容萬韜, 宋 哲, 辛 磊, 鄧維安, 覃玉月, 李曉東,*

(1.河池學院化學與生物工程學院, 廣西河池 547000; 2.廣西師范大學生命科學學院, 廣西桂林 541000)

眼優(yōu)角蚱Eucriotettixoculatus(Bolivar, 1898)隸屬于直翅目(Orthoptera)蚱總科(Tetrigoidea)，廣泛分布于中國南部各省及南亞地區(qū)(鄭哲民, 2005; 鄧維安等, 2007)，主要生活在溪流旁邊生長有苔蘚的濕潤巖石周圍，以苔蘚及腐殖質(zhì)為食物(肖舒晴等, 2019)。環(huán)境中的重金屬主要通過眼優(yōu)角蚱的取食行為進入體內(nèi)，并對其腸道微生物產(chǎn)生影響(Lietal., 2021)，據(jù)此推測，重金屬對眼優(yōu)角蚱的代謝會有一定的影響。本研究選擇金屬礦區(qū)附近環(huán)境中生存的眼優(yōu)角蚱為試驗組，并以非金屬礦區(qū)環(huán)境中的眼優(yōu)角蚱為對照組，對其代謝組進行研究分析，以探明暴露于重金屬復合污染下的眼優(yōu)角蚱代謝組的變化情況，進而了解重金屬復合污染對眼優(yōu)角蚱代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 研究樣地的選擇和樣品的準備

重金屬復合污染樣地選擇在廣西南丹縣刁江流域一金屬礦區(qū)(metal mining area, MA)附近，該礦區(qū)附近被鎘(Cd)、銻(Sb)、砷(As)、鋅(Zn)、鉛(Pb)和銅(Cu)等多種重金屬高度污染(鐘雪梅等, 2016)；另一樣地選擇在廣西融安縣境內(nèi)的一非金屬礦區(qū)(non-metal mining area, NMA)。2020年8月分別在兩個樣地采集眼優(yōu)角蚱成蟲雌雄各45頭，活體帶回實驗室。每個樣地各取15頭雄蟲和15頭雌蟲組成一個樣品，共2個樣品(編號分別為：MA和NMA)，用來測定兩個樣地的眼優(yōu)角蚱體內(nèi)的重金屬含量，以明確是否受到重金屬復合污染影響。剩余的用于測定代謝組，每個樣地取10頭雄蟲和10頭雌蟲，對其進行解剖，將腸道組織取出，用無菌雙蒸水清洗干凈，以此組成一個樣品，金屬礦區(qū)組和非金屬礦區(qū)組均準備3個樣品，即3個生物學重復(編號分別為：MA1, MA2和MA3以及NMA1, NMA2和NMA3)。樣品置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 昆蟲體內(nèi)重金屬含量的測定

采用微波消解和ICP-MS法對昆蟲體內(nèi)砷(As)、鎘(Cd)、汞(Hg)、鉛(Pb)、鋅(Zn)、銅(Cu)、錫(Sn)、銻(Sb)和鉻(Cr)共9種重金屬含量進行測定，具體步驟為：(1)眼優(yōu)角蚱成蟲全蟲烘干研磨：將準備好的樣品烘干后放置研缽中充分研磨至盡可能細的粉末，干燥室溫保存。(2)消解：稱取0.2 g左右樣品進行微波消解。(3)趕酸：消解完畢，放入通風櫥中趕酸儀上趕酸40 min。(4)檢測：待趕酸儀溫度降至室溫，取出樣品，用超純水定容至50 mL，混勻放置澄清后，再采用ICP-MS檢測。同時稱取國家標準品作分析空白，同標準參考。

1.3 樣品代謝組分的提取

從-80℃冰箱中取出樣品于冰上解凍(后續(xù)操作都在冰上進行)，用手術(shù)刀片切碎攪勻，用鑷子夾取一部分到去皮后的EP管中，稱量20 mg，放入一粒鋼珠，在30 Hz的條件下勻漿30 s，反復4次，加入-20℃預冷的內(nèi)標提取液，2 500 r/min振蕩5 min，將樣品在4℃ 12 000 r/min下離心10 min，吸取上清液400 μL到對應的EP管中，-20℃冰箱靜置30 min，4℃ 12 000 r/min下再離心3 min，取上清200 μL裝到對應進樣瓶內(nèi)襯管中，上機分析。

