胡丹丹 吳祖芳 孫志棟，* 陳山喬 翁佩芳

(1 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315800；2 寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

葉用芥菜(leaf mustard，BrassicajunceaCoss var. foliosa Bailey)簡(jiǎn)稱葉芥菜，屬于十字花科蕓薹屬作物，是世界上重要的蔬菜作物及調(diào)料作物[1]。葉用芥菜原產(chǎn)于我國(guó)，為我國(guó)長(zhǎng)江流域普遍栽培的腌制蔬菜，是芥菜中適應(yīng)性較強(qiáng)的一個(gè)變種，類型和品種豐富，有大葉芥菜(var.rugosaBailey)、花葉芥菜(var.multisectaBailey)、雪里蕻(var.multicepsT sen et Lee)、莖瘤芥(var.tumidaT sen et Lee)和包心芥菜(var.capitataHart ex Li)等多種類型[2]。葉用芥菜作為人們?nèi)粘Ｊ秤玫男迈r蔬菜，因其水分活度高而容易腐敗，難以貯藏，通過(guò)鹽漬加工成咸菜或酸菜是葉用芥菜常用的貯藏方式。我國(guó)大部分地區(qū)采用的傳統(tǒng)自然發(fā)酵方法，存在發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、蔬菜含鹽量高、亞硝酸鹽累積量大、質(zhì)地軟等缺點(diǎn)[3]。研究表明，通過(guò)人工接種發(fā)酵劑的方式可以降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量、縮短發(fā)酵時(shí)間并改善蔬菜口感[4]。

發(fā)酵菌是食品在發(fā)酵過(guò)程中所應(yīng)用的微生物，目前應(yīng)用于蔬菜發(fā)酵的主要是乳酸菌。乳酸菌代謝糖類產(chǎn)生有機(jī)酸如乳酸，分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生肽類和氨基酸，是發(fā)酵蔬菜的有益微生物。Won等[5]從韓國(guó)泡菜中分離出的清酒乳桿菌ADM14菌株可顯著降低前脂肪細(xì)胞3T3-L1內(nèi)甘油三酯含量，對(duì)酸和膽鹽也有良好的耐受性，具有作為益生菌和替代治療性補(bǔ)充劑的潛力。Chi等[6]從135株乳酸菌中篩選低鹽泡菜發(fā)酵劑并應(yīng)用到泡菜中，表明應(yīng)用發(fā)酵劑發(fā)酵能夠加速風(fēng)味形成并縮短泡菜的成熟期。據(jù)報(bào)道，從發(fā)酵食品(如腌菜)中分離出的乳酸菌對(duì)健康有多種益處，包括預(yù)防便秘、結(jié)腸炎、肝損傷和糖尿病等[7-10]。從已有的研究成果來(lái)看，腌制蔬菜中人工接種所用到的發(fā)酵劑多見(jiàn)于乳酸菌，而酵母菌則能產(chǎn)醇產(chǎn)酯并有利于風(fēng)味的形成，如唐紅梅等[11]從川南腌菜中篩選出4株耐鹽、產(chǎn)香能力強(qiáng)的酵母菌株。我國(guó)有學(xué)者對(duì)發(fā)酵蔬菜的微生物生態(tài)研究表明，乳酸菌和酵母菌是發(fā)酵蔬菜中的優(yōu)勢(shì)菌群[12]。葉用芥菜在腌制過(guò)程中，乳酸菌和酵母菌混合使用則較少，同時(shí)因地域、原材料等限制，微生物菌群也表現(xiàn)出復(fù)雜多樣性。

本研究從自然發(fā)酵的葉用芥菜中分離篩選、鑒定乳酸菌和酵母菌，研究其特性，以期為腌制蔬菜發(fā)酵菌劑的開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)腌制蔬菜的加工和增值提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腌制葉用芥菜，購(gòu)自浙江省寧波市鄞州區(qū)新紫云堂公司。

乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(DeMan Rogosa and Sharpe agar，MRS)以及肉湯、孟加拉紅培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司；脫脂奶粉、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、酚酞均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳酸菌DNA提取試劑盒、酵母菌DNA提取試劑盒、通用引物乳酸菌正向引物27f：5′-A G A G T T T G A T C C T G G C T C AG-3′與反向引物1492r：5′-A A G G A G G T G A T C C A G CC-3′、通用引物酵母菌正向引物ITS1：5′-T C C G T A G G T G A A C C T G C GG-3′與反向引物ITS4：5′-T C C T C C G C T T A T T G A T A T GC-3′,生工生物工程(上海)股份有限公司；食鹽，購(gòu)于華潤(rùn)萬(wàn)家超市。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；Spectramax190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)美谷分子儀器(Molecular Devices)有限公司；5804R型高速大容量冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；LD2F-50L-II型立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；JYL-C19V九陽(yáng)多功能攪拌機(jī)，佛山市秋實(shí)電器有限公司；腌制桶，購(gòu)于寧波邱隘市場(chǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵菌的分離純化 采用梯度稀釋涂布法對(duì)腌制芥菜中的乳酸菌、酵母菌進(jìn)行分離篩選。取25 mL腌制芥菜汁加入225 mL生理鹽水中，振蕩搖勻，并逐級(jí)稀釋至10-1～10-6CFU·mL-1。乳酸菌：分別吸取0.1 mL涂布于含2%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，挑取溶鈣圈大的菌落。酵母菌：分別吸取0.1 mL涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48～72 h，挑取典型的酵母菌菌落。對(duì)挑取的所有菌落反復(fù)分離純化，直至得到純菌落，進(jìn)行斜面保藏并編號(hào)備用。

1.3.2 發(fā)酵菌的篩選

1.3.2.1 乳酸菌 生長(zhǎng)曲線測(cè)定：將活化好的菌株按1%的接種量分別接入滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，從0 h開始取樣，以未接種的MRS液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每隔2 h測(cè)一次波長(zhǎng)600 nm下的吸光度值(optical density, OD)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，觀察各菌株的OD值隨發(fā)酵時(shí)間的變化。

產(chǎn)酸性能測(cè)定：將活化好的菌株按1%的接種量分別接入滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，從0 h開始取樣，以未接種的MRS液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每隔4 h測(cè)一次pH值，每個(gè)樣品重復(fù)3次，觀察各菌株的pH值隨發(fā)酵時(shí)間的變化。

亞硝酸鹽降解率測(cè)定：亞硝酸鹽降解率參照劉芳等[13]的方法(溫度修改為37℃)，根據(jù)鹽酸萘乙二胺法[14]測(cè)定亞硝酸鹽含量，計(jì)算亞硝酸鹽降解率：亞硝酸鹽降解率=(亞硝酸鹽原含量-降解后亞硝酸鹽含量)/亞硝酸鹽原含量×100%。

1.3.2.2 酵母菌 產(chǎn)氣能力檢測(cè)：吸取1%酵母菌的新鮮培養(yǎng)物加入含有杜氏小導(dǎo)管的豆芽汁液體培養(yǎng)基中，每隔12 h觀察杜氏小導(dǎo)管產(chǎn)氣情況，對(duì)酵母菌的產(chǎn)氣能力進(jìn)行初步判斷，進(jìn)一步篩選出性狀良好的優(yōu)良菌株。

蛋白酶活性檢測(cè)：將根據(jù)產(chǎn)氣能力篩選出的酵母菌菌株進(jìn)行活化，按照1%的接種量均勻涂布于蛋白酶檢測(cè)固體培養(yǎng)基中，放置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h， 觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明環(huán)，有透明環(huán)表明該菌株具有蛋白酶活性。

產(chǎn)酯測(cè)定：將具有蛋白酶活性菌株按照1%的接種量加入豆芽汁培養(yǎng)基中，放置于28℃搖床中培養(yǎng)48 h 后，采用回流皂化方法[15]測(cè)定培養(yǎng)液中的總酯含量。

1.3.3 發(fā)酵菌的微觀形態(tài)學(xué)鑒定 根據(jù)發(fā)酵性能篩選出的優(yōu)勢(shì)乳酸菌和酵母菌進(jìn)行增菌處理，吸取1 mL菌液于1.5 mL離心管中，以3 500 r·min-1離心3 min， 用生理鹽水沖洗2～3遍并再次離心，最后用2.5%的戊二醛進(jìn)行固定，于浙江大學(xué)測(cè)試中心進(jìn)行掃描電鏡和透射電鏡成像。

