劉躍輝，黎雨衫，劉海萍，陶春，張昕紅，塔娜，張東威

1 內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙 古通遼 028000；2 內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院；3 內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院

急性腦梗死是缺血性腦血管病主要致殘、致死的類型，腦動脈取栓能夠在最短的時(shí)間內(nèi)開通閉塞的動脈血管，降低腦組織損傷程度，是目前治療急性腦梗死最有效的措施。但大量研究顯示，缺血的腦組織再次恢復(fù)血流后，可導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷，其中細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要方式之一［1］。PTEN 是一種抑癌基因，近年來，關(guān)于PTEN 在腦缺血再灌注損傷過程中產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)已成為研究熱點(diǎn)。動物實(shí)驗(yàn)顯示，大鼠發(fā)生腦缺血再灌注損傷后，PTEN 被激活發(fā)生核轉(zhuǎn)位，PTEN mRNA 表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，加重缺血再灌注后腦組織的損傷程度［2］。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）、Akt 和糖原合酶激酶3β（GSK-3β）是PTEN 的3 個下游信號蛋白［3-4］，PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路在CIRI過程中發(fā)揮重要作用。PTEN 通過調(diào)控PI3K、Akt、GSK-3β蛋白，與腦缺血再灌注后腦組織損傷加重密切相關(guān)，當(dāng)PTEN 抑制或缺失，可以降低腦缺血再灌注損傷后誘發(fā)腦細(xì)胞凋亡和促進(jìn)缺血腦組織神經(jīng)保護(hù)作用［5］。故尋找抑制PTEN 的傳統(tǒng)藥物具有重要意義。蒙藥扎沖十三味丸（扎沖-13）是蒙醫(yī)治療腦梗死常用的方劑，由禹糧土、制草烏、制珍珠、沉香、訶子、煅磁石、石菖蒲、制珊瑚、木香、麝香、甘草、肉豆蔻、丁香共13 味蒙藥組成?，F(xiàn)代藥理研究顯示，扎沖-13 可以通過減少氧化應(yīng)激損傷、降低炎癥反應(yīng)、抑制腦細(xì)胞凋亡、改善微循環(huán)障礙、抗凝血等途徑，減輕局部腦缺血損傷［6］，但其治療機(jī)理尚未完全闡明。2017 年3 月—2019 年4 月，我們通過觀察扎沖-13 對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能損傷的改善作用，探討其作用機(jī)制與PTEN及PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級健康雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量（200 ± 20）g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物室，溫度（23±2）℃，相對濕度50%～60%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥品與試劑 扎沖-13（內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z15020409）；TRIpure、Super MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNase inhibitor 均購自北京BioTeke公司；全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、PTEN 抗體、Akt 抗體均購自沈陽萬類生物科技有限公司；PI3K 抗體、p-GSK-3β 抗體購自Proteintech公司；蘇木精購自北京索萊寶公司。

1.1.3 主要儀器 WD-9413B 型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一），超速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀），Elx808 型全自動酶標(biāo)儀（美國BioTek），NANO2000 紫外分光光度計(jì)（美國Thermo）；Exicycler96 熒光定量PCR 儀（韓國BIONEER），BX53顯微鏡（日本OLUMPUS）。1.2 動物分組與模型制作方法 將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、扎沖-13 高劑量組、扎沖-13 低劑量組各10 只。采用線栓法制作大腦中動脈閉塞（MCAO）模型。用10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，沿頸部正中右旁側(cè)切開，逐層分離，暴露右側(cè)頸總動脈，掛線備用。隨后于頸外和頸內(nèi)動脈掛線，分離露出頸外動脈主干，在其根部打結(jié)。用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈和頸總動脈近心端。在頸總動脈近頭端距分叉部5 mm 左右斜剪一小口，導(dǎo)入線栓進(jìn)入頸內(nèi)動脈。移除頸內(nèi)動脈上的動脈夾，將線栓插至所需深度，遇阻力即停。結(jié)扎切口處頸總動脈掛線，移開頸總動脈上的血管夾。確認(rèn)無出血后開始計(jì)時(shí)，缺血1 h后拔除線栓形成再灌注。假手術(shù)組不插入線栓，頸部手術(shù)及血管處理同模型組。

