)（P＜0.05）。
圖6 各組藥物干預(yù)1 h 后BV2 細(xì)胞及M1/M2 型代表性基因相對(duì)表達(dá)Fig.6 Relative expression of representative genes in BV2 cells and M1/M2 after drug intervention for 1 h
圖7 各組藥物干預(yù)24 h 后BV2 細(xì)胞及M1/M2 型代表性基因相對(duì)表達(dá)Fig.7 Relative expression of representative genes in BV2 cells and M1/M2 after drug intervention for 24 h
3 討論
腸道菌群在宿主健康和代謝間的相互作用日漸受到關(guān)注，腸道菌群可能通過腸道信號(hào)分子SCFAs在胃腸道健康及代謝中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［14-15］。相關(guān)研究表明SCFAs 可通過增加全身性炎癥活化小膠質(zhì)細(xì)胞，甚至消除脂多糖誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為和海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化［16-17］。小膠質(zhì)細(xì)胞在缺乏SCFA受體的無菌小鼠中顯示出整體缺陷特征，其細(xì)胞比例及表型均未成熟［18］。WENZEL 等［9］還發(fā)現(xiàn) SCFAs混合物及混合物中采用的幾種單個(gè)SCFA 在最高濃度下能夠減少IL-1β、TNF-α 以及免疫刺激后THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒素，并可調(diào)節(jié)阿爾茨海默病患者中受干擾的小膠質(zhì)細(xì)胞，說明SCFAs 能夠通過特殊的腦腸軸對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生作用，但不同濃度和種類SCFAs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響尚不明確。因此探討SCFAs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病臨床治療具有重要意義。
本研究發(fā)現(xiàn)各組藥物干預(yù)1 h 和24 h 后的目的蛋白表達(dá)中，SCFAs與TSA類似，均具有促進(jìn)組蛋白乙?；淖饔茫瑢?duì)與TREM2聚類效果較好的乙?；稽c(diǎn)H3K27、H4K8 產(chǎn)生影響，且趨勢(shì)基本一致。有學(xué)者認(rèn)為組蛋白乙酰化是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的一種機(jī)制，具有神經(jīng)保護(hù)和抗炎特性［19-20］。而小膠質(zhì)細(xì)胞活化后產(chǎn)生的效應(yīng)基因需受到組蛋白乙?；{(diào)節(jié)［21］。研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞可向兩個(gè)方向活化，一為促炎M1型，利用產(chǎn)生的IL-6、IL-12、TNF-α等促炎因子阻止組織恢復(fù)，加劇神經(jīng)元及白質(zhì)損傷［22］；二為抗炎M2型，利用產(chǎn)生的IL-4、IL-10、IL-13、特異性標(biāo)志物Arg1 及TGF-β 等抑制炎癥產(chǎn)生，保護(hù)神經(jīng)元及白質(zhì)［23］。即M1 和 M2 型活化是通過組蛋白修飾而發(fā)生的。ELISA顯示大部分組別均能促進(jìn)IL-4、IL-13釋放，但I(xiàn)L-10釋放卻被減緩，原因可能在于抗炎M2型有3個(gè)亞型，其中M2a由具有長(zhǎng)期功能的附加產(chǎn)物或相關(guān)信號(hào)（IL-4、IL-13）激活，M2b 由Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）和免疫復(fù)合物激活，M2c 由 IL-10、TGF-β 和糖皮質(zhì)激素激活［24］。說明藥物干預(yù)后的小膠質(zhì)細(xì)胞處于較強(qiáng)的M2a 活化環(huán)境。其中，高濃度SCFAs或TSA能減緩iNOS、TNF-α釋放。iNOS 是 M1 表型的功能標(biāo)志物，TNF-α 是 M1 型釋放的促炎因子，說明高濃度SCFAs 或TSA 不會(huì)使BV2細(xì)胞向M1型活化。
本研究還發(fā)現(xiàn)高濃度SCFAs 及TSA 干預(yù)后的BV2 細(xì)胞24 h 后基本退出增殖周期，且高濃度SCFAs可隨時(shí)間延長(zhǎng)增強(qiáng)對(duì)BV2細(xì)胞活性的抑制作用。TREM2 作為主要存在于小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫受體，在高濃度SCFAs干預(yù)下，其mRNA表達(dá)減少正好驗(yàn)證上述結(jié)果［25］。說明BV2 細(xì)胞退出增殖周期后，可能僅表達(dá)一些功能相關(guān)基因。各組藥物干預(yù)1 h后 TNF-α、iNOS mRNA 表達(dá)有一定下降，但 24 h 后大多明顯上升，而IL-10、Arg1、Mincle mRNA 表達(dá)正好相反，且高濃度SCFAs 及TSA 比低濃度SCFAs 及TSA 隨時(shí)間延長(zhǎng)下降更為明顯，尤其是Arg1 表達(dá)。研究表明Mincle 是巨噬細(xì)胞表面重要的模式識(shí)別受體，可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)觸發(fā)促炎因子釋放［26］，但其表達(dá)趨勢(shì)卻與TNF-α、iNOS趨勢(shì)相反，IL-10、Arg1表達(dá)趨勢(shì)與上文ELISA 結(jié)果也不一致。課題組結(jié)合兩個(gè)結(jié)果分析，猜測(cè)可能是因?yàn)楦邼舛萐CFAs 與TSA 在 24 h 內(nèi)干預(yù) BV2 細(xì)胞可促進(jìn) BV2 細(xì)胞向M2 型活化，但24 h 后BV2 細(xì)胞基因表型逐漸從M2 型向M1 型轉(zhuǎn)變?？赡芘c小膠質(zhì)細(xì)胞用于維持穩(wěn)態(tài)表型轉(zhuǎn)移能力有關(guān)［27］。說明適當(dāng)時(shí)間范圍內(nèi)掌握M1/M2 表型特定階段轉(zhuǎn)換可能具有更好的治療效果，還需進(jìn)一步探索。
