蘇丹丹 劉玉萍 劉 濤 鄭長遠(yuǎn) 張 雨 王亞男 秦 娜 蘇 旭，3*

（1. 青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西寧 810008；2. 青海師范大學(xué)青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008；3. 高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院，西寧 810016）

葉綠體普遍存在于高等植物細(xì)胞中，是光合作用的主要場所，也是一種半自主性細(xì)胞器，擁有自身獨(dú)立的遺傳物質(zhì)，即葉綠體基因組。葉綠體基因組編碼與光合作用相關(guān)的上百種基因，大小介于120～180 kB，一般為共價(jià)閉合的環(huán)狀四組分結(jié)構(gòu)。典型的環(huán)狀葉綠體基因組結(jié)構(gòu)包括長單拷貝區(qū)（large single copy，LSC）、短單拷貝區(qū)（small single copy，SSC）及2 個(gè)反向重復(fù)序列（inverted re?peats，IRS）。研究表明，葉綠體基因組在物種分類、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳多樣性、物種形成、適應(yīng)性進(jìn)化等諸多研究中具有重要作用。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展、組裝軟件的推陳出新和測序成本的降低，NCBI上葉綠體基因組的數(shù)量也在逐年增加。目前，大量豆科植物的葉綠體基因組得到研究報(bào)道，并且主要集中在蝶形花亞科（Papilionoideae）植物中，如木豆（）、苦豆子（）、沙冬青（）、瓜兒豆（）、蟲豆（）等。該亞科植物的葉綠體基因組發(fā)生了較大變異，如IR 區(qū)缺失、基因組倒置、內(nèi)含子丟失等。

苦馬豆（）是豆科（Fabace?ae）、蝶形花亞科苦馬豆屬（）的一種多年生草本植物，也是我國特有種?？囫R豆主要分布于中國吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西、寧夏、甘肅、青海和新疆等地；全草入藥，具有利尿、止血、消腫等藥用價(jià)值，對(duì)治療腎炎、肝硬化、慢性肝炎、浮腫等有較好療效。近年來，許多學(xué)者對(duì)苦馬豆的外部形態(tài)特征、化學(xué)成分、內(nèi)生微生物、病理和藥理作用等進(jìn)行大量研究，然而有關(guān)苦馬豆葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和特征分析的研究未見報(bào)道。據(jù)此，本文利用高通量測序技術(shù)文對(duì)苦馬豆的葉綠體基因組進(jìn)行測序，并對(duì)其密碼子偏好性、SSR 位點(diǎn)、系統(tǒng)親緣關(guān)系等分析，以期為今后苦馬豆群體遺傳多樣性、種群歷史動(dòng)態(tài)乃至豆科植物系統(tǒng)發(fā)育與親緣關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦馬豆新鮮葉片采自青海省格爾木市烏圖美仁鄉(xiāng)幸福村（36°47′24″N，93°39′36″E，海拔2 702 m），野外采摘后立即放置于變性硅膠中干燥，憑證標(biāo)本保存于中國科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館（HNWP）。

1.2 基因組DNA提取和測序

采用改良的CTAB 法從硅膠干燥的苦馬豆葉片中提取基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 的純度和完整性、Nanodrop 檢測DNA 的純度（OD/OD比值）以及Qubit 2.0 熒光定量儀檢測DNA的濃度。

DNA 樣品檢測合格后，利用Covaris 超聲波破碎儀隨機(jī)打斷，經(jīng)序列末端修復(fù)、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等完成整個(gè)文庫制備；建好的文庫質(zhì)檢后，使用Illumina 高通量測序平臺(tái)NovaSeq 6000（天津諾和致源科技有限公司）進(jìn)行測序。

1.3 葉綠體基因組組裝和注釋

在NCBI 上下載苦豆子葉綠體基因組序列（Genbank 登錄號(hào)：NC036102.1）為參考序列，采用NOVOPlasty軟件對(duì)苦馬豆葉綠體基因組進(jìn)行組裝，參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置；序列注釋前首先進(jìn)行BLAST比對(duì)確認(rèn)基因邊界，然后利用軟件GeSeq對(duì)葉綠體基因組進(jìn)行注釋，采用默認(rèn)參數(shù)；注釋完成后，采用在線工具OGDRAW（http：//ogdraw.mpimp-golm.mgp.de/cgi-bin/ogdraw.pl）對(duì)苦馬豆葉綠體基因組圖譜繪制。

1.4 密碼子偏好性和SSR分析

運(yùn) 用CodonW1.4.2 軟 件（http：//mobyle.pas?teur/fr/cgi-bin/portal.py？from=codonw）對(duì)苦馬豆葉綠體基因組的密碼子偏好性RSCU（relative synon?ymous codon usage）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；采用在線網(wǎng)站（https：//webblast. ipk-gatersleben. de/misa/index.php？action=1）對(duì)苦馬豆葉綠體基因組序列進(jìn)行微衛(wèi)星掃描分析，設(shè)置參數(shù)單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重復(fù)數(shù)分別為10、5、4、4、4和4。