1.4 樣品的代謝組分析條件

數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC)(ExionLC AD, https:∥sciex.com.cn/)和串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry, MS/MS)(QTRAP?, https:∥sciex.com/)。

液相條件主要包括：(1)色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm, 2.1 mm×100 mm；(2)流動相：A相為超純水(0.1%的甲酸)，B相為乙腈(0.1%的甲酸)；(3)洗脫梯度：起始體積比為水/乙腈95∶5(v/v)，10.0 min內(nèi)線性降低至水/乙腈10∶590(v/v)，并維持1 min，在11.0-11.1 min之間把體積比恢復為水/乙腈95∶55(v/v)并維持至14.0 min；(4)流速0.4 mL/min；柱溫40℃；進樣量2 μL。

質(zhì)譜條件主要包括：電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)溫度500℃，質(zhì)譜電壓5 500 V(正)，-4 500 V(負)，離子源氣體Ⅰ(GS Ⅰ)55 psi，氣體Ⅱ(GS Ⅱ)60 psi，氣簾氣(curtain gas, CUR)25 psi，碰撞誘導電離(collision-activated dissociation, CAD)參數(shù)設(shè)置為高。在三重四極桿(Qtrap)中，每個離子對是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(declustering potential, DP)和碰撞能(collision energy, CE)進行掃描檢測(Chenetal., 2013)，利用軟件Analyst1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.5 代謝組數(shù)據(jù)的處理與分析

基于嘉興邁維代謝生物科技有限公司自建靶向標品數(shù)據(jù)庫MWDB(metware database)，根據(jù)檢測物質(zhì)的保留時間(retention time, RT)、子母離子對信息及二級譜數(shù)據(jù)進行定性分析，利用三重四極桿質(zhì)譜的多反應監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring, MRM)完成代謝物定量。由樣本提取物混合制備成質(zhì)控樣本，對該樣本進行重復上機得到mix01-03，以重復測試來監(jiān)測分析樣本在相同的處理方法下的重現(xiàn)性，用變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)表示。CV值越低表示越穩(wěn)定，質(zhì)控標準是75%的物質(zhì)CV值小于0.3。同時，在樣本中加入內(nèi)標參與整個提取和檢測環(huán)節(jié)，通過計算內(nèi)標的CV值表征整個項目提取檢測環(huán)節(jié)的穩(wěn)定性。利用R軟件(www.r-project.org/)進行主成分分析(principal component analysis, PCA)。基于正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)結(jié)果，從獲得的多變量分析OPLS-DA模型的變量重要性投影(variable importance in projection, VIP)，初步篩選出不同樣品間差異代謝物，結(jié)合單變量分析的P值或者差異倍數(shù)值(fold change)來進一步篩選出顯著差異代謝物，篩選標準為fold change≥2和fold change≤0.5的代謝物，即代謝物在金屬礦區(qū)組組和非金屬礦區(qū)組組中差異為2倍以上或0.5以下為差異顯著；同時在差異倍數(shù)值基礎(chǔ)上VIP≥1的代謝物也為差異顯著。通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫對代謝物進行功能注釋以及代謝通路(pathway)富集分析。

2 結(jié)果

2.1 眼優(yōu)角蚱成蟲體內(nèi)重金屬含量

經(jīng)過ICP-MS法測定兩個樣地眼優(yōu)角蚱成蟲體內(nèi)重金屬含量，由表1可知，金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱(MA)體內(nèi)重金屬含量相比非金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱(NMA)體內(nèi)重金屬含量，砷(As)是212.4倍，鎘(Cd)9.3倍，汞(Hg)1倍，鉛(Pb)18倍，鋅(Zn)0.4倍，銅(Cu)1.4倍，錫(Sn)6.7倍，銻(Sb)61.0倍，鉻(Cr)4.1倍，即除了汞(Hg)和鋅(Zn)外，其余重金屬含量均顯示金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱體內(nèi)含量明顯高于非金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱體內(nèi)的含量，說明在金屬礦區(qū)生存的眼優(yōu)角蚱體內(nèi)重金屬出現(xiàn)了累積。

表1 金屬礦區(qū)和非金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱成蟲體內(nèi)重金屬含量Table 1 Contents of heavy metals in Eucriotettix oculatus adults in the metal mining area and the non-metal mining area

