尹 恒, 傅子卓, 楊曉霞, 袁東雪, 毛新芳, 劉忠淵, *

(1.四川輕化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院, 四川自貢 643000; 2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 烏魯木齊 830046)

無機焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase, PPase)最先在酵母中純化得到(Kunitz, 1952)，可以將多種代謝物中的焦磷酸基團水解成磷酸基團，在機體的正常物質(zhì)代謝和能量傳遞中起到重要作用(Harold, 1966; Sivulaetal., 1999; Nelson and Cox, 2000; Poole and Reeve, 2005)。無機焦磷酸酶具有較高催化效率，可使焦磷酸鹽(pyrophosphate, PPi)的水解速率提高1010-11倍，可以在短時間內(nèi)降低PPi基團的積累，保證大分子持續(xù)合成，促進機體發(fā)育(Oksanenetal., 2007; 吳群峰, 2014)。無機焦磷酸酶可根據(jù)蛋白溶解性分為膜結(jié)合無機焦磷酸酶和可溶性無機焦磷酸酶。膜結(jié)合無機焦磷酸酶主要存在于植物、細菌以及寄生性生物中，可作為質(zhì)子泵和Na+泵，在生物能的保存和傳遞中發(fā)揮重要功能(李小園等, 2004)。對水稻、細菌的無機焦磷酸酶研究表明，無機焦磷酸酶在反應(yīng)過程中可以釋放能量，推動熱力學(xué)平衡向生物合成方向進行，對合成反應(yīng)具有促進作用，在ATP缺乏的情況下可應(yīng)對外界脅迫(黃園波等, 2013; 張亞芳等, 2013)?？扇苄越沽姿崦钢饕嬖谟诎|(zhì)內(nèi)，廣泛分布于動物、植物以及真菌體內(nèi)，具有調(diào)節(jié)焦磷酸基團和磷酸基團比例，維持正常生命活動的作用。朱家紅等(2013)在橡膠中分離得到3個可溶性無機焦磷酸酶蛋白，證明其可以抑制PPi積累，促進橡膠的生物合成，提高橡膠的產(chǎn)量(Prévtetal.,1987)。對黑腹果蠅Drosophilamelanogaster焦磷酸酶研究發(fā)現(xiàn)其可以促進染色體的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄(Gdulaetal., 1998)；對線蟲和蛔蟲體內(nèi)焦磷酸酶深入研究證明，其與幼蟲發(fā)育息息相關(guān)(Islametal., 2003; Koetal., 2007)。

茶尺蠖Ectropisobliqua是一種鱗翅目(Lepidoptera)尺蠖蛾科(Geometridae)的昆蟲，俗稱拱背蟲、造橋蟲等，是茶園中發(fā)生普遍、為害嚴重的害蟲之一(張漢鵠, 2001)。其具有暴食性，早期幼蟲咬食嫩葉、嫩梢，后期取食量增加常將葉片咬食形成缺刻，大面積發(fā)生時可以將葉片全部吃光，茶園如同火燒一般，無茶可采，導(dǎo)致樹勢衰弱，對茶葉的品質(zhì)和產(chǎn)量具有重大影響，常年造成茶葉產(chǎn)量損失約15%(趙磊等, 2014)。目前對于茶尺蠖體內(nèi)相關(guān)酶的報道較少，僅有茶尺蠖脂肪酶合成基因EoL2的克隆(杜琴等, 2015)與利用短穩(wěn)桿菌Empedobacterbrevis防治茶尺蠖后茶尺蠖中腸的血淋巴內(nèi)解毒酶(AchE, CarE和GSTs)的應(yīng)激情況(李良德等, 2020)的研究，更多的則是對于茶尺蠖的防治開展的一些研究(李喜旺等, 2017; 張帥琪等, 2020)。

