馬麗杰，武占敏，張俊杰，呂 文，張 偉，楊政偉，卓瑪曲措，胡小平

(1.鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017010；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；3.鄂爾多斯市植保植檢站，內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017010；4.鄂爾多斯市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017010；5.西藏農(nóng)牧學(xué)院 植物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000)

苜蓿是世界上種植面積最大的豆科牧草，也是中國(guó)近年來(lái)大面積推廣和種植的優(yōu)良牧草[1]。內(nèi)蒙古是國(guó)內(nèi)五大牧草種植區(qū)之一，苜蓿商品草種植面積和產(chǎn)量居全國(guó)第二[2]。由苜蓿條紋單孢銹菌(Uromycesstriatus)引起的苜蓿銹病是中國(guó)北方苜蓿種植區(qū)普遍發(fā)生的重要流行性葉部病害，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致苜蓿減產(chǎn)10%～30%，種子減產(chǎn)50%[3-4]，病葉的鮮質(zhì)量比健康葉片減少44%，粗蛋白含量下降18%，粗纖維含量增加15%[5]，苜蓿莖葉枯黃不能飼用[3]，大幅度降低苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)。內(nèi)蒙古中部地區(qū)苜蓿最后一次刈割一般在10月下旬結(jié)束，殘存的苜蓿銹菌很可能在苜蓿或其轉(zhuǎn)主寄主上潛伏侵染并越冬，成功越冬的病菌可成為翌年病害流行的初侵染源。關(guān)于苜蓿銹菌的越冬部位及越冬形態(tài)，目前有四種觀點(diǎn)：第一，苜蓿銹菌可在轉(zhuǎn)主寄主乳漿大戟等的地下器官內(nèi)以菌絲體形態(tài)越冬[6-8]；第二，苜蓿銹菌可以冬孢子形態(tài)在病殘?bào)w上越冬[9]。第二年侵染其轉(zhuǎn)主寄主大戟并在其上完成有性世代，形成銹孢子后，由銹孢子轉(zhuǎn)染到苜蓿上，使之發(fā)病[10]；第三，苜蓿銹菌可以直接在苜蓿根莖內(nèi)越冬[3]；第四，在冬季較溫暖的地區(qū)如伊拉克[11]，苜蓿銹菌也能以夏孢子形態(tài)越冬[10,12]。

上述關(guān)于苜蓿銹菌越冬部位的研究，大多根據(jù)田間調(diào)查經(jīng)驗(yàn)推斷所得，缺乏直接試驗(yàn)證據(jù)。目前，內(nèi)蒙古中部地區(qū)苜蓿銹菌越冬的菌量和越冬部位還不清楚。因此，本研究建立一種基于RNA水平的real-time qPCR技術(shù)，對(duì)內(nèi)蒙古中部5個(gè)苜蓿主產(chǎn)區(qū)返青后植株內(nèi)的銹菌量進(jìn)行檢測(cè)，明確苜蓿銹菌越冬菌量和越冬部位，為苜蓿銹病的綜合防控提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查點(diǎn)選擇

2018-2020年，選擇內(nèi)蒙古中部5個(gè)苜蓿主產(chǎn)區(qū)作為調(diào)查點(diǎn)，自東向西分別為烏蘭察布市、呼和浩特市、包頭市、鄂爾多斯市和巴彥淖爾市 (圖1)。

圖1 內(nèi)蒙古苜蓿銹病調(diào)查點(diǎn)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植株標(biāo)記 2018-2020年每年11月中下旬，對(duì)每個(gè)調(diào)查點(diǎn)采用5點(diǎn)取樣法標(biāo)記50株冬前發(fā)病的植株，翌年4月初，從冬前標(biāo)記現(xiàn)已返青的植株上從上向下剪取5 cm長(zhǎng)度的植株材料裝于含有RNAlaterTMSoIn保存溶液(Invitrogen, AM7021)的10 mL離心管中，備用。

1.2.2 田間樣品處理 將田間樣品從離心管中取出，用吸水紙吸掉殘留溶液，用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈并吸干水分，剪碎混勻，稱取100 mg，備用。

1.3 建立RNA水平的Real-time qPCR體系

1.3.1 RNA提取、純化并反轉(zhuǎn)錄成cDNA 稱取發(fā)病的苜蓿銹病葉片100 mg(約5片)，液氮研磨成粉末，用SV Total RNA Isolation System(Promega)試劑盒提取總RNA。用Nanodrop 2000(Thermo Fisher)儀器測(cè)RNA總濃度。最終獲得總RNA，其濃度為145 ng/μL，OD260/280為2.1，OD260/230為2.2，RNA完整性好。根據(jù)Thermo scientific ReverAid First Stand cDNA Synthesis kit試劑盒進(jìn)行RNA純化和反轉(zhuǎn)錄。