2.2 樣本質(zhì)控

質(zhì)控樣本(QC)由兩組樣品混合制備而成，用于監(jiān)測分析樣品在相同的處理方法下代謝物提取和檢測的重復性，進而反映檢測儀器的穩(wěn)定性以及試驗的可靠性。經(jīng)樣本質(zhì)控分析， 正(A)負(B)離子檢測模式下QC樣本質(zhì)譜檢測總離子流圖(total ion current, TIC) 重疊圖顯示代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高，即保留時間和峰強度均一致，表明質(zhì)譜對同一樣品不同時間檢測時，信號穩(wěn)定性好，試驗結(jié)果可靠，可進行下一步的研究分析。

2.3 主成分分析

為考察金屬礦區(qū)組和非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱體內(nèi)代謝物是否存在差異，我們對分組樣品進行主成分分析。6個樣品的PCA分析，經(jīng)過降維處理后橫坐標(PC1)對組間樣本差異貢獻率為33.81%，縱坐標(PC2)對組間差異貢獻率為24.5%(圖1)。樣品間距離越近則說明其體內(nèi)代謝物越接近。組間樣品的PCA分析顯示，兩組樣品能夠較好地分開。以上結(jié)果說明，金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱體內(nèi)代謝物與非金屬礦區(qū)組相比存在差異。

圖1 金屬礦區(qū)組和非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱成蟲體內(nèi)代謝物主成分分析得分圖Fig.1 Score of principal component analysis (PCA) ofmetabolites in Eucriotettix oculatus adults in the metalmining area group and the non-metal miningarea group百分比表示主成分對樣品差異的貢獻值；圖中的每個點表示一個樣品，同一個組的樣品使用同一種顏色表示；MA1-MA3表示金屬礦區(qū)采集的3個樣品；NMA1-NMA3表示非金屬礦區(qū)采集的3個樣品。The percentage represents the contribution value of the principal component to the sample difference.Each point in the figure represents a sample， and the samples of the same group are represented by the same color.MA1-MA3 represent three samples collected from the metal mining area, and NMA1-NMA3 represent three samples collected from non-metal mining area.

2.4 重金屬復合污染下眼優(yōu)角蚱體內(nèi)代謝物分類

基于UPLC-MS/MS檢測平臺，MA和NMA兩組樣品共檢測到625種代謝物，占比較高的為氨基酸及其代謝物、脂肪酰類、有機酸及其衍生物、核苷酸及其代謝物、甘油磷脂類，分別為21.76%, 13.76%, 13.12%, 12.32%和10.24%。金屬礦區(qū)組檢測到622種代謝物，非金屬礦區(qū)組檢測到621種代謝物，有3種代謝物只存在于非金屬礦區(qū)組的眼優(yōu)角蚱體內(nèi)，分別是?；悄懰?、花生油酸、N-乙酰-L-谷氨酰胺，有4種代謝物只存在于金屬礦區(qū)組的眼優(yōu)角蚱體內(nèi)，分別是維生素D3、馬尿酸、血栓素B2、黃素單核苷酸(FMN)；金屬礦區(qū)組和非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱體內(nèi)的代謝物在組成類別上相似(圖2)。

圖2 金屬礦區(qū)組和非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱成蟲腸道中代謝物的分類Fig.2 Classification of metabolites in the intestine of Eucriotettix oculatus adults inthe metal mining area group and the non-metal mining area group

2.5 差異代謝物篩選

基于OPLS-DA，結(jié)合單變量分析的P值以及差異倍數(shù)值(fold change)對差異代謝物進行篩選。所有625種代謝物中，在同時滿足fold change≥2或fold change≤0.5和VIP≥1的條件下，金屬礦區(qū)組相比非金屬礦區(qū)組共篩選到差異顯著代謝物112種，其中上調(diào)59種，下調(diào)53種(表2和圖3)。 在112種顯著差異代謝物中，氨基酸及其代謝物(19.64%)、脂肪酰類(17.86%)、有機酸及其衍生物(12.50%)、核苷酸及其代謝物(9.82%)、苯及其衍生物(7.14%)總占比超過50%；上調(diào)的前10種顯著差異代謝物分別為黃素單核苷酸(FMN)、馬尿酸、維生素D3、血栓素B2、亞精胺、肉堿C12∶3、5-羥甲基尿嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、松柏醇和肉堿C10∶0異構(gòu)體1；下調(diào)的前10種顯著差異代謝物分別為N-乙酰-L-谷氨酰胺、?；悄懰帷⒒ㄉ退?、原膽酸、7-酮基石膽酸、12-酮基石膽酸、吲哚丙烯酸、甲酰胺、S-腺苷蛋氨酸、L-多巴和5-脫氧-5-甲硫腺苷。說明金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱成蟲體內(nèi)代謝物含量與非金屬礦區(qū)組間存在顯著差異，顯著差異代謝物主要集中在氨基酸類、脂肪酰類物質(zhì)。

