管芩瀾，龔明福

（樂山師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，四川 樂山 614004）

0 引言

青梅(Prunus mume(Sieb.) Sieb.et zucc.)，又稱為酸梅、果梅，為薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)植物，主要分布于中國、日本、韓國、朝鮮、泰國等亞洲國家以及歐洲及美國等地。我國是青梅的原產(chǎn)地及世界上適合生產(chǎn)青梅地域最廣的國家，廣東、廣西、四川、浙江、江蘇、福建及臺灣等18 個?。ㄗ灾螀^(qū)）均適合生產(chǎn)。青梅不僅營養(yǎng)豐富[2-3]，還具有獨特的藥用價值[4-8]，中國古代藥典均有著青梅的諸多藥用記載。目前對青梅的研究主要集中于青梅種質(zhì)資源開發(fā)[9-10]、栽培技術(shù)[11]、加工產(chǎn)品[12-14]、病蟲害防治[15-17]等方面，對青梅的菌根真菌研究鮮見報道。項目組通過近三年對馬邊縣三河口鎮(zhèn)青梅林的觀察和了解，發(fā)現(xiàn)青梅菌只能生長在青梅林下，并且青梅菌子實體僅在4 月上旬到5月上旬出現(xiàn)（土壤溫度13～18 ℃）。

青梅菌，是青梅的一種外生菌根真菌，學(xué)名為晶蓋粉褶菌（Entoloma clypeatum），隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，層菌綱(Hymenomycet)，傘菌目(Agaricales)，粉褶菌科(Entolomataceae) 粉褶菌屬（Entoloma(Fr.) P.Kumm.），能夠與薔薇科的薔薇屬、梨屬、李屬、海棠屬等植物形成外生菌根[18-20]。青梅菌作為粉褶菌屬成員之一，在食用和醫(yī)療具有較高的經(jīng)濟(jì)價值[21-23]。我國對粉褶菌屬真菌的研究主要集中在分類上，對粉褶菌進(jìn)行分離培養(yǎng)和人工栽培方面的研究未見報道，國外學(xué)者從組織中和通過擔(dān)孢子分離獲得了晶蓋粉褶菌的遺傳多樣性的菌株[24-28]，并回接杜梨獲得子實體[29]。

菌根真菌是一類能夠與木本植物共生形成外生菌根的大型真菌，中國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可食用菌根真菌有677 種，占食用菌種類70%[22]。由于菌根真菌生長的特殊性，一直以來沒有得到人類的重視。除松口蘑、紅菇等少數(shù)菌根菌被開發(fā)利用外，大多數(shù)都任其自生自滅，青梅菌目前仍處于這樣的狀態(tài)。

因此，栽培青梅菌的價值與意義十分重大。本研究擬通過人工分離獲得青梅菌菌絲體，研究青梅菌菌絲生長所需要的營養(yǎng)條件和溫度需求，為青梅菌的半人工栽培和人工栽培提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

青梅菌菌絲體分離和培養(yǎng)用PDA 培養(yǎng)基。

青梅菌原種培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基配方如下：基礎(chǔ)配方為麩皮10%，石灰1%，石膏1%，供試材料為玉米粒、玉米渣、棉籽殼、木屑和麥粒，添加量均為88%。

1.2 青梅菌菌絲的分離與純化

青梅菌子實體于2020 年4 月5 日采集自四川省樂山市馬邊彝族自治縣三河口鄉(xiāng)王家覺壩村（經(jīng)度103.352°，緯度28.894°，海拔：1 228.54 m），氣溫16 ℃，土壤溫度14 ℃（見圖1、圖2）。

圖1 青梅菌子實體采集地點

圖2 青梅菌生長環(huán)境

采集到的青梅菌子實體當(dāng)日送到實驗室，依次用75%的乙醇和5%的次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒，用無菌解剖刀去除消毒后的表皮后，用無菌解剖針挑取黃豆粒大小的組織塊，接種于PDA平板上，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)3～5d[30]，取生長良好、無雜菌污染的菌絲在PDA 平板上進(jìn)一步純化獲得青梅菌純培養(yǎng)[31-32]，保存于PDA 斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.3 溫度對青梅菌母種菌絲生長的影響

用無菌打孔器將培養(yǎng)在PDA 平板上青梅菌菌絲體打成圓形菌餅（直徑7 mm），用解剖針將青梅菌菌餅接種到新鮮的PDA 平板中央，分別放置在11 ℃、17 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，測定菌落直徑，計算青梅菌母種菌絲日均生長速率。

