劉慧春 周江華 張加強(qiáng) 許雯婷 朱開(kāi)元

(浙江省園林植物與花卉研究所，浙江 杭州 311251)

油用牡丹是原產(chǎn)于我國(guó)的一種優(yōu)良木本油料植物，其中鳳丹是江南地區(qū)油用牡丹的主栽品種，耐干旱、瘠薄、鹽堿，抗寒能力強(qiáng)，適應(yīng)范圍廣。2011年，牡丹籽油被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品，進(jìn)入食用油行列，其不飽和脂肪酸含量較高(83.05%～90.00%)，尤其是亞麻酸占不飽和脂肪酸含量高達(dá)31.56%～66.85%[1-2]，遠(yuǎn)高于目前市場(chǎng)上銷售的主要食用油。對(duì)油用牡丹的含油量進(jìn)行評(píng)價(jià)是發(fā)展油用牡丹產(chǎn)業(yè)的一項(xiàng)重要工作，而單粒選種是油料作物育種的重要環(huán)節(jié)，特別是對(duì)于育種資源有限的子代，因此建立無(wú)損檢測(cè)方法尤為重要。用傳統(tǒng)的化學(xué)方法測(cè)定含油量不僅需要破壞種子，而且過(guò)程十分繁瑣，需要經(jīng)過(guò)去皮、粉碎、萃取等一系列操作流程，耗時(shí)且耗材[3]。近紅外光譜分析技術(shù)(near infrared reflectance spectroscopy, NIRS)是1980年代后期發(fā)展起來(lái)的一種高效、快速、低成本、無(wú)損傷的現(xiàn)代測(cè)試技術(shù)[4-6]，該方法已被廣泛應(yīng)用于玉米(Zeamays)[7]、油菜(Brasscicacampestris)[8-11]、橄欖(Canariumalbum)[12]、羽衣甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.acephala)[13]、水稻(Oryzasativa)[14]及其他油料作物[15-18]的含油量、油料品質(zhì)等各項(xiàng)油料指標(biāo)的測(cè)定。崔虎亮[19]首次采用NIRS技術(shù)測(cè)定紫斑牡丹種子主要脂肪酸成分，取得了較好的效果，但種子含油量建模效果不佳，主要原因可能是未找到適合的光譜采集適配器。因此油用牡丹種子含油量的無(wú)損檢測(cè)方法有待繼續(xù)研究和完善，同時(shí)關(guān)于油用牡丹鳳丹種子含油量NIRS數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建迄今鮮有報(bào)道。

本研究利用近紅外光譜掃描技術(shù)，獲得油用牡丹鳳丹種子的光譜數(shù)據(jù)，結(jié)合傳統(tǒng)的化學(xué)測(cè)定結(jié)果，建立NIRS技術(shù)定量分析鳳丹種子單粒含油量的數(shù)學(xué)模型，旨在為油用牡丹種子高含油量品種的育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油用牡丹種子樣品分別采集自浙江省園林植物與花卉研究所牡丹基地(臨浦)、浙江省金華市浦江縣檀溪鎮(zhèn)大元村油用牡丹基地、浙江省金華市磐安縣大盤鎮(zhèn)下寮村油用牡丹示范基地，采集樣品數(shù)量分別為100(臨浦)、50(浦江)、50份(磐安)，為江南油用牡丹隔離種植的不同株系。

1.2 儀器與試劑

恒溫烘箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DHG-9023A)、 定性濾紙(杭州富陽(yáng)北木漿紙有限公司，直徑9 cm 中速)、干燥器(江蘇華鷗玻璃有限公司，240#，含硅膠BS-2101)、研缽(洛陽(yáng)伊耐陶瓷科技有限公司，130 mm)、分析天平[梅特勒托利多科技(中國(guó))有限公司，上海，AB204N]、實(shí)驗(yàn)用粉碎機(jī)(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，JXFSTPRP-48)、電熱恒溫水浴鍋(常州越新儀器制造有限公司，HH-4)、近紅外光譜儀(ThermoFisher Scientific，美國(guó)，Antaris Ⅱ)、索氏抽提器(杭州菲躍儀器有限公司，F(xiàn)Y-SXT-04)、氣相色譜儀(ThermoFisher Scientific, 美國(guó)，TRACE 1300)。