圖3 金屬礦區(qū)組比非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱成蟲腸道中顯著差異代謝物火山圖Fig.3 Volcano plot of significantly differential metabolitesin the intestine of Eucriotettix oculatus adults in the metalmining area group vs the non-metal mining area group圖中的每一個點表示一種代謝物，Log2FC值絕對值大于1且VIP值大于1時，認為差異顯著。紅點代表上調(diào)的代謝物，綠點代表下調(diào)的代謝物，灰點代表檢測到但差異不顯著的代謝物。Each point in the figure represents a metabolite.When the absolute value of Log2FC is greater than 1 and the VIP value is greater than 1, the difference is considered significant.Red dots represent upregulated metabolites, green dots represent downregulated metabolites, and gray dots represent detected metabolites with insignificant difference.

2.6 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

為探明112種顯著差異代謝物與眼優(yōu)角蚱機體功能的關(guān)系，利用 KEGG 數(shù)據(jù)庫(Kanehisa and Goto, 2000)對顯著差異代謝物進行功能注釋和富集，共富集到132條通路(圖4)，其中注釋到生物體系統(tǒng)相關(guān)通路53條，新陳代謝相關(guān)通路45條，人類疾病相關(guān)通路共19條，遺傳信息處理相關(guān)通路1條，環(huán)境信息處理相關(guān)通路11條，細胞過程通路3條。在注釋到的132條通路中，共涉及49種差異代謝物，尚有63種差異代謝物未被注釋到通路中。對富集程度排在前20的代謝通路的分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，富集最顯著(P<0.05)的通路共4條，分別為甲狀腺激素的合成通路、苯丙氨酸代謝通路、膽汁分泌通路、酪氨酸代謝通路，均與有機體系統(tǒng)和新陳代謝相關(guān)。經(jīng)過KEGG功能注釋及富集分析，112種顯著差異代謝物中共有49種被注釋到132條通路中，這些通路大多數(shù)與生物體系統(tǒng)和新陳代謝相關(guān)。

3 討論

本研究對生活在金屬礦區(qū)和非金屬礦區(qū)的眼優(yōu)角蚱的體內(nèi)的重金屬含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱體內(nèi)重金屬砷、銻、鉛、鎘、錫、鉻、銅的含量分別是非金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱體內(nèi)含量的212.4, 61, 18.0, 9.3, 6.7, 4.0和1.4倍，說明環(huán)境中的重金屬可以累積到眼優(yōu)角蚱體內(nèi)。通過代謝組學研究，首次發(fā)現(xiàn)了眼優(yōu)角蚱體內(nèi)共有625種代謝物。對比金屬礦區(qū)和非金屬礦區(qū)眼優(yōu)角蚱代謝物差異，發(fā)現(xiàn)112種代謝物因為重金屬復合污染而產(chǎn)生了顯著變化，其中超過50%(59種)代謝物上調(diào)(表2)，這說明重金屬復合污染會導致眼優(yōu)角蚱體內(nèi)的代謝發(fā)生變化。類似現(xiàn)象在蜜蜂的研究上也有發(fā)現(xiàn)，Rothman等(2019)用鎘和硒酸鹽處理蜜蜂后，通過非靶向代謝組學方法獲得391種代謝物圖譜，并鑒定出58種代謝物，其中在鎘處理下2種代謝物(類香豆酸和四糖)存在顯著差異，在硒酸鹽處理下7種代謝物存在顯著差異。說明重金屬污染對昆蟲代謝具有一定的影響。

本研究中，在顯著差異的代謝物中，黃素單核苷酸(FMN)、馬尿酸、維生素D3、血栓素B2、亞精胺、肉堿C12∶3、5-羥甲基尿嘧啶、N-乙酰-L-酪氨酸、松柏醇、肉堿C10顯著上調(diào)(表2)。周良斌(2016)研究發(fā)現(xiàn)藍光激發(fā)黃素單核苷酸產(chǎn)生的自由基可以抑制肝癌細胞生長。維生素D3參與機體鈣磷代謝與骨質(zhì)鈣化，是調(diào)節(jié)骨代謝的重要內(nèi)分泌激素之一，是一種新型的免疫調(diào)節(jié)劑，具有誘導細胞分化、抑制細