綜上所述，SCFAs 具有類似TSA 的促進(jìn)組蛋白乙?；饔?，而高濃度SCFAs 可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，干預(yù)早期（24 h 內(nèi)）促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2a 型活化，干預(yù)晚期（24 h 后）促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞從M2 型向M1 型活化。本研究闡明了SCFAs對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化及組蛋白乙酰化水平的影響，為治療神經(jīng)炎癥相關(guān)中樞系統(tǒng)疾病提供了思路。
猜你喜歡
抑癌蛋白p53乙酰化修飾的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)(2022年8期)2022-09-08 00:39:50 柴胡桂枝湯聯(lián)合戊酸雌二醇片治療更年期綜合征的臨床觀察中國(guó)民間療法(2021年10期)2021-07-22 02:33:12 食品中丙酸鈉、丙酸鈣測(cè)定方法的改進(jìn)現(xiàn)代食品(2016年24期)2016-04-28 08:12:06 慢性支氣管哮喘小鼠肺組織中組蛋白H3乙?；揎椩鰪?qiáng)中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志(2016年4期)2016-02-27 11:15:53 丙戊酸鎂合并艾司西酞普蘭治療抑郁癥對(duì)照研究中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理(2015年5期)2016-01-14 05:16:56 K/γ-Al2O3催化丙酸甲酯合成甲基丙烯酸甲酯化工進(jìn)展(2015年3期)2015-11-11 09:07:41 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中國(guó)學(xué)術(shù)期刊文摘(2015年8期)2015-10-29 09:51:18 2-18F-氟丙酸在正常小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布醫(yī)學(xué)研究雜志(2015年5期)2015-06-10 06:43:26 組蛋白去乙?；敢种苿┑难芯窟M(jìn)展中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥(2015年16期)2015-03-01 02:03:13 H3PW12O40/Y-β催化丙酸異戊酯的綠色合成應(yīng)用化工(2014年3期)2014-08-16 13:23:50
楊光露 郭 楊 馬 勇 潘婭嵐 劉孟敏 吳承杰 涂鵬程
（南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023）
近年大量報(bào)道稱腸道菌群不僅參與人類多種疾病（如糖尿病、結(jié)腸癌、肥胖等）發(fā)生發(fā)展過程，還可能參與全身性炎癥反應(yīng)，甚至下調(diào)全身和腦部炎癥反應(yīng)［1-6］。腸道菌群主要發(fā)酵產(chǎn)物短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFAs）包括乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽等，可參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在“腦腸軸”中具有重要意義［7］。而小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦組織中的巨噬細(xì)胞，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后功能恢復(fù)尤為重要［8］。研究表明SCFAs 可通過血腦屏障與小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用從而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)［9］。
目前研究多數(shù)基于某一類或總的SCFAs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的作用，如乙酸鹽可通過誘導(dǎo)組蛋白乙酰化增加脂多糖刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞中脂肪酸含量［10］；丁酸鹽可減弱老齡小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子表達(dá)［11］；SCFAs 可通過循環(huán)的淋巴細(xì)胞介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化改善卒中后恢復(fù)［12］。但具體濃度及種類的SCFAs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞帶來多大影響尚不明確。本研究通過選取組蛋白乙?；畛Ｒ娢稽c(diǎn)，從6 種SCFAs 的3 個(gè)濃度中篩選最能反映組蛋白乙?；降慕M別及干預(yù)時(shí)間，從而探討SCFAs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化及組蛋白乙?；淖饔?。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 小鼠永生化小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞（拜瑞，江蘇）。