1.3.2 苜蓿銹菌特異性引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道，Eric Kemen設(shè)計(jì)特異性引物將苜蓿銹菌(Uromycesstriatus)和同源性較高的蠶豆銹菌(Uromycesfabae)進(jìn)行區(qū)分，引物合成見(jiàn)表1的Us-RTP1-NLS1。采用Us-RTP1-NLS1的下游引物，并在Us-RTP1基因組上重新設(shè)計(jì)上游引物，合成新引物Us-PTP1-NLS2(表1)。通過(guò)序列比對(duì)軟件BioEdit比對(duì)2對(duì)引物，結(jié)果顯示2對(duì)引物只有2個(gè)堿基的差異(圖2)。將2對(duì)引物分別在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與苜蓿上常見(jiàn)的其他4種葉部病害苜蓿褐斑病(苜蓿假盤(pán)菌Pseudopezizamedicaginis)，苜蓿葉腫病(小光殼屬Leptosphaerulinabriosiana)，苜?；野卟?尾孢菌屬Cercosporamedicaginis)和苜蓿炭疽病(炭疽屬Colletotrichumspp.)均無(wú)匹配。

圖2 兩對(duì)引物在苜蓿銹菌基因組上的比對(duì)

表1 苜蓿銹菌特異性引物

1.3.3 苜蓿組織特異性引物合成 選用文獻(xiàn)[15]中擴(kuò)增苜蓿葉片組織基因PDF2、UBC和Ubiquitin的3對(duì)引物進(jìn)行合成并擴(kuò)增(表2)。

表2 苜蓿葉片組織特異性引物

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 根據(jù)UltraSYBR Mixture(CWBIO)試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建。以獲取的初始cDNA為模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，最終獲得2.03、2.03×10-1、 2.03×10-2、2.03×10-3、2.03×10-4、2.03×10-5、 2.03×10-6、2.03×10-7ng/μL 8個(gè)濃度梯度cDNA，分別利用苜蓿銹菌特異性引物和苜蓿葉片組織特異性引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，每個(gè)梯度樣品重復(fù)3次。

1.4 指標(biāo)測(cè)定方法

每個(gè)cDNA樣品由苜蓿銹菌cDNA和苜蓿葉片組織cDNA組成。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算，以分子病情指數(shù)(molecular-detected disease index, MDI)進(jìn)行定義并測(cè)算[16]：

MDI=苜蓿銹菌cDNA量(pg)/苜蓿葉片組織cDNA量(ng)×100%

1.5 返青后苜蓿植株發(fā)病率調(diào)查

在6月中旬，利用5點(diǎn)取樣法對(duì)各監(jiān)測(cè)點(diǎn)苜蓿銹病發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查。每點(diǎn)調(diào)查20株，每個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)共調(diào)查100株，記錄植株發(fā)病率。

植株發(fā)病率(%)=發(fā)病的植株數(shù)/調(diào)查的總株數(shù)×100%

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示測(cè)定結(jié)果，分別對(duì)同一年份不同地區(qū)和同一地區(qū)不同年份的分子病情指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，用S-N-K法對(duì)各測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，對(duì)不同地區(qū)不同年份進(jìn)行單變量方差分析，采用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于RNA水平的real-time qPCR體系構(gòu)建

2.1.1 引物特異性驗(yàn)證 利用普通PCR對(duì)2對(duì)苜蓿銹菌引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，2對(duì)引物均可以擴(kuò)出目標(biāo)條帶且位置大小一致(圖3-A)，后續(xù)以Us-RTP1-NLS2引物進(jìn)行銹菌qPCR定量研究。利用苜蓿葉片特異性引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，PDF2引物擴(kuò)增條帶亮(圖3-B)，后續(xù)以PDF2引物進(jìn)行苜蓿葉片組織qPCR定量研究。

A.苜蓿銹菌 Us-RTP1基因的擴(kuò)增片段條帶，其中，泳道1是陰性對(duì)照，泳道2和3是相同引物Us-RTP1-NLS1擴(kuò)增條帶，泳道4和5是相同引物Us-RTP1-NLS2擴(kuò)增條帶，泳道6是Marker

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建 以2.03、2.03×10-1、 2.03×10-2、 2.03×10-3、2.03×10-4ng/μL cDNA為模板進(jìn)行qPCR，構(gòu)建發(fā)病葉片中苜蓿銹菌cDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4-A)。以2.03×10-3、2.03×10-4、2.03×10-5、2.03×10-6、2.03×10-7ng/μL cDNA為模板進(jìn)行qPCR，構(gòu)建發(fā)病葉片組織cDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4-B)。樣品中苜蓿銹菌的量遠(yuǎn)低于苜蓿葉片組織的量。