1.3.4 發(fā)酵菌分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)發(fā)酵性能篩選出的優(yōu)勢(shì)乳酸菌和酵母菌通過(guò)試劑盒進(jìn)行總DNA提取后，以細(xì)菌通用引物對(duì)乳酸菌進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增，其正向引物27f：5′-A G A G T T T G A T C C T G G C T C AG-3′；反向引物1492r：5′-A A G G A G G T G A T C C A G CC-3′。以真菌通用引物對(duì)酵母菌進(jìn)行18SrDNA擴(kuò)增，其正向引物 ITS1：5′-T C C G T A G G T G A A C C T G C GG-3′；反向引物ITS4：5′-T C C T C C G C T T A T T G A T A T GC-3′。

PCR擴(kuò)增體系：乳酸菌：2×EasyTaq PCR Super Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。酵母菌：2×EasyTaq PCR Super Mix 25 μL，上下游引物各2.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。

PCR擴(kuò)增條件：乳酸菌：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次；72℃終延伸20 min，4℃保溫。酵母菌：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)34次；72℃終延伸10 min，4℃保溫。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，測(cè)序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將菌株測(cè)定的序列提交至NCBI進(jìn)行 BLAST[16]比對(duì)，比對(duì)結(jié)果用MEGA 4軟件中的 Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定該菌株的分類地位。

1.3.6 發(fā)酵菌株的應(yīng)用 將篩選出的優(yōu)良菌株應(yīng)用到新鮮的芥菜中，測(cè)定發(fā)酵芥菜的理化指標(biāo)，并與自然發(fā)酵的芥菜作比較。

1.3.7 理化指標(biāo)測(cè)定

pH值：采用PHS-3C型pH計(jì)直接測(cè)定；

總酸：參考《GB/T 12456-2008食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定》測(cè)定[17]；

氨基酸態(tài)氮：參考《GB/T 5009.235-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》測(cè)定[18]；

亞硝酸鹽含量：采用南京建成生物工程研究所亞硝酸鹽測(cè)試盒測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，所有數(shù)據(jù)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行差異顯著性(P<0.05)分析，采用OriginPro 9.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌的分離

試驗(yàn)根據(jù)溶鈣圈大小共純化分離出11株乳酸菌，依次編號(hào)為L(zhǎng)1～L11。根據(jù)酵母菌菌落形態(tài)和菌落特征差異共分離純化出9株酵母菌，依次編號(hào)為Y1～Y9。

2.2 發(fā)酵菌的篩選

2.2.1 乳酸菌的篩選

2.2.1.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果 通常以600 nm波長(zhǎng)下的吸光度值變化來(lái)反映菌株的生長(zhǎng)和繁殖情況，在對(duì)11株乳酸菌進(jìn)行活化過(guò)程中，L11生長(zhǎng)較慢，故將其淘汰。剩下的10株乳酸菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。所有菌株均在 4 h 后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在2 h時(shí)，L8與L3、L9之間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。在14 h時(shí)L3、L8和L9菌體量較大，多數(shù)菌株均在16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，進(jìn)入穩(wěn)定期后的L3、L8和L9生長(zhǎng)繁殖速度與其他菌株相比較快，其中L9的生長(zhǎng)情況比L8略好，且在6、14以及16 h時(shí)，L9與L3、L8之間差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。L10的生長(zhǎng)繁殖速度較慢，菌體量較少，在24 h時(shí)的OD值僅為1.2。

圖1 各菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of each strain

2.2.1.2 產(chǎn)酸性能的測(cè)定結(jié)果 產(chǎn)酸能力決定著蔬菜發(fā)酵周期，也是評(píng)判菌種發(fā)酵活力的重要指標(biāo)[19]。每隔4 h測(cè)一次pH值，得到各菌株pH值隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，L8、L9產(chǎn)酸快，且產(chǎn)酸能力相近，尤其是在4～8 h時(shí)，L8、L9產(chǎn)酸速度明顯，pH值分別達(dá)到4.52、4.31；在12 h時(shí)，L3、L4產(chǎn)酸快，pH值分別達(dá)到4.32、4.31，L7和L10產(chǎn)酸慢，pH值分別達(dá)到4.76、4.70，且L3、L8、L9在8 h和12 h時(shí)，三者之間均達(dá)顯著性差異(P<0.05)；各菌株在培養(yǎng)24 h后，pH值均達(dá)到穩(wěn)定值，說(shuō)明各菌株均可使pH下降，但發(fā)酵液的最終pH值不同，按照由低到高順序排列為L(zhǎng)9(3.68)、L3(3.79)、L4(3.79)、L8(3.81)、L5(3.82)、L2(4.08)、L6(4.08)、L7(4.31)、L10(4.40)。