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 乙?；M蛋白H3、H4 抗體試劑盒（#9927、#8346，CST）；引發(fā)髓性細(xì)胞受體表達(dá)2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）兔多克隆抗體（#YN2124，Immuno Way）；RIPA 裂解液（強(qiáng)）（#P0013B，碧云天）；小鼠IL-4、IL-13、IL-10、TNF-α ELISA 試劑盒（#FMS-ELM004、#FMS-ELM014、#FMS-ELM009、#FMS-ELM028，福麥斯）；小鼠一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）ELISA 試劑盒（#KE1426，Immuno Way）；RNA 提取試劑盒（#RC101，Vazyme）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（#R223，Vazyme）；所有引物均由上海生工合成。
1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 高速冰凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Peking Elmer）；實(shí)時(shí)熒光定量分析儀（美國(guó) ThermoFisher）；WB 設(shè)備（美國(guó)Bio-Rad）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus）。
1.2 方法
1.2.1 永生化BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及分組 采用含胎牛血清、雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基37 ℃常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行1∶2 傳代。根據(jù)SCFAs相對(duì)分子量配制不同濃度SCFAs的高糖培養(yǎng)基，細(xì)胞分為以下組別：對(duì)照組、乙酸組、丙酸組、丁酸組、異丁酸組、戊酸組、異戊酸組、SCFAs 組、組蛋白去乙?；敢种苿┣琶顾兀╰richostatin A，TSA）組，除對(duì)照組外各組均設(shè)置1、10、100 mmol/L 3種濃度。上述實(shí)驗(yàn)均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。
1.2.2 Dot blot 篩選與TREM2 關(guān)聯(lián)的組蛋白乙?；稽c(diǎn)及SCFAs濃度 取各組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BV2細(xì)胞，加入RIPA 裂解液（含1%PMSF）裂解細(xì)胞，細(xì)胞刷刮下細(xì)胞，離心，取上清，BCA 測(cè)定各組蛋白含量，配平后加入總量1/4 的上樣緩沖液（5×）混勻，95 ℃煮沸10 min。用鉛筆在硝酸纖維膜上畫0.25 cm2小格，將 1 μl 樣本點(diǎn)進(jìn)小格，各樣本重復(fù)2 次，用含5%BSA 的TBST 溶 液 封 閉 1 h，加 入 一 抗 孵 育30 min，加入二抗孵育30 min，曝光觀察圖像。
1.2.3 Western blot 驗(yàn)證篩選出的乙?；稽c(diǎn)及SCFAs 濃度 蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，TBST 溶液（含5%脫脂奶粉）封閉2 h，加入TREM2、GAPDH、H3、H4、H3K27、H4K8 等一抗 4 ℃孵育過夜，次日回收一抗，快速搖洗3 遍，加入二抗室溫孵育2 h，快速搖洗3遍，曝光顯像，采用Image J軟件定量分析蛋白條帶。
1.2.4 CCK8 法檢測(cè)不同濃度 SCFAs 對(duì) BV2 細(xì)胞活性的影響 取各組藥物干預(yù)24 h 的BV2 細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，110 μl/孔加入現(xiàn)配的 DMEM 培養(yǎng)基及CCK8 溶液混合液37 ℃避光孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm及650 nm處吸光度。
1.2.5 免疫熒光染色檢測(cè)不同濃度SCFAs 對(duì)BV2細(xì)胞特異性標(biāo)志物Iba1 熒光表達(dá)的影響 取各組藥物干預(yù)24 h 后的BV2 細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定 10 min，0.2%Triton X-100 通透 5 min，PBS 清洗，加入一抗4 ℃孵育過夜，加入熒光二抗室溫孵育 1 h，DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，PBS 清洗，熒光倒置顯微鏡下觀察Iba1染色情況。
1.2.6 ELISA 檢測(cè)不同濃度 SCFAs 對(duì) BV2 細(xì)胞炎癥因子分泌的影響 取各組藥物干預(yù)24 h后的BV2細(xì)胞培養(yǎng)上清，1 000 g離心10 min，收集上清。根據(jù)說明書配制溶液，將樣本和各濃度標(biāo)準(zhǔn)品按100μl/孔加入相應(yīng)孔，37 ℃孵育90 min，4次洗板后按100 μl/孔加入生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min，4 次洗板后按100 μl/孔加入酶結(jié)合物工作液37 ℃孵育30 min，4 次洗板后加入顯色液，37 ℃避光孵育20 min，加入終止液，吹打均勻后酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm及630 nm處吸光度。