此外，相關(guān)研究主要集中在植物和細菌中(劉海英等, 2008)，昆蟲無機焦磷酸酶報道較少，從NCBI中可以檢索到很多鱗翅目昆蟲無機焦磷酸酶基因，但是對其進行深入研究的鮮有報道。另外，已有報道表明焦磷酸酶可作為PCR增強劑(王磊, 2014)。PCR增強劑的發(fā)展源于PCR在擴增過程中會出現(xiàn)擴增效率低、擴增量少等問題。PCR反應(yīng)一般設(shè)置30～35個循環(huán)，循環(huán)次數(shù)過多會造成大量副產(chǎn)物如PPi的積累，產(chǎn)物積累速度減慢，非特異性條帶的擴增概率增加，而PCR增強劑的使用可以解決這些問題。無機焦磷酸酶具有水解PPi的特性，因此研究無機焦磷酸酶對PCR的增強效果具有重要意義。本研究通過茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫中獲得無機焦磷酸酶EoPPase672的基因序列，進行體外表達和功能驗證，為進一步研究無機焦磷酸酶在茶尺蠖解毒過程中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

研究所用茶尺蠖卵來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，由本實驗室進行室內(nèi)人工飼養(yǎng)和繁殖，飼養(yǎng)溫度為22±0.5℃，相對濕度為75%±5%，光周期為14L∶10D，幼蟲飼喂新鮮的茶葉枝。

1.2 材料與試劑

大腸桿菌Escherichiacoli菌株DH5α和BL21(DE3)、DNA Marker、Taq酶、pUCm-T載體和膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Transzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑和質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；ProteinFind?Anti-His Mouse Monoclonal Antibody和 ProteinFind?Goat Anti-Mouse IgG(H+L), HRP Conjugate購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET32a質(zhì)粒載體為實驗室保存；溴氰菊酯(50 mL/瓶)購自浙江威爾達化工有限公司；其他未標明試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 生物學(xué)信息分析

通過茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Yinetal., 2021)獲得EoPPase672基因cDNA序列，利用在線預(yù)測軟件對EoPPase672理化性質(zhì)進行預(yù)測。 通過在線程序ORF Finder(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf)預(yù)測基因序列的開放閱讀框；使用在線軟件ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白分子量和等電點；使用ProtScale (http:∥web.expasy.org/protscale/)預(yù)測蛋白親疏水性；使用在線軟件SignalIP 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP-4.1/)分析蛋白的信號肽位點。利用InterPro(http:∥www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)在線分析軟件預(yù)測蛋白質(zhì)中包含的結(jié)構(gòu)域；利用PredictProtein(https:∥www.predictprotein.org/home)在線預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載昆蟲無機焦磷酸酶的氨基酸序列，利用MEGA 5軟件的鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建茶尺蠖EoPPase672和其他物種PPase的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 重組蛋白EoPPase672的表達和純化

將實驗室保存的重組質(zhì)粒pET-32a-EoPPase672轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑選單克隆菌落37℃ 220 r/min過夜培養(yǎng)，按照1∶100(v/v)轉(zhuǎn)接入10 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)4 h(OD600=0.6～0.8)后，加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為0.5 μmol/L)，37℃ 220 r/min誘導(dǎo)蛋白表達。12 000 r/min離心1 min收集菌體。12%的SDS-PAGE檢測。

將陽性單克隆菌液接入1 L新鮮LB培養(yǎng)基(含Amp+)進行大量誘導(dǎo)，離心收集菌體；用Binding Buffer (20 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Imidazole, pH 8.0)重懸菌體，超聲破碎后離心后收集上清；將上清液加入鎳柱中，旋轉(zhuǎn)搖床低溫結(jié)合2 h。收集流穿液，用含不同濃度咪唑 (20, 25, 50和200 mmol/L)的洗脫溶液洗脫柱子，收集洗脫液，12%的SDS-PAGE檢測。

在低溫條件下，將純化后蛋白洗脫液裝入透析袋，在透析液(20 mmol/L Tris-HCl)中4℃透析48 h(12～16 h換1次透析液)。用10 kD的超濾管濃縮蛋白，12% SDS-PAGE檢測蛋白純度，Bradford法定量蛋白濃度。

