劉巖松，張潔，盧濤

北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

隨著全球人口老齡化的加劇，衰老相關(guān)疾病不斷增加。輕度認(rèn)知障礙（MCI）是正常認(rèn)知老化和癡呆之間的過渡階段，研究表明，患有MCI的老年人每年以10%～30% 的速度發(fā)展為阿爾茨海默癥（AD）［1］，并且約66.7%的AD 患者合并營養(yǎng)不良［3］。營養(yǎng)不良與老年期認(rèn)知障礙和衰退、阿爾茨海默病、輕度認(rèn)知障礙相關(guān)［3］。神經(jīng)退行性疾病所造成的認(rèn)知功能下降、生活能力缺失等癥狀對患者及其家庭造成嚴(yán)重困擾，由疾病繼發(fā)的營養(yǎng)不良狀況還可能導(dǎo)致疾病惡化。研究顯示，疾病相關(guān)營養(yǎng)不良癥狀（DRM）可導(dǎo)致抗氧化分子和線粒體耗氧量的減少［4］。DRM 者體內(nèi)炎癥因子和促氧化劑分子上升，破壞了線粒體功能，打破氧化劑—抗氧化劑平衡，細(xì)胞生物大分子經(jīng)歷嚴(yán)重的氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞活力下降［5-6］。光生物調(diào)節(jié)（PBM）是指紅光或近紅外光（波長600～1100 nm）在低劑量照射下，直接作用組織而引起的自我保護(hù)反應(yīng)。與醫(yī)療中常見的激光治療不同，PBM 不是一種燒蝕或熱機(jī)制，而是光被生物體吸收后產(chǎn)生的一種類似于植物光合作用的光化學(xué)效應(yīng)。目前PBM 的作用機(jī)制尚不清楚，可能與細(xì)胞色素C 氧化酶（CCO）有關(guān)。CCO 是電子傳遞鏈的末端酶，在光譜的紅色和近紅外區(qū)域中充當(dāng)光感受器和光信號傳感器，介導(dǎo)電子從細(xì)胞色素C 到分子氧的轉(zhuǎn)移［7］。PBM 通過增加電子傳遞鏈中復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性，從而改善線粒體功能，提高細(xì)胞活力。2021 年5 月—12 月，我們通過構(gòu)建人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞營養(yǎng)缺乏模型，觀察660 nm 波長紅光照射對細(xì)胞活力的調(diào)節(jié)作用，并探討PBM 對線粒體的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與光源 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心?？烧{(diào)直流穩(wěn)壓電源FPS-306D 購自于廣州市飛馬電器有限公司，光宏660 nm波長LED芯片、20 mm鋁基板購自深圳新星源光電有限公司。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清（FBS）、RPMI1640 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自以色列Biological Industries 公司；青—鏈霉素溶液、胰蛋白酶購自美國Gibco 公司；細(xì)胞增殖—毒性檢測試劑CCK-8、線粒體膜電位熒光探針（JC-1）、DCFH-DA 活性氧（ROS）熒光探針購自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma 公司；7-AAD 染色液購自美國Biolegend公司。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國NUAIRE），高速離心機(jī)（美國Thermo），長時(shí)程動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像及功能分析系統(tǒng)Incucyte S3（美國Essen Bioscience），流式細(xì)胞儀（美國BD），酶標(biāo)儀（美國BioTek）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取SH-SY5Y 細(xì)胞，加入含15%FBS、1%青—鏈霉素溶液的RPMI1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液1次，至細(xì)胞融合度約為90%時(shí)，按照1∶3 的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 營養(yǎng)缺乏細(xì)胞模型制備 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96 孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)液，將細(xì)胞隨機(jī)分為營養(yǎng)缺乏組和正常營養(yǎng)組，分別加入低營養(yǎng)培養(yǎng)基（RPMI 1640 培養(yǎng)基中加入終體積5% FBS 和1%青—鏈霉素溶液）、正常培養(yǎng)基（RPMI 1640 培養(yǎng)基中加入終體積15% FBS和1%青—鏈霉素溶液）200 μL，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。采用CCK-8 法檢測細(xì)胞活力，使用酶標(biāo)儀測量450 nm 以及參比波長650 nm 處的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，營養(yǎng)缺乏組和正常營養(yǎng)組的細(xì)胞活力分別為0.66 ± 0.04、1.00 ± 0.06，營養(yǎng)缺乏細(xì)胞活力較正常營養(yǎng)組降低（P＜0.01），表明營養(yǎng)缺乏細(xì)胞模型制備成功。

