周煦，肖琳，陳增強(qiáng)，吳健豪，陶華，李克深

1 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科中心，廣東湛江 524001；2 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一，除了后天環(huán)境因素和獲得性疾病，遺傳因素在癲癇的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［1］。相比于常染色體上的基因突變，X 連鎖遺傳性癲癇相對復(fù)雜，常為癲癇性腦病或癲癇綜合征，其表現(xiàn)形式多樣，可能與遺傳機(jī)制的多樣性相關(guān)，涉及基因突變、甲基化、X 染色體隨機(jī)失活以及嵌合體等［2-3］。近年來，X 連鎖遺傳性癲癇逐漸受到關(guān)注，探明其分子機(jī)制有助于拓展癲癇的病理機(jī)制。表觀遺傳指DNA 序列不發(fā)生變化，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變。DNA 甲基化是表觀遺傳的表現(xiàn)形式之一，在基因啟動子及其鄰近外顯子區(qū)域的CpG 島甲基化異常增高，可抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默，反之可導(dǎo)致基因表達(dá)異常增強(qiáng)，從而參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程［4-5］。與經(jīng)典遺傳學(xué)的基因突變相比，DNA 甲基化和去甲基化可在后天根據(jù)生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)需要而轉(zhuǎn)換，且這種改變在發(fā)育和細(xì)胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞，非常有利于研究遺傳和環(huán)境交互影響性疾病，并成為癲癇病理機(jī)制研究的重要方向之一［6］。近年來，有學(xué)者根據(jù)癲癇性腦病患者全外顯子測序鑒定新發(fā)突變并對其進(jìn)行功能分析，篩選出一系列癲癇致病基因，其中可見多個X 連鎖基因，CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19 和WDR45［7］?？紤]到顳葉癲癇是難治性癲癇的主要來源，而癲癇性腦病相關(guān)致病基因可能成為其機(jī)制研究的突破口，故本研究以上述6 個癲癇相關(guān)X 連鎖基因?yàn)榛A(chǔ)，系統(tǒng)評估這些基因在顳葉癲癇患者中是否受到DNA 甲基化調(diào)控，旨在為顳葉癲癇的診治提供新線索。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院診治的顳葉癲癇患者38 例（癲癇組），男18 例、女20 例，年齡（32.1 ± 14.4）歲，發(fā)病年齡（23.3 ± 16.2）歲，病程（8.8 ± 9.8）年。根據(jù)2010 年國際抗癲癇聯(lián)盟制定的標(biāo)準(zhǔn)［8］，評估患者的抗癲癇藥物反應(yīng)，耐藥14例、敏感24例。另收集同期我院健康對照38例作為對照組，男19 例、女19 例，年齡（33.4±6.4）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究獲廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象已獲得知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：DNA 抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技公司），EZ DNA 甲基化試劑盒（美國CA 公司），HotStart Taq DNA 聚合酶（大連寶生物工程有限公司）。主要儀器：ABI 2720 PCR 擴(kuò)增儀（美國ABI 公司），Eppendorf 5810R 離心機(jī)（德國漢堡公司），Agilent 2100 生物分析儀（美國安捷倫公司），cBot Cluster測序平臺、高通量測序儀（美國Illumina公司）。

1.3 X 連鎖基因CpG 島的分布情況評估與提取評估X 連鎖基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 啟動子區(qū)及其鄰近第一外顯子區(qū)（-2 kb～1 kb）CpG 島的分布情況，具體參數(shù)：觀察/預(yù)測比值＞0.60，長度＞200 bp，C+G 比例＞50%?；谌祟惢蚪MGRCh37/hg19 版本（CBI37/hg19），提取CpG島所在區(qū)域的DNA片段。

1.4 X 連鎖基因CpG 島擴(kuò)增引物序列的設(shè)計(jì) 委托上海天昊生物科技有限公司，利用其內(nèi)部軟件設(shè)計(jì)，獲得可在同一體系能夠?qū)χ貋喠蛩猁}處理后的目的片段進(jìn)行多重擴(kuò)增的特異性引物19對；基于各個基因CpG 島數(shù)量和序列長度不同，所需引物不完全相同（見表1）；根據(jù)引物長度和GC 含量等特性，利用該公司內(nèi)部軟件模擬優(yōu)化各條引物在同一體系的配置濃度，以達(dá)到體系反應(yīng)的高效率和產(chǎn)物的特異性。