1.5 Western bolt鑒定重組蛋白EoPPase672

將1.4節(jié)純化的重組蛋白EoPPase672樣品進行SDS-PAGE檢測，將分離膠部分進行轉(zhuǎn)膜(冰浴條件下，20 V恒壓轉(zhuǎn)移1 h)，用含5%脫脂奶粉的TBST，37℃封閉NC膜4 h。用含3%脫脂奶粉的TBST按1∶5 000(v/v)稀釋一抗(Mouse Anti His-Tag MonoClonal antibody)，37℃孵育2 h，洗膜5次；1∶3 000 (v/v)稀釋二抗(Horseradish Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG)，37℃孵育1.5 h，洗膜5次；DAB染色液避光染色5 min后觀察顯色情況。

1.6 溴氰菊酯刺激后茶尺蠖EoPPase672的表達水平檢測

通過毒力實驗測定，測得溴氰菊酯對茶尺蠖的亞致死濃度(LC10=2.08 mg/L)，使用(LC10)溴氰菊酯浸泡茶葉10 s后飼喂茶尺蠖2-4齡幼蟲，分別在0(CK), 12, 24和48 h后取試蟲，一個處理條件處理6頭同齡昆蟲，液氮冷凍保存，使用Transzol法提取幼蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。用Primer Premier 5設(shè)計引物序列，以18S rRNA(正向引物: 5′-GAGAAACGGCTACCACATCCA-3′; 反向引物: 5′-GCAAATGCTTTCGCTGATGTT-3′)作為內(nèi)參基因，基于茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的EoPPase672基因cDNA序列的保守性設(shè)計相應(yīng)引物(正向引物: 5′-CCACACAGTTTTCCGCTACA-3′; 反向引物: 5′-TATGCTCACCAAGCAGCATC-3′)，qRT-PCR檢測溴氰菊酯刺激后不同時間點EoPPase672的表達水平。PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green Mix 12.5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各2.5 μL, cDNA模板1.0 μL, RNase-Free Water 6.5 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后添加溶解曲線。每個處理3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)來自2頭個體，3個技術(shù)性重復(fù)。

1.7 茶尺蠖EoPPase672酶活力測定

配制Na2HPO4(0.1 mol/L)溶液，取用不同量(0, 150, 250, 350, 450, 550, 600, 750和850 μL)加H2O定容至25 mL混勻，每份取240 μL并加入2 mL AAM[體積比為H2O∶正鉬酸銨(20 mmol/L)∶硫酸(2 mmol/L)∶丙酮=0.12∶0.5∶1.25∶2]靜置顯色3 min后于420 nm下比色測定，制作磷含量標準曲線。實驗組依次加入20 μL焦磷酸鈉(0.017 mol/L), 500 μL P Buffer[0.06 g Tris-HCl， 0.003g MgSO4(1 mmol/L)定容于100 mL]，50 μL H2O，1.4節(jié)原核表達純化后的茶尺蠖EoPPase672酶液(0.28 mg/mL) 20 μL，對照組用H2O替代，65℃水浴30 min，立即加入100 μL檸檬酸(0.1 mmol/L)溶液終止反應(yīng)，冷卻至室溫取240 μL加入2 mL AAM，靜置顯色3 min后于420 nm下比色測定磷酸根濃度，利用標準曲線算出溶液中無機磷酸鹽(Pi)的濃度，進一步測定EoPPase672酶活力。將1.4節(jié)原核表達純化后的茶尺蠖EoPPase672酶液稀釋200倍后，按上述酶活力測定的方法測定不同pH(4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0和10.5)下的酶活力[1 個酶活力單位(U)為1 μmol EoPPase672在65℃時，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol底物所需的酶量]，制作酶活力與pH相關(guān)曲線，測定酶反應(yīng)最適pH。將1.4節(jié)原核表達純化后的茶尺蠖EoPPase672酶液稀釋200倍后，按上述酶活力測定的方法測定不同溫度下(25, 35, 45, 55, 65, 75, 85和95℃)酶活力，制作酶活力與溫度相關(guān)曲線，測定酶反應(yīng)最適溫度。用不同金屬離子(Ca2+, Cu2+, Mn2+和Zn2+)替換P Buffer中的Mg2+，檢測添加不同金屬離子與Mg2+共同作為輔因子時重組蛋白EoPPase672的活力，驗證不同金屬離子對酶活力的影響。