1.2.7 qRT-PCR 檢測(cè)不同藥物干預(yù) 1 h 和 24 h 對(duì)BV2細(xì)胞表型標(biāo)志物及相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響取各組藥物干預(yù)1 h 和24 h 后的BV2 細(xì)胞，加入裂解液消化、裂解，反復(fù)吹打混勻，柱提法提取總RNA，將 M1 表型相關(guān)基因 TNF-α、iNOS、M2 表型相關(guān)基因IL-10、精氨酸酶1（arginase1，Arg1）及小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物TREM2、表面模式識(shí)別受體巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型C 型凝集素受體（monocyte-inducible C-type lectin，Mincle）mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，PCR 擴(kuò)增，2-ΔΔCt法處理PCR數(shù)據(jù)。引物序列見表1。
表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Sidak檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 Dot blot 篩選與TREM2 關(guān)聯(lián)較強(qiáng)的乙?；稽c(diǎn) H4K8、H3K27 及相關(guān) SCFAs 濃度 Dot blot 條帶如圖1。以GAPDH、H3、H4分別作為TREM2、H3K9、H3K14、H3K18、H3K27、H3K56、H4K5、H4K8、H4K12 內(nèi)參，根據(jù)目的蛋白間相關(guān)性繪制聚類熱圖，如圖2。結(jié)果顯示，不同藥物干預(yù)1 h 后，H4K12、H4K8 與 TREM2 蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)性最大，干預(yù)24 h 后，H4K5、H4K8、H4K12 與 TREM2 蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)性最大。由于H3 中無特別突出位點(diǎn)，課題組選擇H4 突出位點(diǎn)H4K8 及相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)的H3 突出位點(diǎn) H3K27［13］，其中丙酸組（10 mmol/L）、戊酸組（1、10 mmol/L）、異戊酸組（1、10 mmol/L）、SCFAs 組（1、10、100 mmol/L）、TSA 組（50、100、200 nmol/L）中H3K27、H4K8 蛋白表達(dá)與TREM2 蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)性最大。
圖1 Dot blot 檢測(cè)各組藥物干預(yù)后各乙酰化位點(diǎn)蛋白表達(dá)情況Fig.1 Dot blot detected protein expression of acetylation sites after drug intervention in each group
圖2 各組藥物干預(yù)1 h、24 h后各乙酰化位點(diǎn)蛋白表達(dá)情況Fig.2 Protein expressions of acetylation sites in each group after drug intervention for 1 h and 24 h
2.2 Western blot 驗(yàn)證相關(guān) SCFAs 濃度下 H3K27、H4K8 與 TREM2 蛋 白表 達(dá) Western blot 條 帶如圖3A、圖4A，以GAPDH、H3、H4 分別作為TREM2、H3K27、H4K8 內(nèi)參，根據(jù)目的蛋白間相關(guān)性繪制聚類熱圖，如圖3B、圖4B。結(jié)果顯示，H3K27、H4K8與TREM2關(guān)聯(lián)性較大，聚類較好；各組藥物干預(yù)1 h后BV2細(xì)胞蛋白與對(duì)照組表達(dá)差異較大的有：H4K8表達(dá)中異戊酸組（10 mmol/L）、TSA 組（50、100、200 nmol/L）、SCFAs 組（100 mmol/L），TREM2 表達(dá)中TSA 組（100、200 nmol/L）、SCFAs 組（100 mmol/L），H3K27 表達(dá)中異戊酸組（10 mmol/L）、TSA 組（50 nmol/L）；各組藥物干預(yù)24 h 后蛋白與對(duì)照組表達(dá)差異較大的有：H4K8表達(dá)中除丙酸組（10 mmol/L）、戊酸組（10 mmol/L）外的其余各組，TREM2 表達(dá)中戊酸組（1 mmol/L）、異戊酸組（10 mmol/L）、TSA 組（200 nmol/L）、SCFAs組（100 mmol/L），H3K27表達(dá)中除丙酸組（10 mmol/L）、戊酸組（10 mmol/L）外的其余各組。
圖3 各組藥物干預(yù) 1 h 后 BV2 細(xì)胞 H3K27、H4K8 蛋白表達(dá)情況Fig.3 Protein expressions of H3K27 and H4K8 in BV2 cells after drug intervention in each group for 1 h
圖4 各組藥物干預(yù) 24 h 后 BV2 細(xì)胞 H3K27、H4K8 蛋白表達(dá)情況Fig.4 Protein expressions of H3K27 and H4K8 in BV2 cells after drug intervention in each group for 24 h
2.3 CCK8 顯示高濃度SCFAs 抑制BV2 細(xì)胞活性以對(duì)照組為參照計(jì)算各組藥物干預(yù)24 h 后BV2細(xì)胞相對(duì)增殖率，結(jié)果顯示，10 mmol/L 丙酸、戊酸、異戊酸和SCFAs，100 mmol/L SCFAs，100、200 nmol/L TSA均可抑制BV2細(xì)胞活性（P＜0.01，表2）。
表2 各組藥物干預(yù)24 h后BV2細(xì)胞相對(duì)增殖率（）Tab.2 Relative proliferation rate of BV2 cells after 24 h of drug intervention in each group（）
Note：Compared with Control group，1）P＜0.01.