石油醚(30～60℃)(常州市中超化工有限公司，分析純)、甲醇(蘇州嘉鼎化學(xué)科技有限公司，分析純)、氫氧化鉀(常州市啟迪化工有限公司，分析純)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 含油量的化學(xué)測(cè)定方法 化學(xué)測(cè)定法采用索氏抽提法，按《GB/T 5009.3-3006食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》[20]進(jìn)行測(cè)定。選取成熟度、飽滿度一致的牡丹種子4粒，用實(shí)驗(yàn)用粉碎機(jī)將其磨碎，放入疊好且烘干至恒重的濾紙袋(m1)中，于恒溫烘箱中烘干，直至種子重量不再變化，放于干燥器中待其冷卻至室溫，稱重(m2)。含料濾紙袋堆疊整齊，置入索氏抽提器的抽提筒中，在抽提筒中加入石油醚，直至沒(méi)過(guò)濾紙袋?？刂瞥樘釡囟仁固崛∫好?～10 min回流一次。樣品抽提時(shí)間控制在20 h左右。提取結(jié)束時(shí)取1 mL提取液，用甲醇?xì)溲趸浿笊蠚庀嗌V檢測(cè)，若無(wú)明顯脂肪酸成分檢出，即抽提完全。將抽提后的濾紙包放于通風(fēng)櫥吹風(fēng)晾干，待紙包上的抽提液揮發(fā)完畢，再恒溫干燥至恒重，將其放置于干燥器中冷卻至室溫，稱量(m3)。每個(gè)樣品做3次重復(fù)，取平均值為籽粒平均含油量。

含油量=(m3-m1)/(m2-m1)×100%。

為確定烘焙時(shí)間和抽提時(shí)間，首先選用樣品數(shù)量比較多的PJ15和PJ16 2個(gè)品種進(jìn)行條件優(yōu)化試驗(yàn)，分別采用簡(jiǎn)單手工破碎和機(jī)械均勻粉碎的方法測(cè)定烘焙所用時(shí)間，然后用氣相色譜法測(cè)定脂肪酸殘余確定抽提所用時(shí)間。確定烘焙條件和抽提時(shí)間后，其余樣品按優(yōu)化后的條件進(jìn)行測(cè)定。樣品烘焙至恒重所需時(shí)間作為烘焙時(shí)間，即烘焙的樣品每隔半小時(shí)稱重一次，直至前后兩次重量變化在0.5%以內(nèi)。

1.3.2 近紅外光譜數(shù)據(jù)的采集 利用近紅外光譜儀，設(shè)置儀器工作參數(shù)，光譜區(qū)間掃描范圍為4 000～10 000 波數(shù)(cm-1)，掃描次數(shù)為16，分辨率為8 cm-1。試驗(yàn)中選擇與含油量分析中大小色澤等外觀均勻一致的種子，采用漫反射掃描，對(duì)種子的正反面各掃描一次。利用儀器自帶的軟件采集光譜，利用TQ Analyst軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和模型構(gòu)建。儀器開(kāi)機(jī)前檢測(cè)儀器內(nèi)干燥劑為藍(lán)色。每個(gè)樣品取3粒種子正反掃描共6條光譜數(shù)據(jù)，取這6個(gè)光譜數(shù)據(jù)的平均數(shù)得到平均光譜，同時(shí)得到波長(zhǎng)數(shù)據(jù)，保存數(shù)據(jù)后待分析。

1.3.3 NIRS數(shù)學(xué)模型的建立 分別采用偏最小二乘法(partial least squares，PLS)和主成分回歸法(principal component regression， PCR)進(jìn)行模型的構(gòu)建。為消除背景噪聲影響，使用各種光譜預(yù)處理方法優(yōu)化模型，包括多元信號(hào)矯正(multi signal correction, MSC)、標(biāo)準(zhǔn)正則變換(standard normal variation, SNV)、一階導(dǎo)數(shù)(1st)以及多種方法結(jié)合。模型的預(yù)測(cè)精度和穩(wěn)健性采用校正相關(guān)系數(shù)r1、預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)r2、校正均方根誤差(root mean square error of calibration, RMSEC)和預(yù)測(cè)均方根誤差(root mean square error of predication, RMSEP)進(jìn)行評(píng)價(jià)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 干燥烘焙時(shí)間的確定