1.8 重組蛋白EoPPase672在PCR反應(yīng)中對PPi的去除效果檢測

為了研究PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的焦磷酸基團對PCR擴增的抑制效果，稱取0.003 g焦磷酸鈉配制4 mmol/L焦磷酸鈉溶液，依次稀釋為0, 0.25, 0.5, 1, 2和4 mmol/L后加入PCR反應(yīng)中，基于EoPPase672序列設(shè)計正反向引物(5′-GCATTATCG CCGCGCGTGTT-3′; 5′-GAGATTGGAAGCGAGGTAG-3′)，以pET-32a-EoPPase672質(zhì)粒DNA為模板進行PCR。PCR反應(yīng)體系(20 μL)： Taq 9 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL， DNA模板1.0 μL， ddH2O 8.0 μL, PPi 1.0 μL。反應(yīng)程序： 94℃ 4 min; 94℃ 50 s, 57℃ 40 s, 72℃ 40 s, 32個循環(huán); 72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。

以只添加不同濃度的PPi(0, 0.4, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6和1.8 mmol/L)為對照組，實驗組中添加與對照組中相同濃度的PPi和1 μL重組蛋白EoPPase672(1.0 mg/mL)，檢測不同濃度的PPi對PCR擴增效率的影響以及重組蛋白EoPPase672對PPi抑制效果的影響?；贓oPPase672序列設(shè)計正反向引物(5′-GCATTATCGCCGCGCGTGTT-3′; 5′-GAGATTGGAAGCGAGGTAG-3′)，以pET-32a-EoPPase672質(zhì)粒DNA為模板進行PCR。PCR反應(yīng)體系(20 μL)： Taq 9 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, pET-32a-EoPPase672質(zhì)粒DNA模板1.0 μL, ddH2O 8.0 μL, PPi 1.0 μL。反應(yīng)程序： 94℃ 4 min; 94℃ 50 s, 57℃ 40 s, 72℃ 40 s, 32個循環(huán); 72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。

1.9 重組蛋白EoPPase672對PCR擴增效率的影響檢測

在實驗組中依次加入不同劑量的Taq酶(10, 15, 20, 25和30 U)和重組蛋白EoPPase672(1.0 mg/mL) 1 μL，以只含有不同濃度Taq酶(10, 15, 20, 25和30 U)的PCR作為對照組，進行PCR，引物序列同1.8節(jié)，分析重組蛋白EoPPase672對PCR擴增效率的影響。PCR反應(yīng)體系(20 μL): Taq 9 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, DNA模板1.0 μL, ddH2O 7.0 μL, PPi 1.0 μL，重組蛋白EoPPase672(1.0 mg/mL) 1.0 μL。反應(yīng)程序: 94℃ 4 min; 94℃ 50 s, 57℃ 40 s,72℃ 40 s 32個循環(huán); 72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠檢測PCR結(jié)果。

1.10 數(shù)據(jù)分析

基因相對表達量的計算采用2-ΔΔCT法，利用IBM SPSS Statistics 2分析基因相對表達量數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析和LSD多重比較分析差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 茶尺蠖EoPPase672序列分析

從茶尺蠖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選到EoPPase672 cDNA(GenBank登錄號: OM962968),其開放閱讀框全長1 023 bp，編碼340個氨基酸。其編碼蛋白PPase672預(yù)測相對分子質(zhì)量為37.8 kD，等電點為6.27，親水性指數(shù)為-0.326，推測為親水性蛋白。無信號肽，為分泌型蛋白。