1.5 苦馬豆及其近緣種系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

在 NCBI 數(shù) 據(jù) 庫 中 下 載 駱 駝 刺（MW349013.1）、苦 豆 子（NC036102.1）、苦 參（MH748034.1）、沙 冬 青（MK704436.1）、木 豆（KU729879.1）等21 個(gè)豆科、不同屬植物的葉綠體基因組序列，同時(shí)以遠(yuǎn)志科（Polygalaceae）遠(yuǎn)志（，NC050829.1）作為外類群，將所有參試物種的葉綠體基因組序列選擇MAFFT進(jìn)行多序列比對(duì)，并將比對(duì)后的序列進(jìn)行手動(dòng)校正，使用PhyloSuite 軟件中的RAxML 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)、分類、功能及特征

苦馬豆葉綠體基因組全長為123 327 bp，GC含量為34%，與大多數(shù)蝶形花亞科植物相似，存在IR 序列丟失現(xiàn)象（見圖1）。苦馬豆葉綠體基因組共編碼108個(gè)基因，包括74個(gè)蛋白編碼基因、30個(gè)tRNA 基因和4 個(gè)rRNA 基因（見表1）。根據(jù)不同功能可以將苦馬豆葉綠體基因組劃分為3大類，即基因表達(dá)相關(guān)基因57 個(gè)、光合作用相關(guān)基因44個(gè)、開放閱讀和其它蛋白編碼基因5個(gè)以及未知功能基因2 個(gè)；同時(shí)，基因表達(dá)相關(guān)基因又可再被劃分為6個(gè)小類，其中數(shù)量最多的基因?yàn)檗D(zhuǎn)運(yùn)RNA基因，翻譯起始因子數(shù)量最少、僅有1個(gè)（見表1）。

圖1 苦馬豆葉綠體基因組環(huán)形圖譜Fig.1 Circularized map of the chloroplast genome of S.salsula

表1 苦馬豆葉綠體基因組注釋信息Table 1 Gene annotation of the chloroplast genome of S.salsula

2.2 密碼子偏好性

通過對(duì)苦馬豆葉綠體基因組密碼子研究表明，苦馬豆共檢測出411 09 個(gè)密碼子。其中，編碼亮氨酸（Leu）的密碼子4 184 個(gè)，占總密碼子數(shù)的10.18%，數(shù)量最多；色氨酸（Trp）密碼子的使用頻率最低，僅為1.23%；異亮氨酸Ile（9.24%）和絲氨酸Ser（9.34%）介于前兩者之間（見圖2）。相對(duì)同義密碼子（RSCU）大于1的有31個(gè)，其中有28個(gè)密碼子的堿基構(gòu)成以A/U結(jié)尾，其余3個(gè)以G和C結(jié)尾。

圖2 苦馬豆各氨基酸的RSCU分析Fig.2 RSCU analysis of each amino acid in S.salsula

2.3 簡單重復(fù)序列分析

從苦馬豆葉綠體基因組中共鑒定出3 種不同類型的99 個(gè)SSR 位點(diǎn)（見表2）。其中，單核苷酸重復(fù)序列最多，共75 個(gè)，僅有A（37SSRs）和T（38SSRs）2種重復(fù)類型；AT/TA/TC組成的2種二核苷酸類型共17 個(gè)；三核苷酸重復(fù)序列最少，僅有7個(gè)（見表2）。非編碼區(qū)包括內(nèi)含子（Intron）和基因間隔區(qū)（intergenic spacer，IGS），絕大多數(shù)SSR 分布于非編碼區(qū)（見表3）。

表2 苦馬豆葉綠體基因組簡單重復(fù)序列（SSR）信息Table 2 Number of SSRs identified in the chloroplast ge‐nome of S.salsula

表3 苦馬豆葉綠體基因組SSR信息Table 3 Distribution of SSR in the chloroplast genome of S.salsula

續(xù)表3 Continued table 3

2.4 苦馬豆及其近緣物種系統(tǒng)發(fā)育分析

基于苦馬豆及其近緣種葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，豆科21 個(gè)物種構(gòu)成一個(gè)單系類群，靴帶支持率（bootstrap）高達(dá)100%（見圖3）。進(jìn)一步分析顯示，豆科植物又可劃分為兩大類群（Clade Ⅰ和Clade Ⅱ），同樣得到100%的支持率；其中Clade I 由苦馬豆、駱駝刺（）、湖 北 紫 荊（）、鞍 葉 羊 蹄 甲（）、紅花羊 蹄甲（）、緬茄（）和梭梭（）物種組成，且苦馬豆與姊妹種駱駝刺關(guān)系最近；Clade Ⅱ由苦豆子、苦參、沙冬青、美麗相思子（）、刀豆（）、鼎湖魚藤（）、瓜兒豆、木豆、蟲豆、長角豆（）、鏈莢豆（）、單節(jié)假木豆（）、美國土圞兒（）、距瓣豆（）、落花生（）物種組成（見圖3）。