表1 X連鎖基因CpG島擴(kuò)增引物序列

1.5 X連鎖基因CpG島的甲基化檢測 采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化技術(shù)，由上海天昊生物科技有限公司提供技術(shù)支持。收集受試者外周靜脈血3 mL，使用DNA抽提試劑盒和Eppendorf 5810R 離心機(jī)提取DNA。使用EZ DNA甲基化試劑盒，將未甲基化的堿基C轉(zhuǎn)化為U。利用HotStar Taq聚合酶，以重亞硫酸鹽處理后的DNA 為模板，通過ABI2720 PCR 擴(kuò)增儀和特異性引物混合液擴(kuò)增目的片段。使用TIANGEN 凝膠回收試劑盒，分離并提取擴(kuò)增產(chǎn)物。用帶有Index序列的引物，向文庫末端引入與Illumina 平臺兼容的特異性標(biāo)簽序列。獲得帶標(biāo)簽的文庫后，利用Illumina cBot Cluster 平臺和Illumina 高通量測序儀，以2×150 bp 的雙端測序模式進(jìn)行高通量測序。以Agilent 2100 生物分析儀進(jìn)行質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)處理，獲得等位基因C 和等位基因C+U 的讀數(shù)，二者比值×100%即為X 連鎖基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45的DNA甲基化率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)結(jié)果以-x±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組X 連鎖基因DNA 甲基化率比較 癲癇組和 對 照 組X 連 鎖 基 因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 基因甲基化率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 兩組X連鎖基因DNA甲基化率比較（%，±s）

表2 兩組X連鎖基因DNA甲基化率比較（%，±s）

組別癲癇組對照組P n 3838 CASK 19.88±14.1712.82±14.110.033 CDKL522.64±7.0318.93±7.080.025 IQSEC24.25±2.693.42±3.120.217 MECP218.76±12.8911.84±12.270.019 PCDH1930.75±14.6924.97±13.570.079 WDR4532.29±9.3827.21±8.650.016

2.2 不同基線特征的顳葉癲癇患者X 連鎖基因DNA 甲基化率比較 男性X 連鎖基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 甲基化率均低于女性（P均＜0.05），不同年齡、發(fā)病年齡、病程、抗癲癇藥物反應(yīng)患者X 連鎖基因甲基化率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表3。

表3 不同基線特征的顳葉癲癇患者X連鎖基因DNA甲基化率比較（%，±s）

表3 不同基線特征的顳葉癲癇患者X連鎖基因DNA甲基化率比較（%，±s）

基線特征性別男女OR P入組年齡＜26歲≥26歲OR P發(fā)病年齡＜18歲≥18歲OR P病程＜5年≥5年OR P抗癲癇藥物反應(yīng)敏感耐藥OR P n 18201919191919192414 CASK 6.73±8.3731.72±4.170.210.00019.49±14.1420.27±14.580.960.86720.89±13.2518.87±15.331.110.66716.51±14.1423.25±13.750.710.14517.82±14.4321.08±14.190.850.501 CDKL516.39±4.8028.26±2.310.580.00022.52±6.8022.76±7.430.990.91923.05±6.5722.23±7.621.040.72221.47±7.3323.81±6.710.900.31221.26±6.7423.44±7.200.910.362 IQSEC21.92±1.506.35±1.530.300.0003.97±2.424.54±2.980.870.5194.44±2.674.07±2.781.090.6823.59±2.454.92±2.820.730.1303.52±2.264.68±2.870.750.202 MECP27.01±8.8229.33±2.350.240.00018.66±12.9818.86±13.160.990.96319.88±12.3217.64±13.681.130.60115.88±13.1821.63±12.270.930.17216.80±13.4619.90±12.700.840.482 PCDH1917.32±9.7942.83±3.140.400.00030.06±15.1031.43±14.650.960.77931.72±14.1929.77±15.501.070.68827.53±14.7733.96±14.270.810.18028.51±14.6532.05±14.860.890.482 WDR4523.52±6.0540.14±1.220.590.00032.23±9.3832.35±9.641.000.96833.32±9.2431.26±9.651.070.50730.10±9.1834.48±9.300.870.15231.35±10.3132.83±8.980.950.645

2.3 不同性別健康對照人群X 連鎖基因DNA 甲基化率比較 在健康對照人群中，男性X 連鎖基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45甲基化率均低于女性（P均＜0.05）。見表4。

表4 男性和女性對照X連鎖基因DNA甲基化率比較（%，±s）

表4 男性和女性對照X連鎖基因DNA甲基化率比較（%，±s）

性別男女P n 1919 CASK 3.27± 1.1822.37±14.670.000 CDKL514.44±0.7823.43±7.740.0000 IQSEC21.55±0.255.29±3.550.000 MECP23.51± 0.5820.17±12.760.000 PCDH1915.64± 2.4034.31±13.740.000 WDR4521.39±0.4533.03±9.060.000

3 討論

盡管新型抗癲癇藥物被陸續(xù)應(yīng)用于臨床，大多數(shù)患者能夠得到有效控制，但是仍然有約30%癲癇患者發(fā)展為耐藥性癲癇［4］。一旦癲癇患者病情得不到有效控制，將嚴(yán)重影響其學(xué)習(xí)、生活和工作能力，并給所在家庭和社會造成嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。顳葉癲癇是成人癲癇最常見的發(fā)作類型，約有80%的顳葉癲癇患者抗癲癇藥物治療效果不佳，是耐藥性癲癇的最主要來源。因此，本研究以顳葉癲癇患者為研究對象，積極從新的角度探索其病理機(jī)制，對于整體改善癲癇患者診治水平具有重要意義。