氨基酸序列比對結(jié)果表明(圖1)，昆蟲的PPase結(jié)構(gòu)域序列保守。茶尺蠖EoPPase672與家蠶BombyxmoriBmPPase的序列一致性最高，為80%，與粉紋夜蛾TrichopiusianiTnPPase的序列一致性為76%，與斜紋夜蛾SpodopteralituraSlPPase的序列一致性為76%，與棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHaPPase的序列一致性為77%。系統(tǒng)發(fā)育樹表明茶尺蠖EoPPase672與鱗翅目昆蟲夜蛾類中的粉紋夜蛾TnPPase的親緣關(guān)系最近，與鞘翅目的赤擬谷盜TriboliumcastaneumTcPPase親緣關(guān)系最遠(圖2)。

圖1 茶尺蠖EoPPase672與其他昆蟲PPase氨基酸序列比對Fig.1 Amino acid sequence alignment of EoPPase672from Ectropis obliqua and PPase from other insects蛋白來源物種及GenBank登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: EoPPase672: 茶尺蠖Ectropis obliqua, OM962968; TnPPase: 粉紋夜蛾Trichopiusia ni, XP_026737068.1; SlPPase: 斜紋夜蛾Spodoptera litura, XP_022835395.1; HaPPase: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera, XP_021199627.1; HvPPase: 煙芽夜蛾Heliothis virescens, PCG63030.1; BmPPase: 家蠶Bombyx mori, XP_004922937.1; VtPPase: 特美紅蛺蝶Vanessa tameamea, XP_026484258.1; DppPPase: 黑脈金斑蝶Danaus plexippus plexippus, XP_032513218.1; AtPPase: 臍橙螟Amyelois transitella, XP_013184525.1; PxPPase: 小菜蛾P(guān)lutella xylostella, CAG9132134.1; GmPPase: 大蠟螟Galleria mellonella, XP_026753285.1.

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的茶尺蠖和其他昆蟲PPase672的系統(tǒng)進化樹(1 000次重復(fù))Fig.2 Phylogenetic tree of PPase672 from Ectropis obliquaand other insects by neighbor-joining method based onamino acid sequences (1 000 replicates)蛋白來源物種及GenBank登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: TnPPase: 粉紋夜蛾Trichoplusia ni, XP_026737068.1; SlPPase: 斜紋夜蛾Spodoptera litura, XP_022835395.1; HaPPase: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera, XP_021199627.1; HvPPase: 煙芽夜蛾Heliothis virescens, PCG63030.1; EoPPase672: 茶尺蠖Ectropis obliqua, OM962968; CsPPase672: 水稻二化螟Chilo suppressalis,RVE43533.1; BmaPPase:野桑蠶Bombyx mandarina; XP_028027307.1; BmPPase: 家蠶Bombyx mori, XP_004922937.1; AtPPase: 臍橙螟Amyelois transitella, XP_013184525.1; GmPPase: 大蠟螟Galleria mellonella, XP_026753285.1; PrPPase: 菜粉蝶Pieris rapae, XP_022123308.1; PmPPase: 金鳳蝶Papilio machaon, XP_014370251.1; PxPPase: 柑橘鳳蝶Papilio xuthus, KPI99608.1; TcPPase: 赤擬谷盜Tribolium castaneum, XP_008200814.1.

2.2 EoPPase672的原核表達

SDS-PAGE結(jié)果如圖3(A, B)所示，在50 kD處有一條表達量很高的條帶，與目的蛋白大小一致。Western blot結(jié)果進一步表明重組EoPPase672蛋白的正確表達(圖3: C)。將蛋白洗脫液經(jīng)過透析、濃縮和定量，最終獲得重組EoPPase672蛋白濃度為0.28 mg/mL，單一性較強，可用于后續(xù)功能驗證。