胞增生、拮抗膠元形成以及調(diào)節(jié)原癌基因表達、抑制腫瘤生長等功能(毛萌和劉震, 1991; 徐璐等, 2014; 趙宇和張曉良, 2015)。敖英等(2018)研究發(fā)現(xiàn)利用亞精胺處理細胞，能夠增強細胞對DNA損傷的應答反應，并發(fā)現(xiàn)衰老的小鼠中內(nèi)源性亞精胺含量降低，導致細胞對DNA損傷應答能力減弱，從而加快機體衰老進程。重金屬通過昆蟲的攝食活動進入腸道后，會導致腸細胞結(jié)構(gòu)損傷，DNA斷裂，細胞凋亡等(Osmanetal., 2015; 柳琳, 2017; Kheirallahetal., 2019)。據(jù)此推測，本研究中以上代謝物顯著上調(diào)，可能與眼優(yōu)角蚱抵御重金屬對腸道細胞的損傷，維持細胞正常功能有關(guān)。在顯著差異的代謝物中，前10種顯著下調(diào)的代謝物有N-乙酰-L-谷氨酰胺、牛磺膽酸、花生油酸、原膽酸、7-酮基石膽酸、12-酮基石膽酸、吲哚丙烯酸、甲酰胺、S-腺苷蛋氨酸、L-多巴和5-脫氧-5-甲硫腺苷(表2)，這些物質(zhì)分屬于膽汁酸類(牛磺膽酸、原膽酸、7-酮基石膽酸、12-酮基石膽酸)、氨基酸衍生物(N-乙酰-L-谷氨酰胺、S-腺苷蛋氨酸、L-多巴)等。膽汁酸是膽固醇的代謝物，在機體膽固醇與能量代謝平衡和小腸營養(yǎng)物質(zhì)吸收等方面起著重要作用(劉笑和王琰, 2019)，同時可以作為信號分子調(diào)節(jié)體內(nèi)膽汁酸的代謝平衡、糖脂代謝與能量代謝平衡(李灝等, 2007; 劉笑和王琰, 2019)，也有研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸有利于腸干細胞的激活，可以促進腸道再生(Sorrentinoetal., 2020)。在重金屬復合污染環(huán)境中，眼優(yōu)角蚱腸道內(nèi)的膽汁酸類物質(zhì)顯著下調(diào)，由此推測，膽汁酸在對機體的能量調(diào)節(jié)中出現(xiàn)了消耗，也可能直接參與了代謝，以加強小腸營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，為機體提供更多的能量、激活腸干細胞分化成相關(guān)抗性細胞以為對抗重金屬帶來的損傷做準備有關(guān)，也可能是重金屬導致體內(nèi)合成膽汁酸的功能受阻，導致體內(nèi)膽汁酸供應不足。因此，這些物質(zhì)的顯著下調(diào)可能與眼優(yōu)角蚱機體的消化功能、蛋白質(zhì)合成與分解、脂質(zhì)代謝、增強機體對重金屬的耐受性有關(guān)。

112種顯著差異代謝物經(jīng)過KEGG注釋和功能富集，共有49種被注釋到132條通路中，有40種被注釋到代謝的通路中(圖4)。富集顯著的通路共有4條：甲狀腺激素合成通路、催產(chǎn)素信號通路、膽汁分泌通路、酪氨酸代謝通路(圖5)，這些通路共涉及14種差異顯著代謝物。其中共有4種差異顯著代謝物被注釋到甲狀腺激素合成通路。甲狀腺激素是促進動物機體細胞生長、組織分化、發(fā)育和成熟的重要因素(徐建波等, 2014)，在一定劑量范圍內(nèi)能夠加速蛋白質(zhì)的合成和糖、脂的利用，從而提高機體代謝率(張堅等, 1992)。由此推測，甲狀腺激素合成通路的富集，可能預示著眼優(yōu)角蚱在重金屬污染環(huán)境中，需要消耗更多的能量以提高對重金屬的解毒和排泄作用(付偉利等, 2015)，從而更有利于機體對重金屬損傷的修復。

圖4 金屬礦區(qū)組比非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱成蟲腸道中顯著差異代謝物KEGG通路注釋Fig.4 KEGG pathway annotation of significantly differential metabolites in the intestine of Eucriotettix oculatus adultsin the metal mining area group vs the non-metal mining area group