2.2.1.3 亞硝酸鹽降解率的測(cè)定結(jié)果 亞硝酸鹽含量是影響腌制菜品質(zhì)的重要因素，研究亞硝酸鹽降解能力高的乳酸菌對(duì)指導(dǎo)腌漬菜生產(chǎn)有重要意義[20]。由圖3可知，L8降解亞硝酸鹽的能力最強(qiáng)，降解率達(dá)到78.96%，其次是L9，降解率為76.72%，兩者之間差異不顯著(P>0.05)；再次是L1和L3，降解率分別為73.44%、74.41%，L8與L1、L3之間降解亞硝酸鹽的能力達(dá)到顯著水平(P<0.05)。L10降解率最低，僅為47.73%。

綜合圖1～3，根據(jù)各菌株的生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酸速度以及亞硝酸鹽降解率，最終從10株乳酸菌中確定L8、L9為本試驗(yàn)所篩選出的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。

2.2.2 酵母菌的篩選

2.2.2.1 產(chǎn)氣能力檢測(cè)結(jié)果 由于過(guò)多的氣體會(huì)使泡菜變軟[21]，影響泡菜的口感和質(zhì)地。根據(jù)表1可知，Y4、Y5以及Y7產(chǎn)氣能力較強(qiáng)，尤其是Y7，在28℃條件下發(fā)酵48 h，產(chǎn)氣量已充滿整個(gè)杜氏小管，而菌株Y1、Y2、Y3、Y6、Y8、Y9在72 h內(nèi)均不產(chǎn)氣，因此將這6株菌作為復(fù)篩的出發(fā)菌株。

2.2.2.2 蛋白酶活性檢測(cè)結(jié)果 具有蛋白酶活性的菌株在蔬菜發(fā)酵過(guò)程中對(duì)風(fēng)味形成有重要影響[22]，

表1 不同菌株杜氏小導(dǎo)管產(chǎn)氣效果Table 1 Gas production in the Durham tube of different strains

可以分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離氨基酸，游離氨基酸對(duì)食品的滋味貢獻(xiàn)較大。根據(jù)表2可知，Y1、Y2、Y6、Y9菌落周圍均出現(xiàn)了透明環(huán)，均具有蛋白酶活性，因此將這4株菌株作為下一步的復(fù)篩菌株。

表2 酵母菌蛋白酶活性檢測(cè)結(jié)果Table 2 Yeast protease activity test results

2.2.2.3 產(chǎn)酯檢測(cè)結(jié)果 酯類作為酵母發(fā)酵產(chǎn)物中主要的呈香物質(zhì)[11]，是香氣的來(lái)源，是評(píng)價(jià)酵母生香能力的重要指標(biāo)，在蔬菜發(fā)酵過(guò)程中對(duì)風(fēng)味有著有利的影響。由圖4可知，各菌株在培養(yǎng)48 h后，發(fā)酵液中Y9總酯含量最高，為0.386 3 g·100 mL-1，其次是Y1，總酯含量達(dá)到0.325 4 g·100 mL-1；Y2、Y6總酯含量相對(duì)較少，Y9菌株的總酯含量與Y1、Y2、Y6之間差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。表明Y9的產(chǎn)酯能力最強(qiáng)，適合發(fā)酵。

根據(jù)菌株的產(chǎn)氣能力、蛋白酶活性檢測(cè)以及產(chǎn)酯能力逐級(jí)篩選，最終從9株酵母菌中確定Y9為本試驗(yàn)所篩選出的優(yōu)勢(shì)酵母菌。

圖4 各菌株的產(chǎn)酯能力Fig.4 Ester production capacity of each strain

2.3 選取的發(fā)酵菌鑒定

2.3.1 宏觀形態(tài)學(xué)鑒定 將篩選確定的3株優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌L8、L9以及Y9在平板上培養(yǎng)，觀察其菌落特征，結(jié)果見(jiàn)表3和圖5。

表3 菌落形態(tài)特征描述Table 3 Description of colony morphology characteristics

圖5 菌株菌落形態(tài)Fig.5 Strain colony morphology

圖6 發(fā)酵菌株的電鏡成像Fig.6 Electron microscopy imaging of fermented strains

2.3.2 微觀形態(tài)學(xué)鑒定 將篩選的優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌L8、L9以及Y9進(jìn)行掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)和透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察，結(jié)果如圖6所示。綜合觀察發(fā)酵菌株的掃描電鏡和透射電鏡成像發(fā)現(xiàn)，L8、L9菌體均呈桿狀，可以對(duì)L8、L9進(jìn)行初步判斷，兩者可能均為乳桿菌，而Y9菌體呈卵圓形，為釀酒酵母菌的可能性較大。