1.3 干預(yù)方法 根據(jù)人民衛(wèi)生出版社的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，大鼠劑量=人劑量×70 kg×0.018/200 g，計(jì)算出高劑量組給藥劑量為1.728 g/kg，低劑量組給藥劑量為0.432 g/kg。在缺血再灌注的同時(shí)，扎沖-13 高劑量組和低劑量組分別給予扎沖-13 藥液1.728、0.432 g/kg 灌胃，模型組與假手術(shù)組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)給藥7 d。

1.4 大鼠神經(jīng)功能缺失程度評估 大鼠缺血再灌注后72 h，采用longa 評分法對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評分。0 分：無任何神經(jīng)功能缺損的癥狀，活動正常；1 分：輕微神經(jīng)功能缺損，對側(cè)前肢保持屈曲狀態(tài)；2 分：中度神經(jīng)功能缺損，向?qū)?cè)爬行轉(zhuǎn)圈；3 分：重度神經(jīng)功能缺損，向偏癱側(cè)身體傾倒；4 分：無法自主行走，意識喪失；5 分，死亡。以1～4 分為造模成功。連續(xù)給藥7 d后再次評分。

1.5 腦組織PTEN mRNA 表達(dá)檢測 采用RT-PCR法。大鼠處死，取腦組織約20 mg，加入1.0 mL TRIzol提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)NANO2000測定各樣本中RNA 的濃度。將上述RNA 樣品逆轉(zhuǎn)錄，獲得相應(yīng)的cDNA，-20 ℃保存。以cDNA 為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。引物序列：PTEN 上游5＇-FAGACCATAACCCACCACAGC-3＇，下 游5＇-TACACCAGTCCGTCCTTTCC-3＇，產(chǎn) 物 長 度20 bp；βactin 上 游5＇-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3＇，下游5＇-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3＇，產(chǎn)物長度25 bp。反應(yīng)條件：95 ℃變性3 min，60 ℃退火/延伸30 s，循環(huán)40 次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算PTEN mRNA的相對表達(dá)量，每個樣品重復(fù)檢測3次。

1.6 腦組織PTEN 蛋白檢測 采用Western blotting法。取大鼠腦組織約20 mg，加入裂解液提取組織蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg 蛋白上樣，連接電泳裝置，電壓設(shè)為120 V 恒壓，1.5 h 后停止電泳。加入含5%脫脂奶粉的PBST 溶液室溫封閉2 h，加入封閉液稀釋的PTEN 抗體（稀釋比例1∶500），4 ℃孵育過夜。加入封閉液稀釋的二抗羊抗兔IgG-HRP（稀釋比例1∶5000），室溫孵育1 h。TBST 洗膜，ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影。使用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值，以PTEN 蛋白與β-actin的比值表示PTEN蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 腦組織PI3K/Akt 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法。取各組大鼠半邊腦組織，石蠟包埋，切片。常規(guī)切片脫蠟、乙醇梯度水化，PBS沖洗；加入3%甲醇雙氧水20 min，PBS 沖洗3 次，滴加抗原修復(fù)液Ⅰ，室溫反應(yīng)10 min，PBS 沖洗；滴加山羊血清封閉液，室溫反應(yīng)20 min；甩去多余液體，滴加IL-6 一抗（稀釋比例1∶80）、STAT3 一抗（稀釋比例1∶80），4 ℃過夜。次日室溫復(fù)溫后，PBS 漂洗，加入二抗，37 ℃避光孵育20 min。PBS 漂洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下以400 倍鏡頭觀察，棕色顆粒為陽性，采用MetaMorph 圖像分析軟件計(jì)算平均光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊用LSDt檢驗(yàn)，方差不齊則用Dunne＇t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分比較 見表1。造模后72 h及連續(xù)給藥7 d后，假手術(shù)組神經(jīng)功能缺失評分均為0。與假手術(shù)組比較，模型組、扎沖-13低劑量組和扎沖-13 高劑量組神經(jīng)功能缺失評分升高（P均＜0.01）；與模型組比較，扎沖-13 低劑量組和高劑量組評分降低（P＜0.05 或＜0.01），且高劑量組低于低劑量組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺失評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺失評分比較（分，±s）