圖5 金屬礦區(qū)組比非金屬礦區(qū)組眼優(yōu)角蚱成蟲腸道中顯著差異代謝物的KEGG富集圖Fig.5 KEGG enrichment of significantly differential metabolites in the intestine of Eucriotettix oculatus adultsin the metal mining area group vs the non-metal mining area group富集因子為差異表達的代謝物中在對應通路中的個數(shù)與該通路檢測注釋到的代謝物總數(shù)的比值，該值越大表示富集程度越大。P值為超幾何檢驗P值，越接近于0，表示富集越顯著。圖中點的大小代表富集到相應通路上的差異顯著代謝物個數(shù)。Rich factor is the ratio of the number of differentially expressed metabolites in the corresponding pathway to the total number of metabolites detected and annotated by the pathway.The higher the value is, the greater the enrichment degree is.P-value is the P-value of hypergeometric test.The closer to 0, the more significant the enrichment.The size of the dots in the graph represents the number of metabolites enriched in the corresponding pathways.

催產(chǎn)素可以借助抑制食物的攝入和胃排空，實現(xiàn)體重的控制、抗炎與氧化反應的應激改變，在精神疾病以及心血管病等多方面均具備明顯作用，屬于多重生物學作用特征的多肽激素(白紅文和孫洪濤, 2020)，也有研究發(fā)現(xiàn)，中樞系統(tǒng)的催產(chǎn)素是一種食欲相關(guān)的神經(jīng)元，參與小鼠采食過程中的調(diào)控過程(潘登等, 2016)。本研究中，催產(chǎn)素通路被顯著富集到，推測重金屬脅迫可能會促使眼優(yōu)角蚱的食欲發(fā)生變化，而且更偏向于增加食欲，通過攝取更多的食物來獲取更多的能量， 使機體保持足夠的能量參與細胞的修復等，以應對重金屬對機體的傷害。

膽汁的主要作用是將脂肪乳化成微滴以利于消化，還能促進脂肪酸及脂溶性維生素的吸收。膽汁酸是膽汁的重要組成成分，對水產(chǎn)動物的生長性能、消化酶活性、抗氧化功能、免疫功能及糖脂代謝等均有一定影響(孔祎頔等, 2020)。游離型膽汁酸主要包括膽酸(cholic acid, CA)和脫氧膽酸(deoxycholic acid, DCA)等。DCA能夠刺激肝細胞分泌大量膽汁，消除膽道內(nèi)膽汁的淤積，同時，藥物、重金屬等有毒物質(zhì)隨著膽汁外排出體外(Jinetal., 2019; 孔祎頔等, 2020)。本研究中顯著差異代謝物中膽汁酸類物質(zhì)顯著下調(diào)，而與膽汁分泌相關(guān)的通路又被富集到，更說明了眼優(yōu)角蚱可能利用了大量的膽汁酸參與機體代謝，從而促進重金屬的排出。

酪氨酸代謝是氨基酸代謝的重要組成部分，可以由苯丙氨酸羥化生成，酪氨酸可以轉(zhuǎn)化為兒茶酚胺，兒茶酚胺類物質(zhì)作為類神經(jīng)遞質(zhì)，與人類的健康和疾病聯(lián)系緊密(Portaetal., 2020a, 200b; Taddeietal., 2020)。重金屬脅迫可以對昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)造成影響(Ilijinetal., 2010)，因此該代謝物的變化可能與此有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，生活在金屬礦區(qū)的眼優(yōu)角蚱體內(nèi)有多種重金屬累積，重金屬可導致其腸道組織中的代謝物發(fā)生變化，這些變化的代謝物主要集中在氨基酸及其代謝物、脂肪酰類(肉堿)、有機酸及其衍生物、核苷酸及其代謝物等物質(zhì)(圖2)；顯著差異代謝物富集到的通路主要集中在甲狀腺激素的合成通路、催產(chǎn)素信號通路、膽汁分泌通路、酪氨酸代謝通路等，說明重金屬復合污染會影響眼優(yōu)角蚱的生長發(fā)育、細胞分化、能量代謝、細胞修復等。由于本研究的樣品全部來自于野外，今后可結(jié)合室內(nèi)重金屬復合污染的試驗來進一步探究重金屬復合污染對眼優(yōu)角蚱代謝組的影響，為揭示重金屬對昆蟲代謝影響提供基礎(chǔ)資料。