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 菌株序列擴(kuò)增電泳圖如圖7所示。測(cè)序結(jié)果在NCBI基因序列庫(kù)通過(guò)BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，得到相似性為99%～100%的序列，從中隨機(jī)選取100%典型菌株的序列用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見(jiàn)圖8?？梢耘卸↙8為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、L9為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，Y9為釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)，這也與微觀形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相符合。

2.4 接菌對(duì)葉用芥菜發(fā)酵的影響

將篩選出的優(yōu)良菌株均按1.5%(種子液菌體濃度約為107CFU·mL-1)的接種量接種至葉用芥菜中，與自然發(fā)酵的葉用芥菜對(duì)比部分理化指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖9。pH值和總酸是評(píng)估發(fā)酵蔬菜成熟度的2個(gè)主要參數(shù)，大多數(shù)腌菜成熟時(shí)的pH值和總酸分別在3.2～4.2、0.6～2.4 g·100g-1范圍內(nèi)，這與我國(guó)成熟的發(fā)酵蔬菜特征相對(duì)應(yīng)[23]。由圖9-A、B可知，與自然發(fā)酵的葉用芥菜相比，接菌發(fā)酵降低了pH值、提高了總酸含量，在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)分別達(dá)到3.485、0.957 6 g·100g-1，且與自然發(fā)酵差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。食品中氨基酸的含量是感官呈味的一項(xiàng)重要指標(biāo)。由圖9-C可知，接菌發(fā)酵氨基酸態(tài)氮含量均高于自然發(fā)酵，氨基酸主要來(lái)源于腌制菜中蛋白質(zhì)分解，一定濃度的發(fā)酵菌種有利于蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生更多的游離氨基酸。亞硝酸鹽含量是評(píng)價(jià)發(fā)酵蔬菜和腌制蔬菜安全性的重要指標(biāo)。由圖9-D可知，發(fā)酵初期，自然發(fā)酵與接菌發(fā)酵的亞硝酸鹽含量均呈上升趨勢(shì)，并且均有亞硝酸鹽峰值的出現(xiàn)，但接菌發(fā)酵組的亞硝酸鹽峰值遠(yuǎn)低于自然發(fā)酵組，且接菌發(fā)酵與自然發(fā)酵兩者之間在發(fā)酵4、9及15 d時(shí)具有顯著性差異(P<0.05)。在發(fā)酵后期，接菌發(fā)酵的亞硝酸鹽含量?jī)H為0.22 mg·kg-1。

從自然發(fā)酵和接菌發(fā)酵兩組的理化指標(biāo)可以看出，接入優(yōu)良的發(fā)酵菌株可以提高腌制葉用芥菜的品質(zhì)和安全性。

3 討論

蔬菜的發(fā)酵主要是由附著在蔬菜中的微生物經(jīng)過(guò)一系列代謝活動(dòng)引起，有研究表明，乳酸菌可以改善產(chǎn)品風(fēng)味和質(zhì)地，提高消化率[24]，具有高耐酸性和益生菌特性[25]。同時(shí)在發(fā)酵蔬菜環(huán)境中存在著由蔬菜原料帶入的酵母菌，酵母菌在無(wú)氧環(huán)境下將糖類物質(zhì)分解為乙醇，可以抑制發(fā)酵環(huán)境中腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，還可以與發(fā)酵后期產(chǎn)生的有機(jī)酸發(fā)生酯化反應(yīng)生成芳香族化合物，增加發(fā)酵成品的芳香氣味。研究表明，乙醇含量過(guò)多，會(huì)消耗大量糖類，降低發(fā)酵蔬菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[26]，因此在蔬菜發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌的應(yīng)用通常沒(méi)有乳酸菌廣泛。蔬菜發(fā)酵過(guò)程中的部分理化指標(biāo)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)有重要作用，如氨基酸是發(fā)酵蔬菜重要的營(yíng)養(yǎng)成分，氨基酸含量的高低代表著發(fā)酵蔬菜營(yíng)養(yǎng)成分多少，且多種氨基酸會(huì)給發(fā)酵蔬菜提供豐富有層次感的鮮味和甜味[27]。亞硝酸鹽含量是評(píng)價(jià)發(fā)酵蔬菜和腌制蔬菜安全性的重要指標(biāo)[28]。食用亞硝酸鹽含量較高的發(fā)酵蔬菜可引起中毒或增加癌癥患病幾率，因此國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽含量有著嚴(yán)格的要求[14]。本研究中接菌發(fā)酵的理化指標(biāo)均優(yōu)于自然發(fā)酵，但對(duì)成品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味還有待進(jìn)一步研究。