Relative proliferation rate of BV2 cells/%100.000±5.405 64.376±5.4701）99.261±6.185 61.679±2.7281）96.042±5.253 64.593±3.9361）92.692±6.902 75.990±3.9711）22.358±0.9021）100.217±5.544 78.425±3.6181）67.508±0.3301）Groups Control 10 mmol/L propionate 1 mmol/L valerate 10 mmol/L valerate 1 mmol/L isovalerate 10 mmol/L isovalerate 1 mmol/L SCFAs 10 mmol/L SCFAs 100 mmol/L SCFAs 50 nmol/L TSA 100 nmol/L TSA 200 nmol/L TSA
2.4 免疫熒光染色顯示SCFAs 可隨時(shí)間延長(zhǎng)增強(qiáng)對(duì)BV-2 細(xì)胞增殖的抑制作用 各組藥物干預(yù)1、3、5 d 后 BV2 細(xì)胞 Iba1 免疫熒光染色如圖 5。Image J處理圖像，以相對(duì)熒光強(qiáng)度衡量各組藥物干預(yù)效果，結(jié)果顯示，第1 天10 mmol/L 丙酸及100 nmol/L TSA 組Iba1 平均熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05），第3 天無明顯變化，第 5 天除 10 mmol/L 丙酸、1 mmol/L 戊酸、200 nmol/L TSA 外其余各組Iba1 平均熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05，表 3）。表明調(diào)節(jié) Iba1 表達(dá)時(shí)，各濃度SCFAs 作用與TSA 類似，且可隨著時(shí)間延長(zhǎng)增強(qiáng)對(duì)BV2細(xì)胞活性的抑制作用。
表3 各組藥物干預(yù)BV2 細(xì)胞后Iba1 染色平均熒光強(qiáng)度（）Tab.3 Average fluorescence intensity of Iba1 staining of BV2 cells after intervention of drugs in each group（）
表3 各組藥物干預(yù)BV2 細(xì)胞后Iba1 染色平均熒光強(qiáng)度（）Tab.3 Average fluorescence intensity of Iba1 staining of BV2 cells after intervention of drugs in each group（）
Note：Compared with Control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01.
5 d 1.000±0.121 0.933±0.072 0.873±0.078 0.750±0.1071）0.733±0.0641）0.753±0.0551）0.696±0.1422）0.673±0.0552）0.568±0.2142）0.636±0.1252）0.302±0.0052）0.823±0.085 Groups Control 10 mmol/L propionate 1 mmol/L valerate 10 mmol/L valerate 1 mmol/L isovalerate 10 mmol/L isovalerate 1 mmol/L SCFAs 10 mmol/L SCFAs 100 mmol/L SCFAs 50 nmol/L TSA 100 nmol/L TSA 200 nmol/L TSA 1 d 1.000±0.048 0.690±0.0692）0.753±0.205 1.013±0.112 0.855±0.192 0.979±0.071 0.911±0.083 1.017±0.077 0.706±0.247 1.051±0.238 0.629±0.1002）0.964±0.061 3 d 1.000±0.051 1.016±0.072 1.003±0.065 0.931±0.236 0.871±0.209 0.920±0.160 0.966±0.085 0.987±0.119 1.239±0.159 0.862±0.052 0.906±0.060 0.911±0.061
圖5 各組藥物干預(yù)BV2 細(xì)胞后Iba1 熒光染色表達(dá)情況（×100）Fig.5 Expression of Iba1 fluorescence staining in BV2 cells after intervention of drugs in each group（×100）