圖3 重組EoPPase672蛋白表達(A)、純化(B)的SDS-PAGE及Western blotting(C)Fig.3 SDS-PAGE detection of expression (A) and purification (B), and Western blotting (C) of the recombinant EoPPase672M: 蛋白質(zhì)分子量標準Protein molecular weight marker; 1: 總菌體裂解液(未誘導(dǎo))Total bacterial lysate (not induced); 2: 37℃下0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后的總菌體裂解液Total bacterial lysate induced by 0.6 mmol/L IPTG at 37℃ for 4 h; 3: 超聲上清 Ultrasonic supernatant; 4: 超聲沉淀Ultrasonic precipitate; 5: 總菌體裂解液(未誘導(dǎo))Total bacterial lysate (not induced); 6: 28℃ 180 r/min下0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后的總菌體裂解液Total bacterial lysate induced by 0.6 mmol/L IPTG at 28℃ and 180 r/min for 4 h; 7: 流穿液Flow-through sample; 8-13: 分別用濃度為20, 25, 50和200 mmol/L的咪唑洗脫緩沖液洗脫獲得的蛋白Protein samples washed with 20, 25, 50 and 200 mmol/L imidazole elution buffer, respectively; 14: Western blot檢測的純化重組蛋白Purified recombinant protein detected by Western blot.

2.3 溴氰菊酯刺激后茶尺蠖幼蟲中EoPPase672的表達水平

結(jié)果表明(圖4)，溴氰菊酯(LC10=2.08 mg/L)刺激12 h后，茶尺蠖幼蟲中EoPPase672表達整體情況呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，2和3齡幼蟲中的表達量與對照組的相比顯著上調(diào)(P<0.001)，4齡幼蟲中的小幅上調(diào)，與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；24 h后，2和3齡幼蟲中EoPPase672的表達量與對照組相比仍然顯著上調(diào)(P<0.001)，但相對于處理12 h而言，表達量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。

圖4 溴氰菊酯(LC10=2.08 mg/L)刺激不同時間后EoPPase672在茶尺蠖不同齡期幼蟲中的表達量Fig.4 Expression levels of EoPPase672 in Ectropisobliqua larvae at different instars after exposed todeltamethrin (LC10=2.08 mg/L) for different time圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤; 柱上星號表示基因相對表達量在處理組與對照組間的差異顯著性(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)(t檢驗)。Data in the figure are mean±SE.Asterisk above bars indicates significant difference in the relative gene expression level between the treatment group and the control group (*P<0.01; **P<0.01; ***P<0.001)(t-test).

2.4 EoPPase672酶活力

酶活力測定結(jié)果顯示(圖5: A)，通過Pi含量標準曲線可得EoPPase672比活力為1 279.6 U/mg。pH 4-6時酶活力低，隨著pH增加酶活力呈線性增加(圖5: B)，在靠近pH 6-7之間突然降低，推測原因可能是此pH接近蛋白質(zhì)等電點，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低，酶反應(yīng)最適pH 7-8，高于pH 8之后酶活力緩慢降低，表明EoPPae672酶反應(yīng)最適pH 7.5左右。熱穩(wěn)定性研究表明(圖5: C)，重組蛋白EoPPase672在20-100℃之間都有酶活力，65℃時活力最高，為酶反應(yīng)最適溫度，當溫度低至20℃或高至95℃時相對活力都高達40%以上，表明重組蛋白EoPPase672具有很好的熱穩(wěn)定性。酶反應(yīng)的發(fā)生需要金屬離子作為輔因子，結(jié)果表明，Mg2+是最適金屬離子，Zn2+和Mn2+對重組蛋白EoPPase672的酶活力具有抑制作用(圖5: D)。

圖5 重組蛋白EoPPase672的酶活力(A)以及最適pH (B)、最適溫度(C)和最適金屬離子(D)Fig.5 Determination of activity (A), and the optimum pH (B), optimum temperature (C)and optimum metal ion (D) of the recombinant EoPPase672利用無機磷酸鹽(Pi)含量標準曲線測得酶活力。Standard curve of inorganic phosphate (Pi) content was used to determine the enzyme activity.