注：與假手術(shù)組相同時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.01；與模型組相同時(shí)點(diǎn)比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與扎沖-13 低劑量組相同時(shí)點(diǎn)比較，▲P＜0.05；與同組術(shù)后72 h比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組扎沖-13低劑量組扎沖-13高劑量組n 10101010神經(jīng)功能缺失評分術(shù)后72 h 02.60±0.52*2.40±0.70*2.40±0.82*術(shù)后7 d 02.56±0.83*2.03±0.76*#△1.86±0.75*##▲△△

2.2 各組大鼠腦組織PTEN mRNA及蛋白表達(dá)量比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組腦組織PTEN mRNA 及蛋白表達(dá)量升高（P均＜0.01）；與模型組比較，扎沖-13 低劑量組和高劑量組PTEN mRNA 及蛋白表達(dá)量均降低，且扎沖-13 高劑量組PTEN mRNA及蛋白表達(dá)量低于低劑量組（P均＜0.01）。

表2 各組大鼠腦組織PTEN mRNA及蛋白表達(dá)量比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織PTEN mRNA及蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與扎沖-13低劑量組比較，▲P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組扎沖-13低劑量組扎沖-13高劑量組n 10101010 PTEN mRNA 1.00±0.065.52±0.39*4.00±0.18#2.77±0.18#▲PTEN蛋白0.16±0.020.84±0.26*0.72±0.36#0.54±0.33#▲

2.3 各組大鼠腦組織PI3K、Akt、p-GSK-3β 蛋白表達(dá)量比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組腦組織PI3K、Akt、p-GSK-3β 蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05 或＜0.01）；與模型組比較，扎沖-13 低劑量組Akt 蛋白表達(dá)量升高，扎沖-13 高劑量組PI3K、Akt、p-GSK-3β蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05 或＜0.01）；與扎沖-13 低劑量組比較，扎沖-13 高劑量組PI3K 表達(dá)量升高，Akt蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05或＜0.01）。

表3 各組大鼠腦組織PI3K、Akt、p-GSK-3β蛋白表達(dá)量比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織PI3K、Akt、p-GSK-3β蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與扎沖-13低劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組扎沖-13低劑量組扎沖-13高劑量組n 10101010 PI3K 0.0102±0.01320.0024±0.0001**0.0026±0.0008**0.0157±0.0180*##▲▲Akt 0.0309±0.02280.0049±0.0018*0.0700±0.0219##0.0287±0.0074##▲p-GSK-3β 0.0047±0.00030.0006±0.0005**0.0011±0.0005**0.0017±0.0001**#

3 討論

急性腦梗死是我國成年人致死和致殘的首位原因，嚴(yán)重威脅我國人口的健康并阻礙社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。腦梗死發(fā)生后，腦血流量減少導(dǎo)致能量障礙，細(xì)胞內(nèi)多種死亡、生存信號通路被激活，引起程序性細(xì)胞死亡。腦梗死的病理機(jī)制十分復(fù)雜，包括興奮性毒性、離子失衡、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)通過抗炎癥反應(yīng)、抑制血小板集聚、穩(wěn)定斑塊、溶栓及血管內(nèi)介入等方法治療AIS，雖然療效尚可，但藥物不良反應(yīng)及血管內(nèi)介入的風(fēng)險(xiǎn)較大，且價(jià)格昂貴。蒙醫(yī)藥治療急性腦梗死的歷史悠久且有較好的臨床療效。扎沖-13 是蒙醫(yī)常用的傳統(tǒng)方劑，長期臨床實(shí)踐顯示，其在治療缺血性腦血管疾病方面療效顯著，價(jià)格低廉，不良反應(yīng)相對較小，已被廣大北方蒙古族腦卒中患者接受。我們的前期研究顯示，扎沖-13能夠減輕腦梗死大鼠缺血部位腦細(xì)胞的水腫、縮小梗死面積，減輕大鼠神經(jīng)功能損傷程度；通過降低缺血腦組織中Bax 蛋白表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)，從而抑制腦細(xì)胞凋亡；通過降低缺血腦組織中白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子α蛋白表達(dá)水平，從而減輕炎癥反應(yīng)程度［7-8］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、扎沖-13低劑量組和扎沖-13高劑量組神經(jīng)功能缺失評分升高，表明模型大鼠符合實(shí)驗(yàn)要求，證實(shí)線栓法制作MCAO 模型成功；與模型組比較，扎沖-13低劑量組和扎沖-13高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺失評分均顯著降低，表明扎沖-13能夠減輕大鼠神經(jīng)功能損傷的程度。