利用形態(tài)和生理生化特征鑒定菌種的傳統(tǒng)方法耗時(shí)長(zhǎng)、過(guò)程繁瑣、不易確定菌種。本研究對(duì)目標(biāo)菌株乳酸菌L8、L9和酵母菌Y9進(jìn)行鑒定時(shí)，通過(guò)微觀形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，包括以核酸為基礎(chǔ)，結(jié)合PCR擴(kuò)增、凝膠電泳以及測(cè)序等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，充分顯示出鑒定方法的高效、快速及準(zhǔn)確性，加快了優(yōu)良發(fā)酵菌種的篩選進(jìn)程。

注：M為Maker。Note: M is Maker.圖7 發(fā)酵菌株擴(kuò)增電泳圖Fig.7 Amplification electrophoresis diagram of fermentation strains

在對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行篩選時(shí)，設(shè)置可靠靈敏的系統(tǒng)尤為重要，劉沁源等[29]、程凱森等[30]均通過(guò)可靠靈敏的系統(tǒng)篩選出優(yōu)良菌株。本試驗(yàn)篩選出2株發(fā)酵性能良好的乳酸菌，分別是L8短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、L9植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。陳荷鳳等[27]研究腌漬菜植物乳桿菌的分離鑒定特性發(fā)現(xiàn)，蔬菜在腌漬初期，產(chǎn)酸少繁殖快，以不耐酸的腸膜明串珠菌占優(yōu)勢(shì)，中后期主要轉(zhuǎn)為植物乳桿菌和短乳桿菌。本試驗(yàn)是從自然發(fā)酵的芥菜鹽水產(chǎn)品中篩選菌株，屬于發(fā)酵中后期，篩選的2株乳酸菌與陳荷鳳等的研究較為一致。根據(jù)逐級(jí)篩選，篩選出的1株酵母菌是Y9釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)，釀酒酵母菌常用于釀酒、制作面包以及餅干等[31]，其呈現(xiàn)風(fēng)味的主要物質(zhì)為酯類，可以為產(chǎn)品帶來(lái)良好的香氣，但在蔬菜發(fā)酵中應(yīng)用較少。本研究未利用誘變等手段對(duì)分離

圖8 發(fā)酵菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of fermenting bacteria

注：不同小寫字母表示同一發(fā)酵時(shí)間不同處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level between different treatments at the same fermentation time.圖9 兩組芥菜發(fā)酵過(guò)程中pH值(A)、總酸(B)、氨基酸態(tài)氮(C)、亞硝酸鹽(D)的變化Fig.9 Changes of pH value(A), total acid (B), amino acid nitrogen (C) and nitrite (D) during the fermentation of two groups of mustard

篩選出的發(fā)酵菌株進(jìn)行改良，因此對(duì)利用該菌種發(fā)酵提高發(fā)酵蔬菜的特征以及功能性成分尚有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)設(shè)置可靠靈敏的篩選系統(tǒng)，篩選出發(fā)酵性能優(yōu)良的3株菌種，即L8短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、L9植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)以及Y9釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)，其中，L8的亞硝酸鹽降解率最高，為78.96%，L9的生長(zhǎng)情況最好，但pH值最低，僅為3.68，Y9不產(chǎn)氣且具有蛋白酶活性，總酯含量達(dá)到0.386 3 g·100mL-1。將篩選出的3株優(yōu)良菌種應(yīng)用于葉用芥菜腌制發(fā)酵，與自然發(fā)酵相比，接菌發(fā)酵的pH值、亞硝酸鹽含量降低了2.22%和88.13%，總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量分別增加了9.02%和28.09%，提高了腌制葉用芥菜的營(yíng)養(yǎng)和安全性。本研究結(jié)果為發(fā)酵葉用芥菜的優(yōu)勢(shì)益生菌菌種選擇提供了新的來(lái)源，為今后工業(yè)化生產(chǎn)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。