含油量分析前首先需要去除種子的水分。由于牡丹種子的種皮和胚比較致密，胚粉碎方式與烘干至恒重所需時(shí)間密切相關(guān)。本研究采用2種粉碎方式手動(dòng)破碎(錘子敲破)和粉碎機(jī)均勻粉碎，結(jié)果如圖1所示。手動(dòng)破碎需要105℃烘焙10 h以上，品種PJ15和品種PJ16烘干至10 h時(shí)與烘干8 h相比，仍然有明顯的重量變化，分別降低1.80%和1.69%，尚未達(dá)到烘干至恒重的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。PJ15和PJ16采用粉碎機(jī)粉碎(PJ15C和PJ16C)，烘干2 h的重量比烘干1.5 h分別降低0.04%和0.07%，重量變化已達(dá)到恒重的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 5009.3-2006食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》[22]。說(shuō)明粉碎機(jī)均勻粉碎只需要1 h烘焙即可到達(dá)恒重。為保證不同品種牡丹種子均能被完全烘干，本試驗(yàn)延長(zhǎng)1 h烘焙時(shí)間，據(jù)此確定粉碎機(jī)粉碎后105℃烘焙2 h為牡丹籽烘干條件。

2.2 牡丹籽抽提時(shí)間的確定

為了確定索氏抽提器中回流抽提的時(shí)間，比較回流液中1和18 h氣相色譜分析獲得的脂肪酸峰面積(圖2)。1 h時(shí)的峰面積為86.58，18 h時(shí)峰面積為2.54，空白溶劑的峰面積為2.33，18 h回流液已經(jīng)與空白溶解的峰面積相當(dāng)，因此認(rèn)為抽提已完成。即抽提18 h以上可以達(dá)到抽提完全的效果，試驗(yàn)中選用抽提20 h。

注：PJ15和PJ16表示2個(gè)牡丹籽品種采用錘子敲破的方法手工破碎，PJ15C和PJ16C表示這2個(gè)品種采用粉碎機(jī)均勻粉碎。Note: The hammer was used to break the peony seeds of PJ15 and PJ16, and PJ15C and PJ16C were uniformly crushed by the pulverizer.圖1 牡丹種子重量隨烘焙時(shí)間變化曲線Fig.1 Variation curve of peony seed weight with baking time

圖2 抽提1和18 h回流液中脂肪酸成分氣相色譜峰面積比較Fig.2 Comparison of gas chromatographic peak areas of fatty acids in refluxes extracted for 1 and 18 h

2.3 油用牡丹種子含油量的分布

將上述破碎烘干處理后的200份樣品經(jīng)化學(xué)方法測(cè)定，得到牡丹種子含油量的樣品次數(shù)分布圖(圖3)。結(jié)果表明，樣品分布次數(shù)屬于正態(tài)分布類型。含油量在10%～28%之間，大部分樣品的含油量集中在18%～24%之間，極少數(shù)分布在10%～12%和26%～28%這兩個(gè)范圍，沒(méi)有低于10%或高于28%的樣品。

采用化學(xué)方法測(cè)得的數(shù)據(jù)顯示，本試驗(yàn)采集的樣品基本覆蓋了油用牡丹鳳丹種子含油量的變化范圍，具有較好的代表性。

圖3 化學(xué)方法測(cè)定單粒含油量的分布圖Fig.3 Distribution map of single oil content determined by chemical method

2.4 NIRS數(shù)學(xué)模型的建立

2.4.1 油用牡丹種子單粒含油量NIRS模型的建立及內(nèi)部交叉檢驗(yàn) NIRS數(shù)學(xué)模型的建立是采用近紅外檢測(cè)儀將樣品的光譜掃描數(shù)據(jù)和化學(xué)方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，主要采用內(nèi)部交叉檢驗(yàn)法和外部檢驗(yàn)法。內(nèi)部交叉檢驗(yàn)以檢驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)為參考，相關(guān)系數(shù)越接近1可靠性越高。模型的構(gòu)建采用PLS和PCR兩種方法，由表1可知，采用PLS模型，標(biāo)準(zhǔn)曲線校正相關(guān)系數(shù)在0.726 8～0.980 1之間；采用PCR模型，校正相關(guān)系數(shù)在0.726 6～0.948 4之間，因此PLS模型比PCR模型更適用。光譜數(shù)據(jù)采用一階導(dǎo)數(shù)處理時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線校正相關(guān)系數(shù)在0.970 3～0.980 1之間；采用二階導(dǎo)數(shù)處理時(shí)，校正相關(guān)系數(shù)在0.756 2～0.974 8之間，揭示光譜數(shù)據(jù)采用一階導(dǎo)數(shù)處理比二階導(dǎo)數(shù)處理更好。光譜數(shù)據(jù)采用Norris平滑，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)最高可到0.980 1；而采用Savitzky-Golay平滑，最高相關(guān)系數(shù)為0.978 5，可見(jiàn)Norris平滑比Savitzky-Golay平滑更適用。光程采用固定或隨機(jī)，相關(guān)系數(shù)無(wú)差異，因此光程參數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)分析的影響不大。