2.5 SCFAs 可促進(jìn) IL-4、IL-13 釋放，高濃度 SCFAs可減緩IL-10、TNF-α、iNOS 釋放 與對(duì)照組相比，丙酸（10 mmol/L）、戊酸（1、10 mmol/L）、異戊酸（1、10 mmol/L）、TSA（50、100、200 nmol/L）、SCFAs（10、100 mmol/L）可促進(jìn) IL-4 釋放（P＜0.05），SCFAs（1 mmol/L）對(duì)IL-4 釋放無顯著促進(jìn)作用（P＞0.05）；丙酸（10 mmol/L）、戊酸（10 mmol/L）、異戊酸（1、10 mmol/L）、TSA（50、100、200 nmol/L）、SCFAs（10、100mmol/L）可促進(jìn)IL-13釋放（P＜0.05），戊酸（1mmol/L）、SCFAs（1 mmol/L）對(duì)IL-13釋放無顯著影響（P＞0.05）；丙酸（10 mmol/L）、戊酸（1、10 mmol/L）、異戊酸（1、10 mmol/L）、TSA（50、100、200 nmol/L）、SCFAs（1、10、100 mmol/L）可減 緩 IL-10 釋 放（P＜0.05）；丙 酸（10 mmol/L）、戊酸（10 mmol/L）、異戊酸（10 mmol/L）、TSA（200 nmol/L）、SCFAs（1、10、100 mmol/L）可減緩TNF-α 釋放（P＜0.05），但戊酸（1 mmol/L）、異戊酸（1 mmol/L）、TSA（50、100 nmol/L）對(duì) TNF-α 釋放無明 顯 作用（P＞0.05）；丙酸（10 mmol/L）、戊 酸（10 mmol/L）、異 戊 酸（10 mmol/L）、TSA（100、200 nmol/L）、SCFAs 組（1、10、100 mmol/L）均可減緩iNOS 釋放（P＜0.05），但戊酸（1 mmol/L）、異戊酸（1 mmol/L）、TSA（50 nmol/L）對(duì) iNOS 釋放無明顯作用（P＞0.05，表4）。
表4 SCFAs對(duì)BV2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（）Tab.4 Effects of SCFAs on expressions of inflammatory factors in BV2 cells（）
表4 SCFAs對(duì)BV2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（）Tab.4 Effects of SCFAs on expressions of inflammatory factors in BV2 cells（）
Note：Compared with Control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01.
iNOS/（ng·ml-1）24.645±6.668 4.560±0.8912）16.685±3.599 1.915±0.0782）24.955±0.870 2.340±0.3252）13.820±1.0182）1.750±0.0572）0.505±0.1482）16.860±1.089 15.060±1.3861）5.560±0.9052）Groups Control 10 mmol/L propionate 1 mmol/L valerate 10 mmol/L valerate 1 mmol/L isovalerate 10 mmol/L isovalerate 1 mmol/L SCFAs 10 mmol/L SCFAs 100 mmol/L SCFAs 50 nmol/L TSA 100 nmol/L TSA 200 nmol/L TSA IL-4/（pg·ml-1）0.000±0.000 73.565±1.4502）21.090±10.3522）74.580±2.8852）26.675±5.3812）79.940±2.8002）2.355±3.330 67.260±4.5252）31.490±1.4282）32.000±0.7072）52.680±0.0002）75.935±2.8642）IL-13/（pg·ml-1）0.630±0.891 27.760±0.8632）6.895±1.039 29.755±0.8412）13.175±0.7852）39.745±1.7322）1.275±1.803 29.560±0.0002）17.260±7.3822）13.095±3.1472）23.125±1.5492）30.730±1.1032）IL-10/（pg·ml-1）154.530±5.798 64.725±14.1352）84.265±9.6662）35.490±2.6452）112.270±3.0972）53.590±1.0752）52.070±3.7622）44.495±1.6052）10.735±3.7972）71.050±6.8312）47.710±0.2692）53.020±1.8812）TNF-α/（pg·ml-1）720.730±4.469 96.675±5.3532）689.665±10.642 273.785±24.7282）698.100±44.336 243.695±0.7712）226.505±18.9292）151.575±6.2012）0.000±0.0001）737.050±3.606 697.645±31.275 285.68±11.5822）
2.6 高濃度 SCFA 可增加 BV2 細(xì)胞 TNF-α、iNOS mRNA表達(dá)，減少TREM2、Mincle、IL-10、Arg1 mRNA表達(dá) 以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算TREM2、TNF-α、iNOS、Mincle、IL-10、Arg1 mRNA表達(dá)，藥物干預(yù)1 h及24 h后各基因表達(dá)如圖6、圖7。