圖3 基于22個(gè)葉綠體基因組構(gòu)建的豆科系統(tǒng)發(fā)育樹“★”代表分支節(jié)點(diǎn)的靴帶支持率為100%Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on data of 22 chloroplast genomes“★”represents the bootstrap support rate of 100%on the branch

3 討論

葉綠體是高等綠色植物最重要的細(xì)胞器之一，也是光合作用的場所，擁有獨(dú)立完整的基因組，絕大多數(shù)植物為單親遺傳。近年來，隨著測序技術(shù)的提高及測序成本的降低，植物葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫越來越完善。研究表明，被子植物葉綠體基因組長度通常介于120～180 kB，編碼基因常為100～130 個(gè)，其中蛋白編碼基因至多80 個(gè)、tRNA 編碼基因30～32 個(gè)，rRNA 編碼基因數(shù)穩(wěn)定，常有4種。本研究發(fā)現(xiàn)，苦馬豆葉綠體基因組在基因種類、組成和結(jié)構(gòu)上具有高度保守性，與絕大多數(shù)豆科物種基本一致；同時(shí)，依據(jù)基因功能不同葉綠體基因組可被劃分為基因表達(dá)相關(guān)基因、光合作用相關(guān)基因及其他未知功能基因。苦馬豆葉綠體基因組大小、編碼基因數(shù)目和種類等與上述研究結(jié)果一致。通常情況下，被子植物的葉綠體基因組為雙鏈環(huán)狀DNA 分子，由LSC、SSC 和2 個(gè)IRs 構(gòu)成。然而，研究發(fā)現(xiàn)蝶形花科95 種植物中，有24個(gè)物種存在IR區(qū)丟失，認(rèn)為IR序列丟失是蝶形花亞科植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)缺失的一種常見現(xiàn)象?？囫R豆作為蝶形花亞科的一種重要旱生植物，我們同樣發(fā)現(xiàn)其葉綠體基因組也存在IR 區(qū)丟失現(xiàn)象，進(jìn)一步驗(yàn)證了先前研究的正確性和合理性。

在許多植物中，存在某一或幾種特定密碼子頻率高于其他同義密碼子（RSCU）的現(xiàn)象，即密碼子偏好性。密碼子偏好性在一定程度上能夠反映基因乃至物種的起源和進(jìn)化方式，并對(duì)基因功能及其編碼蛋白表達(dá)有一定影響。本文通過對(duì)苦馬豆葉綠體基因組密碼子偏好性分析表明，大于1的相對(duì)同義密碼子有31 個(gè)，其中28 個(gè)密碼子的堿基構(gòu)成以A/T結(jié)尾，與大多數(shù)被子植物同義密碼子相似。簡單重復(fù)序列（SSR）是整個(gè)基因組中1～6 bp 的重復(fù)序列，也是高等真核生物基因組的重要組成部分，在植物物種鑒定、群體遺傳多態(tài)性和遺傳分析研究中具有重要作用。本研究表明，苦馬豆葉綠體基因組中檢測到75 個(gè)單核苷酸、17個(gè)雙核苷酸和7 個(gè)三核苷酸SSRs。其中，雙核苷酸SSRs的重復(fù)單元以AT/TA/TC為主，而三核苷酸SSRs的重復(fù)單元?jiǎng)t由AAT/ATA/TAA/TTA 構(gòu)成，這與先前報(bào)道的其他被子植物葉綠體基因組的SSRs序列構(gòu)成一致，從而驗(yàn)證了葉綠體基因組的SSRs 主要由短的poly A 和poly T 構(gòu)成，而不是由C或G 串聯(lián)重復(fù)。葉綠體基因組數(shù)據(jù)能有效進(jìn)行植物物種鑒定和系統(tǒng)親緣關(guān)系分析。尤其在近緣物種間具有更理想的效果。本文基于葉綠體基因組序列通過對(duì)豆科21 個(gè)物種系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)豆科植物是一個(gè)單系類群且靴帶支持率高達(dá)100%；苦馬豆與駱駝刺屬于姊妹群，具有最近的親緣關(guān)系，并且BV 值為100%，這為以后苦馬豆豆系統(tǒng)位置和親緣關(guān)系確定，遺傳多樣性分析和群體遺傳結(jié)構(gòu)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。