A.苜蓿銹菌cDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.苜蓿葉片組織cDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 苜蓿銹菌越冬菌量的測(cè)定

2.2.1 不同地區(qū)間越冬菌量比較 2018-2020年，利用建立的RNA水平real-time qPCR體系對(duì)內(nèi)蒙古5個(gè)苜蓿主產(chǎn)區(qū)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)。烏蘭察布市、呼和浩特市、包頭市、鄂爾多斯市、巴彥淖爾市3 a平均分子病情指數(shù)MDI分別為 0.139、0.284、0.196、0.569、0.280。其中，鄂爾多斯市3 a平均MDI顯著高于其他4個(gè)地區(qū)的平均MDI(P=0.005)(圖5)。

不同小寫(xiě)字母代表在0.05水平差異顯著

2.2.2 不同年份間越冬菌量比較 2019年，檢測(cè)到5個(gè)地區(qū)苜蓿銹菌平均MDI為0.43，顯著高于2018年的MDI 0.24(P<0.05)和2020年的MDI 0.13(P<0.001)。2018年，5個(gè)地區(qū)的平均MDI無(wú)顯著差異(表3)。2019年，鄂爾多斯市的平均MDI為1.02，顯著高于其他4個(gè)地區(qū)(P< 0.001)。2020年，鄂爾多斯市的平均MDI為0.20，與巴彥淖爾市和呼和浩特市無(wú)顯著差異，但顯著高于包頭市(P=0.004)和烏蘭察布市(P=0.001)。

表3 各地區(qū)在不同年份間苜蓿銹菌分子病情指數(shù)MDI的方差分析

以苜蓿銹菌平均分子病情指數(shù)MDI作為因變量，對(duì)3 a(2018-2020年)、5個(gè)地區(qū)(烏蘭察布市、呼和浩特市、包頭市、鄂爾多斯市、巴彥淖爾市)分子病情指數(shù)MDI進(jìn)行方差分析(表4)，結(jié)果顯示，年份和地區(qū)內(nèi)均存在極顯著差異(P< 0.001)，年份*地區(qū)之間存在顯著差異(P< 0.05)。

表4 不同處理不同年份不同地區(qū)苜蓿銹菌分子病情指數(shù)MDI的方差分析

2.3 苜蓿銹菌越冬菌量與返青后植株發(fā)病率的關(guān)系

2018-2020年，對(duì)返青后苜蓿植株發(fā)病率進(jìn)行田間調(diào)查統(tǒng)計(jì)，并與當(dāng)年苜蓿銹菌越冬菌量進(jìn)行比較，各監(jiān)測(cè)點(diǎn)在相同年份下的分子病情指數(shù)和返青后植株發(fā)病率趨勢(shì)基本一致(圖6)。對(duì)2018-2020年的苜蓿銹菌越冬菌量和返青后植株發(fā)病率進(jìn)行雙變量相關(guān)性檢測(cè)，結(jié)果顯示，苜蓿銹菌越冬菌量和返青后苜蓿植株發(fā)病率呈正相關(guān)，皮爾遜相關(guān)性為r=0.806，P=0.000< 0.001。

圖6 苜蓿銹菌越冬銹菌量與返青后植株發(fā)病率比較

3 結(jié)論與討論

Real-time qPCR技術(shù)是一種具有高度靈敏性和準(zhǔn)確性的核酸定量監(jiān)測(cè)技術(shù)。它是利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量獲得未知樣品的Ct值，再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出未知樣品的起始量[17]。該方法被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物真菌、病毒、細(xì)菌等微生物的RNA和DNA檢測(cè)。Ma等[18]利用RNA水平的real-time qPCR技術(shù)建立檢測(cè)田間越冬小麥條銹菌初始菌量的體系。鄭亞明[19]和閆佳會(huì)等[16]分別基于DNA水平的qPCR技術(shù)對(duì)田間潛伏侵染的小麥白粉菌量和條銹菌量進(jìn)行檢測(cè)。Dhar等[20]利用qPCR對(duì)空氣中霜霉病菌的孢子量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，確定了病害防控閾值(8.55個(gè)/m3)。本研究建立的RNA水平的qPCR技術(shù)可用于定量檢測(cè)苜蓿銹菌越冬的初始菌量，能在田間苜蓿見(jiàn)病前2個(gè)月檢測(cè)到活體苜蓿菌量，結(jié)合本研究結(jié)果，苜蓿銹菌越冬菌量與返青后苜蓿植株發(fā)病率呈正相關(guān)，說(shuō)明建立苜蓿銹菌越冬菌量qPCR檢測(cè)技術(shù)的必要性，為確定病害發(fā)生的重點(diǎn)區(qū)域及科學(xué)防控方法提供理論依據(jù)。