結(jié)果顯示，干預(yù)1 h后，丙酸（10 mmol/L）、異戊酸（1 mmol/L）、異戊酸（10 mmol/L）、TSA（50、100、200 nmol/L）、SCFAs（1 mmol/L）可減少TREM2 mRNA 表達(dá)，TSA（50、100、200 nmol/L）可減少 TNF-α mRNA 表達(dá)，SCFAs（100 mmol/L）可減少iNOS mRNA 表達(dá)，SCFAs（1 mmol/L）可增加 Mincle mRNA 表達(dá)，戊酸（10 mmol/L）、異戊酸（1 mmol/L）、SCFAs（100 mmol/L）可增加 IL-10 mRNA 表達(dá)，戊酸（1 mmol/L）、SCFAs（1 mmol/L）可增加Arg1 mRNA 表達(dá)（P＜0.05）；干預(yù) 24 h，丙酸（10 mmol/L）、戊酸（10 mmol/L）、異戊酸（1、10 mmol/L）、TSA（200 nmol/L）、SCFAs（1、100 mmol/L）可減少 TREM2 mRNA 表達(dá)，TSA（50 nmol/L）、戊酸（1 mmol/L）可增加 TREM2 mRNA表達(dá)，TSA（50、100、200 nmol/L）、戊酸（1 mmol/L）可增加TNF-α mRNA 表達(dá)，丙酸（10 mmol/L）、戊酸（1 mmol/L）、TSA（50、100、200 nmol/L）、SCFAs（10、100mmol/L）可增加iNOSmRNA表達(dá)，丙酸（10 mmol/L）、戊酸（10 mmol/L）、異戊酸（1、10 mmol/L）、TSA（200 nmol/L）、SCFAs（1、10、100 mmol/L）可減少M(fèi)incle mRNA 表達(dá)，TSA（50 nmol/L）可增加 Mincle mRNA 表達(dá)，丙酸（10 mmol/L）、戊酸（1 mmol/L）、異戊酸（1 mmol/L）可增加 IL10 mRNA 表達(dá)，戊酸（10 mmol/L）、異 戊酸（10 mmol/L）、SCFAs（10、100 mmol/L）可減少IL-10 mRNA表達(dá)，戊酸（1 mmol/L）、SCFAs（1 mmol/L）可增加 Arg1 mRNA 表達(dá)，丙酸（10 mmol/L）、戊酸（10 mmol/L）、異戊酸（10 mmol/L）、TSA（50、100、200 nmol/L）、SCFAs（10、100 mmol/L）可減少Arg1 mRNA表達(dá)（P＜0.05）。
圖6 各組藥物干預(yù)1 h 后BV2 細(xì)胞及M1/M2 型代表性基因相對(duì)表達(dá)Fig.6 Relative expression of representative genes in BV2 cells and M1/M2 after drug intervention for 1 h
圖7 各組藥物干預(yù)24 h 后BV2 細(xì)胞及M1/M2 型代表性基因相對(duì)表達(dá)Fig.7 Relative expression of representative genes in BV2 cells and M1/M2 after drug intervention for 24 h
3 討論
腸道菌群在宿主健康和代謝間的相互作用日漸受到關(guān)注，腸道菌群可能通過腸道信號(hào)分子SCFAs在胃腸道健康及代謝中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［14-15］。相關(guān)研究表明SCFAs 可通過增加全身性炎癥活化小膠質(zhì)細(xì)胞，甚至消除脂多糖誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為和海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化［16-17］。小膠質(zhì)細(xì)胞在缺乏SCFA受體的無菌小鼠中顯示出整體缺陷特征，其細(xì)胞比例及表型均未成熟［18］。WENZEL 等［9］還發(fā)現(xiàn) SCFAs混合物及混合物中采用的幾種單個(gè)SCFA 在最高濃度下能夠減少IL-1β、TNF-α 以及免疫刺激后THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒素，并可調(diào)節(jié)阿爾茨海默病患者中受干擾的小膠質(zhì)細(xì)胞，說明SCFAs 能夠通過特殊的腦腸軸對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生作用，但不同濃度和種類SCFAs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響尚不明確。因此探討SCFAs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病臨床治療具有重要意義。
本研究發(fā)現(xiàn)各組藥物干預(yù)1 h 和24 h 后的目的蛋白表達(dá)中，SCFAs與TSA類似，均具有促進(jìn)組蛋白乙?；淖饔茫瑢?duì)與TREM2聚類效果較好的乙?；稽c(diǎn)H3K27、H4K8 產(chǎn)生影響，且趨勢(shì)基本一致。有學(xué)者認(rèn)為組蛋白乙酰化是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的一種機(jī)制，具有神經(jīng)保護(hù)和抗炎特性［19-20］。而小膠質(zhì)細(xì)胞活化后產(chǎn)生的效應(yīng)基因需受到組蛋白乙?；{(diào)節(jié)［21］。研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞可向兩個(gè)方向活化，一為促炎M1型，利用產(chǎn)生的IL-6、IL-12、TNF-α等促炎因子阻止組織恢復(fù)，加劇神經(jīng)元及白質(zhì)損傷［22］；二為抗炎M2型，利用產(chǎn)生的IL-4、IL-10、IL-13、特異性標(biāo)志物Arg1 及TGF-β 等抑制炎癥產(chǎn)生，保護(hù)神經(jīng)元及白質(zhì)［23］。