比較不同模型和參數(shù)后，確定模型建立最佳參數(shù)為：采用最小偏二乘法(PLS)，光程固定，一階導(dǎo)數(shù)消除背景，數(shù)據(jù)平滑處理采用Norris derivative filter的方法，平滑參數(shù)選用5和3(平滑參數(shù)選用5和2能得到相同效果，但5和3為系統(tǒng)默認(rèn)的平滑參數(shù))。模型的預(yù)測(cè)精度和穩(wěn)健性采用校正相關(guān)系數(shù)r1、預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)r2、校正均方根誤差(RMSEC)和預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)這4個(gè)參數(shù)分別為0.980 1、0.957 6、0.463和0.705，均為參數(shù)優(yōu)化后的最優(yōu)值。其中校正相關(guān)系數(shù)是首要決定參數(shù)，揭示標(biāo)準(zhǔn)樣品和光譜曲線的相關(guān)性，越接近1表示相關(guān)性越好，光譜預(yù)測(cè)樣品的準(zhǔn)確性越高。

圖4顯示了牡丹籽單粒含油量最佳近紅外預(yù)測(cè)模型，可以看出，多數(shù)樣品都沿標(biāo)準(zhǔn)曲線分布，離散點(diǎn)較少，校正相關(guān)系數(shù)0.980 1，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)0.957 6(圖4-A)。圖4-B顯示了每個(gè)樣品預(yù)測(cè)值和實(shí)際值的偏差，可見(jiàn)多數(shù)樣品的含油量預(yù)測(cè)偏差在±1%以內(nèi)，少數(shù)偏差在1～2%之間。含油量預(yù)測(cè)偏差在±1%以內(nèi)，在品種高通量篩選中具有很好的應(yīng)用價(jià)值，為F2代高世代單粒選種提供了快捷有效的方法。由此可見(jiàn)，內(nèi)部檢驗(yàn)的預(yù)測(cè)值與化學(xué)測(cè)定值的吻合性較好，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確，也說(shuō)明化學(xué)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度較高。

表1 油用牡丹種子單粒含油量的NIRS模型參數(shù)Table 1 NIRS model parameters of oil content in single seed of oil peony

2.4.2 NIRS模型的外部檢驗(yàn) 隨機(jī)抽取其中52份樣品，采用圖4的模型進(jìn)行外部檢驗(yàn)，NIRS預(yù)測(cè)值與化學(xué)方法測(cè)定值比較結(jié)果見(jiàn)表2。數(shù)據(jù)顯示，化學(xué)法測(cè)定得到的含油量最大值為23.94%，預(yù)測(cè)含油量最大值為23.74%；化學(xué)法得到的含油量平均值為20.48%，預(yù)測(cè)平均值為20.46%，兩者的擬合性均較好，預(yù)測(cè)值和測(cè)定值相關(guān)系數(shù)達(dá)0.957 6，平均誤差小于3%。由此說(shuō)明，本試驗(yàn)所構(gòu)建的牡丹種子單粒含油量的NIRS模型可靠，可以用于分析油用牡丹種子的單粒含油量。