2.5 EoPPase672在PCR反應(yīng)中對PPi去除效果

PCR反應(yīng)后期，副產(chǎn)物的大量積累會直接影響擴增效率，為了驗證PPi對PCR反應(yīng)的抑制效果，外源添加焦磷酸鈉到PCR反應(yīng)中，結(jié)果如圖6，當焦磷酸鈉濃度較低(0.25和0.5 mmol/L)時，對PCR的抑制效果不明顯，當焦磷酸鈉濃度增加到1 mmol/L時明顯抑制了擴增效率，2 mmol/L以上則完全抑制。表明當反應(yīng)體系中存在大量PPi時會對擴增效率產(chǎn)生一定影響。在PPi濃度相同的情況下，添加1.0 mg/mL EoPPase672后泳道4(未添加EoPPase672)與3(0.4 mmol/L PPi)無顯著差異。當焦磷酸鈉濃度為0.8 mmol/L時，泳道6(未添加EoPPase672)擴增結(jié)果明顯低于泳道5。當焦磷酸鈉濃度高于 1.0 mmol/L 時，如未添加 EoPPase672的泳道8, 10, 12, 14和16所示，PCR擴增被完全抑制，添加重組蛋白EoPPase672的不受抑制，如泳道7, 9, 11, 13和15所示，擴增條帶與對照組(0 mmol/L焦磷酸鈉)無顯著差異(圖7)。說明在PCR反應(yīng)中添加重組蛋白EoPPase672可以在一定程度上水解PPi，解除PPi對PCR擴增的抑制作用。

圖6 不同濃度焦磷酸鈉(PPi)對PCR反應(yīng)的抑制作用Fig.6 Inhibition of sodium pyrophosphate (PPi) ofdifferent concentrations on PCR reactionM: DNA分子量標準DNA molecular weight marker; 1-6: 分別為0(CK), 0.25, 0.5, 1, 2和4 mmol/L PPi 0(CK)， 0.25, 0.5, 1, 2 and 4 mmol/L PPi, respectively.

圖7 重組蛋白EoPPase672 (1.0 mg/mL)在PCR反應(yīng)中對焦磷酸鈉(PPi)去除效果Fig.7 Effect of the recombinant EoPPase672 (1.0 mg/mL)on the removal of sodium pyrophosphate (PPi)in PCR reactionM: DNA分子量標準DNA molecular weight marker; 1: 0 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 2: 0 mmol/L PPi; 3: 0.4 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 4: 0.4 mmol/L PPi; 5: 0.8 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 6: 0.8 mmol/L PPi; 7: 1.0 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 8: 1.0 mmol/L PPi; 9: 1.2 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 10: 1.2 mmol/L PPi; 11: 1.4 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 12: 1.4 mmol/L PPi; 13: 1.6 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 14: 1.6 mmol/L PPi; 15: 1.8 mmol/L PPi+1 μL EoPPase672; 16: 1.8 mmol/L PPi.

2.6 重組蛋白EoPPase672對PCR擴增效率的影響

結(jié)果顯示(圖8)，泳道1為2 μL Taq酶，無明顯條帶，泳道2為2 μL Taq酶加1 μL重組蛋白EoPPase672，擴增結(jié)果顯示有較淡條帶。加入重組蛋白EoPPase672后泳道4, 6, 8和10擴增結(jié)果明顯高于對照組泳道3, 5, 7和9(不加重組蛋白EoPPase672)。結(jié)果表明PCR反應(yīng)體系中加入重組蛋白EoPPase672對PCR擴增效率具有增強效果。

圖8 重組蛋白EoPPase672 (1.0 mg/mL)對PCR擴增效果的影響Fig.8 Effect of the recombinant EoPPase672 (1.0 mg/mL)on the PCR amplification efficiencyM: DNA分子量標準DNA molecular weight marker; 1: 2 μL Taq; 2: 2 μL Taq+1 μL EoPPase672; 3: 3 μL Taq; 4: 3 μL Taq+1 μL EoPPase672; 5: 4 μL Taq; 6: 4 μL Taq+1 μL EoPPase672; 7: 5 μL Taq; 8: 5 μL Taq+1 μL EoPPase672; 9: 6 μL Taq; 10: 6 μL Taq+1 μL EoPPase672.