即M1 和 M2 型活化是通過組蛋白修飾而發(fā)生的。ELISA顯示大部分組別均能促進(jìn)IL-4、IL-13釋放，但I(xiàn)L-10釋放卻被減緩，原因可能在于抗炎M2型有3個(gè)亞型，其中M2a由具有長(zhǎng)期功能的附加產(chǎn)物或相關(guān)信號(hào)（IL-4、IL-13）激活，M2b 由Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）和免疫復(fù)合物激活，M2c 由 IL-10、TGF-β 和糖皮質(zhì)激素激活［24］。說明藥物干預(yù)后的小膠質(zhì)細(xì)胞處于較強(qiáng)的M2a 活化環(huán)境。其中，高濃度SCFAs或TSA能減緩iNOS、TNF-α釋放。iNOS 是 M1 表型的功能標(biāo)志物，TNF-α 是 M1 型釋放的促炎因子，說明高濃度SCFAs 或TSA 不會(huì)使BV2細(xì)胞向M1型活化。
本研究還發(fā)現(xiàn)高濃度SCFAs 及TSA 干預(yù)后的BV2 細(xì)胞24 h 后基本退出增殖周期，且高濃度SCFAs可隨時(shí)間延長(zhǎng)增強(qiáng)對(duì)BV2細(xì)胞活性的抑制作用。TREM2 作為主要存在于小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫受體，在高濃度SCFAs干預(yù)下，其mRNA表達(dá)減少正好驗(yàn)證上述結(jié)果［25］。說明BV2 細(xì)胞退出增殖周期后，可能僅表達(dá)一些功能相關(guān)基因。各組藥物干預(yù)1 h后 TNF-α、iNOS mRNA 表達(dá)有一定下降，但 24 h 后大多明顯上升，而IL-10、Arg1、Mincle mRNA 表達(dá)正好相反，且高濃度SCFAs 及TSA 比低濃度SCFAs 及TSA 隨時(shí)間延長(zhǎng)下降更為明顯，尤其是Arg1 表達(dá)。研究表明Mincle 是巨噬細(xì)胞表面重要的模式識(shí)別受體，可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)觸發(fā)促炎因子釋放［26］，但其表達(dá)趨勢(shì)卻與TNF-α、iNOS趨勢(shì)相反，IL-10、Arg1表達(dá)趨勢(shì)與上文ELISA 結(jié)果也不一致。課題組結(jié)合兩個(gè)結(jié)果分析，猜測(cè)可能是因?yàn)楦邼舛萐CFAs 與TSA 在 24 h 內(nèi)干預(yù) BV2 細(xì)胞可促進(jìn) BV2 細(xì)胞向M2 型活化，但24 h 后BV2 細(xì)胞基因表型逐漸從M2 型向M1 型轉(zhuǎn)變?？赡芘c小膠質(zhì)細(xì)胞用于維持穩(wěn)態(tài)表型轉(zhuǎn)移能力有關(guān)［27］。說明適當(dāng)時(shí)間范圍內(nèi)掌握M1/M2 表型特定階段轉(zhuǎn)換可能具有更好的治療效果，還需進(jìn)一步探索。
綜上所述，SCFAs 具有類似TSA 的促進(jìn)組蛋白乙?；饔?，而高濃度SCFAs 可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，干預(yù)早期（24 h 內(nèi)）促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2a 型活化，干預(yù)晚期（24 h 后）促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞從M2 型向M1 型活化。本研究闡明了SCFAs對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化及組蛋白乙酰化水平的影響，為治療神經(jīng)炎癥相關(guān)中樞系統(tǒng)疾病提供了思路。
猜你喜歡
中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)(2022年8期)2022-09-08 00:39:50
中國(guó)民間療法(2021年10期)2021-07-22 02:33:12
現(xiàn)代食品(2016年24期)2016-04-28 08:12:06
中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志(2016年4期)2016-02-27 11:15:53
中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理(2015年5期)2016-01-14 05:16:56
化工進(jìn)展(2015年3期)2015-11-11 09:07:41
中國(guó)學(xué)術(shù)期刊文摘(2015年8期)2015-10-29 09:51:18
醫(yī)學(xué)研究雜志(2015年5期)2015-06-10 06:43:26
中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥(2015年16期)2015-03-01 02:03:13
應(yīng)用化工(2014年3期)2014-08-16 13:23:50