X 連鎖遺傳性癲癇常見頻繁的癇性發(fā)作，發(fā)作間期大量放電，常伴有認(rèn)知和精神行為改變，病理改變包括突觸異常新生、神經(jīng)元遷移和分化障礙、神經(jīng)遞質(zhì)合成和釋放障礙、膜受體結(jié)構(gòu)和功能障礙等［10］。X 連鎖致病基因及相關(guān)癲癇發(fā)作常呈早發(fā)性、難治性甚至災(zāi)難性，常表現(xiàn)為癲癇性腦病和癲癇綜合征。MECP2 是具有結(jié)合DNA 甲基化序列的核蛋白家族成員之一，具有抑制基因轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)效應(yīng)，其基因突變或缺失引起Rett 綜合征［11-12］。CDKL5 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其基因突變可導(dǎo)致新生兒在數(shù)周內(nèi)表現(xiàn)出耐藥性癲癇，在臨床上與X 連鎖West 綜合征和Rett 綜合征密切相關(guān)［13］。CASK 是鈣依賴絲氨酸蛋白激酶，在腦內(nèi)突觸區(qū)域富集，該蛋白基因編碼序列第21 外顯子區(qū)移碼突變c.1896dupC＜p.C633fs（*）2可導(dǎo)致患者自幼癲癇成簇發(fā)作，抗癲癇藥物難以有效控制［14］。IQSEC2是鳥嘌呤核苷酸交換因子，在興奮性神經(jīng)元突觸后膜上發(fā)揮作用，其基因功能缺失突變可導(dǎo)致X 連鎖智力障礙和早發(fā)性癲癇［15］。PCDH19 是主要表達(dá)于腦內(nèi)的鈣依賴細(xì)胞黏附蛋白，其基因突變表現(xiàn)為兒童起病的短暫而成簇的驚厥發(fā)作，伴有認(rèn)知損害和行為異常［16］。WDR45 是WD 重復(fù)片段蛋白家族成員之一，參與細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡和基因表達(dá)調(diào)控等生物學(xué)活動，多個位點(diǎn)基因突變可導(dǎo)致患者發(fā)育遲緩和癲癇發(fā)作［17］。本研究納入的6 個癲癇相關(guān)X 連鎖基因均已通過外顯子檢測，確認(rèn)其癲癇致病性，但是否存在其他遺傳調(diào)控機(jī)制參與尚不清楚。因此，本研究從DNA 甲基化角度，初步明確癲癇相關(guān)X 連鎖基因是否和顳葉癲癇表型相關(guān)，為顳葉癲癇病理機(jī)制研究提供新的突破口。

本研究系統(tǒng)評估了癲癇相關(guān)X連鎖基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 的DNA甲基化水平與顳葉癲癇表型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這些基因的DNA 甲基化率在癲癇組和對照組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示上述X 連鎖基因在顳葉癲癇中很可能不受DNA 甲基化的表觀遺傳調(diào)控。進(jìn)一步對不同基線特征的顳葉癲癇患者進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 的DNA甲基化率在女性患者中均顯著降低；而且在健康對照人群中，這些基因的DNA 甲基化率也有類似表現(xiàn)。這提示上述X 連鎖基因DNA 甲基化與性別密切相關(guān)。已有研究顯示，X 連鎖基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 在顳葉癲癇患者和正常人群中均未表現(xiàn)出性別相關(guān)的表達(dá)差異［18-19］，因此認(rèn)為，X 連鎖基因DNA 甲基化率在性別間的差異不會導(dǎo)致基因表達(dá)的差異，故而對疾病的表型應(yīng)該無影響。

實(shí)際上，X 連鎖基因在兩性間存在拷貝數(shù)差異：男性X 染色體只有1 個拷貝，女性X 染色有2 個拷貝，故而相對于常染色體基因，X 連鎖基因具有獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制，例如劑量補(bǔ)償和減數(shù)分裂性染色體沉默［20］，但是其具體機(jī)制尚未明了。本研究通過對顳葉癲癇患者和正常對照的亞組分析，推測女性患者X 連鎖基因相對較高的甲基化率，有助于女性患者X 染色體雙拷貝基因的代償性沉默，以維持其在兩性間相似的表達(dá)水平和生理功能，這為X 連鎖基因在兩性間的表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了新的線索。

綜上所述，X 連鎖基因在顳葉癲癇中很可能不受DNA 甲基化的表觀遺傳調(diào)控，但是X 連鎖基因DNA 甲基化率在女性患者和女性健康對照者中，分別較男性患者和男性健康對照者升高，這為DNA 甲基化參與女性X染色體沉默調(diào)控提供了線索。值得注意的是，細(xì)胞和組織的分化和功能實(shí)現(xiàn)與DNA 甲基化的調(diào)控密切相關(guān)，故而DNA 甲基化在一定程度上存在細(xì)胞和組織特異性［21］。而本研究基于外周血液樣本，缺乏腦組織樣本，相關(guān)結(jié)果未能在腦組織中驗(yàn)證；且因基于單中心、小樣本，相關(guān)結(jié)果是否具有廣泛適用性尚待驗(yàn)證。