苜蓿銹菌是嚴(yán)格的專性寄生真菌，苜蓿銹病的分布與苜蓿種植區(qū)基本一致。1995年，侯天爵等[7]初步探究?jī)?nèi)蒙古苜蓿銹病的發(fā)生和分布范圍，其中，呼和浩特市和赤峰市(北緯約40°～41°)發(fā)病較為嚴(yán)重，錫林浩特市(北緯約44°)發(fā)病較輕，并提出苜蓿銹病的發(fā)生隨緯度升高而病害減輕的觀點(diǎn)。本研究的5個(gè)調(diào)查點(diǎn)中，烏蘭察布市的緯度(北緯約41.56°)最高，鄂爾多斯市的緯度(北緯約39.82°)最低，結(jié)合Real-time qPCR定量結(jié)果，烏蘭察布市的越冬苜蓿銹菌量最低，鄂爾多斯市的最高，結(jié)果與前人表述一致。但包頭市、巴彥淖爾市、呼和浩特市的越冬苜蓿銹菌量分布與地理緯度關(guān)系不明顯。病原菌的越冬菌量與品種抗凍性、溫度和濕度等相關(guān)氣象因子、秋季發(fā)病程度、越冬部位、種植環(huán)境等因素密切相關(guān)，單從地理緯度區(qū)分意義不大，仍需要通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)才能獲得最準(zhǔn)確可靠的越冬菌量。

本研究在返青后苜蓿植株上部5 cm材料中檢測(cè)到苜蓿銹菌，說(shuō)明苜蓿銹菌可以在苜蓿地下根莖組織中順利越冬。這與侯天爵提出的苜蓿銹菌可以直接在苜蓿莖內(nèi)越冬的觀點(diǎn)一致[3]。

溫度是影響苜蓿銹菌越冬的關(guān)鍵氣象因子。2019年的越冬苜蓿銹菌量顯著高于2018和2020年的。結(jié)合氣象資料分析，除包頭市外的4個(gè)調(diào)查點(diǎn)在2019年11月中旬到翌年1月中旬的日平均溫度分別為烏蘭察布市(-11.37 ℃)、呼和浩特市(-8.63 ℃)、鄂爾多斯市(-6.91 ℃)、巴彥淖爾市(-7.47 ℃)，均高于同一地區(qū)在2018年和2020年該監(jiān)測(cè)段的日平均溫度。包頭市在2018年的越冬銹菌量達(dá)到3 a中最大值，包頭市2018年該監(jiān)測(cè)段的日平均溫度為2.55 ℃，高于2019年(-10.02 ℃)和2020年(-15.61 ℃)的日平均溫度。本研究顯示11月中旬到翌年1月中旬的日平均溫度與越冬苜蓿銹菌量呈正相關(guān)，溫度對(duì)銹菌越冬的影響仍需進(jìn)一步研究證明。

關(guān)于苜蓿銹菌越冬的具體溫度研究，目前未見(jiàn)報(bào)道。但與其同屬于銹菌目柄銹菌科的小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)的越冬溫度報(bào)道較多，如當(dāng)翌年1月的平均氣溫低至 -6 ℃～-7 ℃時(shí)，小麥條銹菌越冬困難[21-25]，但當(dāng)有積雪覆蓋時(shí)，空氣溫度下降至-10 ℃小麥條銹菌菌絲體仍能順利越冬[21, 26-27]。Ma等[18]的研究表明，田間小麥條銹菌越冬存活率隨著溫度的降低而降低。室內(nèi)試驗(yàn)證明，小麥條銹菌在溫度 -20 ℃～-15 ℃的條件下處理12 h后仍存活，但存活率低于-10 ℃及以上溫度的銹菌存活率[28]。本研究統(tǒng)計(jì)了各調(diào)查點(diǎn)2020年11月中旬到翌年1月中旬的日平均溫度≤-10 ℃的積累時(shí)間，烏蘭察布市(71 d)、呼和浩特市(51 d)、包頭市(70 d)、鄂爾多斯市(37 d)、烏蘭察布市(58 d)。結(jié)合real-time qPCR定量結(jié)果分析，2020年烏蘭察布市和包頭市的越冬苜蓿銹菌量顯著低于其他地區(qū)。本研究顯示，低溫積累時(shí)間也是影響苜蓿銹菌越冬的重要因子，低溫積累時(shí)間越長(zhǎng)，越冬銹菌量越少，但該結(jié)論還需要通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)一步研究證明。