3 討論

本研究從菊酯類殺蟲劑處理茶尺蠖的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到無機焦磷酸酶基因EoPPase672片段，該基因可以被殺蟲劑誘導(dǎo)上調(diào)表達(圖4)。對基因序列進行生物學(xué)信息預(yù)測，結(jié)果表明EoPPase672的ORF全長1 023 bp可編碼340個氨基酸殘基，推測為親水性蛋白。通過構(gòu)建原核表達載體，成功表達可溶性的蛋白(圖3)，在高溫下穩(wěn)定性強，在pH 7.5，65℃下活力最高(圖5)。

在溴氰菊酯刺激茶尺蠖不同齡期幼蟲后，12 h后EoPPase672表達量迅速升高(圖4)，推測可能昆蟲對溴氰菊酯的作用反應(yīng)比較迅速。比較不同齡期之間的反應(yīng)程度，齡期越小的幼蟲在受到外界殺蟲劑入侵后更易誘導(dǎo)無機焦磷酸酶的表達，而齡期較高的幼蟲，機體本身免疫防御能力強，在LC10濃度下對4齡幼蟲的影響較低，結(jié)果提示茶尺蠖的防治在4齡幼蟲之前，殺蟲劑的作用效果較強，用量少。

有報道稱，焦磷酸可能是輔酶α連接酶的抑制劑，這種抑制作用可以通過添加PPase來解除，該酶可以催化PPi水解無機磷酸鹽(Pi)，從而可以加速ATP的生成(Lelièvreetal., 2020)。此外，PPase對不同的DNA聚合酶的增強效果不同，例如對iProof, Pfu turbo, S-KT的效果明顯弱于對Taq(李小園等, 2004)，推測原因可能是Taq酶中的金屬離子為Mg2+，在反應(yīng)過程中會競爭離子，從而導(dǎo)致增強效果稍弱(李小園等, 2004)。金屬離子是蛋白酶發(fā)揮活性的輔助因子，如果缺乏會影響到酶活力。在本研究中發(fā)現(xiàn)，Mg2+對EoPPase672的活力是必不可少的，而其他離子起到少量的促進或者抑制作用(圖5)。當同時加入Mg2+, Cu2+或者Ca2+時，無機焦磷酸酶的活力下降，當加入Mn2+時酶活力抑制程度增強，而Zn2+幾乎完全抑制。

此外，PPase在許多生物學(xué)過程中起著重要作用(Poole and Reeve, 2005; Carman and Han, 2006)，并且與許多臨床疾病(例如肺腺癌和結(jié)直腸癌)有關(guān)(Friedmanetal., 2004)。因此，可以建立一些簡便、靈敏的PPase活力測定方法，通過測定PPase的活力，以此來預(yù)測相關(guān)的疾病。一些生物傳感器的建立(Zhangetal., 2017)為PPase活力的測定帶來了便利。

PCR擴增后期會進入平臺期，產(chǎn)物積累速度減慢，酶和底物的穩(wěn)定性、活力均降低，前期不斷產(chǎn)生的焦磷酸基團大量積累，抑制擴增效率，同時存在引物二聚體或非特異性產(chǎn)物發(fā)生非特異性競爭，高濃度擴增產(chǎn)物變性不徹底和擴增產(chǎn)物自身復(fù)性等現(xiàn)象。無機焦磷酸酶可以水解PPi基團，研究發(fā)現(xiàn)體外表達的EoPPase672對PCR反應(yīng)具有增效的作用(圖8)，而加入無機焦磷酸酶可以有效消除這種現(xiàn)象。本研究中在加入重組蛋白EoPPase672后，PCR的擴增效率得到極大的提升，說明PPase作為一種PCR擴增增強劑的可行性，其熱穩(wěn)定性也為發(fā)揮功能提供了保障。研究結(jié)果為茶尺蠖解毒機理的研究提供了思路與依據(jù)。