1.4 溫度對青梅菌原種菌絲生長的影響

采用棉籽殼培養(yǎng)基，按配方配好料后，分裝到100 mL 的組培瓶中，每瓶分裝2/3 體積，121 ℃40 min 滅菌，冷卻后接入青梅菌母種，分別放置在17 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，測定菌絲生長長度，計算青梅菌原種日均生長速率。

1.5 培養(yǎng)基對青梅菌原種菌絲生長的影響

采用玉米粒、玉米渣、棉籽殼、木屑和麥粒為主粒的5 種培養(yǎng)基配方，配方見1.1。各配方培養(yǎng)基按配方配好料后，分裝到100 mL 的組培瓶中，每瓶分裝三分之二體積，121 ℃40 min滅菌，冷卻后接入青梅菌母種，25 ℃培養(yǎng)10 d，測定菌絲生長長度，計算青梅菌原種日均生長速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 青梅菌母種菌絲的分離與純化

用組織塊無菌分離法獲得青梅菌母種菌絲體（見圖3）。

圖3 青梅菌母種

2.2 溫度對青梅菌母種菌絲生長的影響

青梅菌母種菌絲在不同溫度下的日均生長速率見表1。由表1 可以看出，隨著溫度升高，青梅菌菌絲生長在22 ℃以下逐漸加快，在22 ℃以上逐漸減慢，22 ℃是青梅菌母種菌絲生長的最適溫度。

表1 溫度對青梅菌母種菌絲生長的影響（菌絲日均生長速率：mm/d）

圖4 青梅菌母種11℃下生長狀況

2.3 溫度對青梅菌原種菌絲生長的影響

青梅菌原種菌絲在不同溫度下的生長情況見表2。由表2 可以看出，青梅菌菌絲日均生長速率在25 ℃最高，在25 ℃以下隨著溫度升高逐漸加快，在25 ℃以上隨著溫度升高逐漸減慢，25 ℃是青梅菌原種菌絲的最適生長溫度。

表2 溫度對青梅菌原種菌絲生長的影響（菌絲日均生長速率：mm/d）

2.4 培養(yǎng)基對青梅菌原種菌絲生長的影響

青梅菌原種在不同培養(yǎng)基中生長狀況見表3。由表3 可以看出，青梅菌原種菌絲在棉籽殼培養(yǎng)基中的日均生長速率極顯著的高于其他4 種培養(yǎng)基，因此棉籽殼培養(yǎng)基是青梅菌原種菌絲生長的最佳培養(yǎng)基。

表3 培養(yǎng)基對青梅菌原種菌絲生長的影響（菌絲日均生長速率：mm/d）

圖5 玉米粒培養(yǎng)基中生長的青梅菌

圖6 棉籽殼培養(yǎng)基中生長的青梅菌

3 結(jié)論與討論

對人工分離獲得的青梅菌菌絲最適生長溫度范圍和適宜的培養(yǎng)基配方探究，研究結(jié)果表明，青梅菌母種菌絲的最適生長溫度為22 ℃，原種菌絲的最適生長溫度為25 ℃，最佳培養(yǎng)基配方為棉籽殼培養(yǎng)基，配方為棉籽殼88%、麩皮10%、石灰1%、石膏1%。

Shishikura M.等人在20 ℃培養(yǎng)晶蓋粉褶菌的菌絲體[28]，與本文分離的青梅菌母種菌絲最適生長溫度接近，他們用晶蓋粉褶菌菌絲體接種杜梨的根后在15℃下進(jìn)行共培養(yǎng)2 個月后獲得[29]青梅菌子實體，這和我們采樣時土壤溫度接近，而與菌絲最適生長溫度差別較大，可能的原因是青梅菌菌絲的最適生長溫度與子實體形成最適溫度不同，或者菌絲在原位生長環(huán)境中的生長溫度與人工培養(yǎng)條件存在差異，也可能與菌株的特性有關(guān)，需要進(jìn)一步做和植物根的共培養(yǎng)實驗。

本實驗僅僅對青梅菌菌絲體的生長溫度和適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行了探索，作為外生菌根真菌的一員，至少還需要回接到青梅的根部進(jìn)行共培養(yǎng)，探究其子實體形成的條件，在此基礎(chǔ)上才能建立起人工培養(yǎng)的技術(shù)體系，這還有很多工作要做。