3 討論

與傳統(tǒng)的化學(xué)方法相比，近紅外測(cè)試方法表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，如簡(jiǎn)便、迅捷、無(wú)污染，特別對(duì)測(cè)試樣品無(wú)損傷，有助于單粒選種，在一定程度上解決了雜交低世代品質(zhì)育種的測(cè)樣問(wèn)題，對(duì)于育種資源有限的種子后代非常重要。此外，建立準(zhǔn)確的數(shù)學(xué)模型，對(duì)于樣品的分析和篩選至關(guān)重要。對(duì)于初次建模的樣品，需要參考化學(xué)測(cè)定結(jié)果，所以化學(xué)測(cè)定值的準(zhǔn)確性直接影響NIRS模型的精確度和使用效果[23]。油用牡丹種子比油菜、大豆等油料種子大，且外種皮偏硬。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，去除種皮可以提高NIRS建模效果[24-27]。但去除種皮費(fèi)工費(fèi)時(shí)，因此本研究對(duì)索氏抽提法進(jìn)行了改進(jìn)，省略單粒去皮步驟，利用粉碎機(jī)將油用牡丹種子進(jìn)行充分粉碎，并烘干水分后再進(jìn)行抽提，測(cè)得的單粒含油量化學(xué)值與NIRS預(yù)測(cè)值擬合度較高(0.980 1)， 說(shuō)明本研究改進(jìn)的索氏抽提法可行。另外，在保證樣品具有代表性、化學(xué)值準(zhǔn)確的基礎(chǔ)上，選擇最佳的NIRS數(shù)學(xué)模型參數(shù)也很關(guān)鍵[27]。本研究結(jié)果表明，采用PLS模型，光譜數(shù)據(jù)采用一階導(dǎo)數(shù)，平滑方式選用Norris derivative filter的方法，平滑參數(shù)選用5和3，用這一套參數(shù)構(gòu)建的油用牡丹單粒含油量NIRS模型效果最佳。

表2 化學(xué)法與NIRS預(yù)測(cè)值數(shù)據(jù)表Table 2 Chemical method and NIRS prediction data sheet

圖4 牡丹籽含油量近紅外預(yù)測(cè)模型Fig.4 Near infrared model of oil content of peony

本研究所選用的測(cè)試樣品涵蓋了整個(gè)江南地區(qū)的油用牡丹種質(zhì)資源，取材范圍較廣，具有較好的代表性。按《GB/T 5009.3-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》[20]，運(yùn)用化學(xué)測(cè)定法測(cè)定樣品單粒種子的含油量，并建立相應(yīng)的NIRS數(shù)學(xué)模型，再用該模型獲得的預(yù)測(cè)值與化學(xué)方法獲得的測(cè)定值進(jìn)行比較，其內(nèi)部交叉檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)和外部檢驗(yàn)相關(guān)系數(shù)都高于0.9，校正均方根誤差和預(yù)測(cè)均方根誤差均小于1。說(shuō)明本研究建立的單粒NIRS模型精確度很高，所構(gòu)建的模型具有較好的預(yù)測(cè)能力，能夠代替常規(guī)且繁瑣的化學(xué)測(cè)試法，快速、準(zhǔn)確且無(wú)損傷地預(yù)測(cè)油用牡丹單粒種子的含油量，對(duì)高含油量的優(yōu)良種質(zhì)資源篩選具有重大意義。但由于模型具有較強(qiáng)的地域性，如果所分析的樣品超出了建模時(shí)的標(biāo)樣范圍，需在模型中加入該樣品的標(biāo)樣，否則其模型的準(zhǔn)確度會(huì)難以保證[28-31]。因此，本研究構(gòu)建的油用牡丹單粒種子含油量NIRS模型僅適用于江南地區(qū)，其他地區(qū)若使用該模型，需在該模型中加入其對(duì)應(yīng)地區(qū)的標(biāo)樣，以提高NIRS模型的精確度[32]。后續(xù)有望繼續(xù)擴(kuò)大取樣范圍，增加樣品數(shù)量，以提高NIRS模型的使用范圍和檢測(cè)效果。并進(jìn)一步開(kāi)展油用牡丹鳳丹籽油品質(zhì)方面的指標(biāo)檢測(cè)，建立油酸、亞麻酸、亞油酸等脂肪酸及蛋白質(zhì)成分的NIRS數(shù)學(xué)模型。

4 結(jié)論

本研究采用索氏抽提法測(cè)試了200份油用牡丹單粒種子的含油量，并應(yīng)用近紅外反射光譜(NIRS)技術(shù)采集了樣本的光譜數(shù)據(jù)，通過(guò)偏最小二乘法(PLS)構(gòu)建了油用牡丹種子單粒含油量的NIRS數(shù)學(xué)模型?；瘜W(xué)法測(cè)出的籽油含量變化范圍在10%～28%之間，其分布圖基本符合正態(tài)分布。構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型經(jīng)內(nèi)部交叉檢驗(yàn)和外部檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)均在0.9以上，說(shuō)明本試驗(yàn)所構(gòu)建的NIRS模型可靠，可以用于分析油用牡丹單粒種子的含油量。