PTEN 是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重特異性磷酸酶活性的高度保守的抑癌基因，其編碼蛋白可特異性使磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（PIP3）去磷酸化，拮抗PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路，干擾細(xì)胞生長信號而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為對細(xì)胞存活和增殖的負(fù)性調(diào)控作用［9］。PTEN 缺失可抑制缺血性腦損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡和促進(jìn)腦缺血動物的神經(jīng)保護(hù)作用［10］。NING 等［11］對腦缺血損傷大鼠采用短干擾RNA 技術(shù)下調(diào)PTEN 基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其對損傷的神經(jīng)元有明顯的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組PTEN mRNA 及蛋白表達(dá)量升高，表明腦缺血再灌注損傷上調(diào)PTEN 基因表達(dá)；與模型組比較，扎沖-13 高劑量組和低劑量組PTEN 蛋白表達(dá)量均降低，表明扎沖-13 可能通過調(diào)控PTEN mRNA，抑制PTEN 蛋白表達(dá)，對缺血再灌注損傷大鼠的腦細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路對調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞生長和增殖、主要蛋白質(zhì)的合成及糖代謝均有重要作用［12］。LIANG 等［13］報(bào)道，激活PI3K/Akt 信號通路對缺血再灌注損傷的腦組織有神經(jīng)保護(hù)作用；HAO 等［14］報(bào)道，PI3K/Akt信號通路對腦缺血細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用，該通路激活后可抑制腦缺血細(xì)胞凋亡。PI3K是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，PI3K被激活后，可促使Akt 活化。GSK-3β 為Akt 的下游蛋白，活化的Akt 通過直接或間接途徑激活GSK-3β，調(diào)節(jié)機(jī)體中細(xì)胞的生長、分化及遷移等［15］。HU等［16］報(bào)道，在急性腦缺血引起神經(jīng)元凋亡的過程中，GSK-3β 信號表達(dá)起著關(guān)鍵作用。多項(xiàng)研究顯示，Akt 激活可引起GSK-3β 磷酸化，抑制GSK-3β 表達(dá)，從而起到抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用［17-19］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組PI3K、Akt、p-GSK-3β蛋白表達(dá)量降低，表明缺血再灌注損傷后引起PTEN 基因表達(dá)上調(diào)，從而抑制PI3K、Akt、p-GSK-3β的表達(dá)；與模型組比較，扎沖-13 低劑量組Akt 蛋白表達(dá)量升高，扎沖-13 高劑量組PI3K、Akt、p-GSK-3β蛋白表達(dá)量升高，提示扎沖-13可能通過激活缺血性腦組織中PI3K/Akt/GSK-3β 信號通路，從而抑制神經(jīng)元凋亡。然而，本研究結(jié)果顯示，與扎沖-13 低劑量組比較，扎沖-13 高劑量組PI3K 表達(dá)量升高，而Akt 蛋白表達(dá)量卻相對下降，分析考慮扎沖-13 組成成分較多，化學(xué)成分復(fù)雜，隨著應(yīng)用藥物劑量增大，可能出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)。下一步我們將對這方面的結(jié)果繼續(xù)觀察。

綜上所述，對腦缺血再灌注損傷大鼠給予蒙藥扎沖-13 進(jìn)行干預(yù)，可降低其神經(jīng)功能缺失程度，其機(jī)制可能與抑制PTEN、激活PI3K/Akt/GSK3β 信號通路有關(guān)。