1.4 LED 光照裝置搭建 取6 顆波長為660 nm的LED 芯片，用硅酮導(dǎo)熱膏將其固定在直徑20 mm 的鋁基板上，再將鋁基板固定于6 孔板板蓋。在板蓋上過每個(gè)孔的圓心做孔板長、短邊的平行線，其相交于6 點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)即為LED 芯片鋁基板的固定位置。LED 芯片之間使用串聯(lián)方式連接，最后將導(dǎo)線與直流穩(wěn)壓電源正負(fù)極連接（圖1）。為使光源更均勻地照射細(xì)胞，細(xì)胞放置于光源上方約2.7 cm 處。

圖1 直流穩(wěn)壓電源與LED芯片連接示意圖

1.5 最佳光照參數(shù)篩選 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×104/孔接種于96 孔板，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)液，加入低營養(yǎng)培養(yǎng)基200 μL 孵育24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分為5組，在室溫環(huán)境下，分別給予能量密度為2、4、8、16 J/cm2的660 nm 紅光照射1 h；另設(shè)空白對照組，室溫環(huán)境下避光孵育1 h。采用CCK-8試劑檢測細(xì)胞活力。重復(fù)上述步驟，依次使用2、4、8 mW/cm2功率密度的660 nm 紅光照射，以細(xì)胞活力最高組對應(yīng)的功率密度和能量密度作為最佳光照條件。

1.6 細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)監(jiān)測 使用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像系統(tǒng)監(jiān)測細(xì)胞增殖情況。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以2×104/孔接種于96 孔板，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)液，加入低營養(yǎng)培養(yǎng)基200 μL 孵育24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，光照組在最佳光照條件下接受紅光照射1 h，對照組在相同環(huán)境下避光孵育1 h。光照結(jié)束后，使用Incucyte 實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像系統(tǒng)每2 h 拍照1 次，連續(xù)監(jiān)測24 h。由Incucyte 內(nèi)置算法計(jì)算細(xì)胞匯合度，細(xì)胞匯合度=每個(gè)孔內(nèi)細(xì)胞投影面積/孔面積，用來衡量細(xì)胞數(shù)量。以0 h 為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算光照后8、16、24 h時(shí)各組細(xì)胞平均匯合度，以此反映細(xì)胞數(shù)量。

1.7 線粒體膜電位檢查 使用熒光探針JC-1 檢查線粒體膜電位。取JC-1 粉末加入DMSO 混勻，制成5 mg/mL 的儲存液，使用前以不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基將其稀釋成10 μg/mL 的工作液。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以6×105/孔接種至7 塊6 孔板（光照組6塊孔板，對照組1 塊孔板），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)液，加入低營養(yǎng)培養(yǎng)基200 μL 孵育24 h。光照組6 塊孔板分別在最佳光照參數(shù)下照射1、2、3、4、5、6 h，對照組在相同環(huán)境下避光孵育1 h。光照結(jié)束后將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h。向各孔加入胰酶消化，300 g 離心5 min，收集細(xì)胞，加入200 μL JC-1 工作液37 ℃孵育15 min；300 g 離心5 min 棄上清，用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，使用DPBS重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀上樣檢測，525 nm 激發(fā)，選擇PE 通道檢測分析，490 nm激發(fā)，選擇FITC 通道檢測分析。當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1 聚集于線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1 仍為單體，不能聚集，產(chǎn)生綠色熒光。因此紅色/綠色熒光強(qiáng)度比值可用于衡量線粒體功能，當(dāng)紅色/綠色熒光強(qiáng)度比值降低時(shí)提示線粒體功能下降。

1.8 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以6×105/孔接種至7 塊6 孔板（光照組6 塊孔板，對照組1塊孔板），按照“1.7”的方法進(jìn)行分組、光照處理。向細(xì)胞中加入胰酶消化，300 g 離心5 min，收集細(xì)胞，加入DCFH-DA 工作液200 μL，吹打混勻，37 ℃避光孵育30 min。用無血清培養(yǎng)液洗滌2 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA；使用DPBS重懸細(xì)胞，加入5 μL 7-AAD 染色液，室溫孵育5 min。流式細(xì)胞儀上樣檢測，488 nm 激發(fā)，選擇FITC-A 和PerCP-Cy5通道檢測分析。因7-AAD 無法透過正常細(xì)胞膜，但可透過壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)對DNA 進(jìn)行染色，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，從而鑒定出死細(xì)胞；熒光探針DCFH-DA 自身無熒光，其穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被水解為DCFH，細(xì)胞內(nèi)的ROS將無熒光的DCFH 氧化生成帶有熒光的DCF，故以DCF的熒光水平代表細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 660 nm 紅光對營養(yǎng)缺乏細(xì)胞的最佳光照條件篩選結(jié)果 見表1。在功率密度為2 mW/cm2、能量密度為8 J/cm2時(shí)，光照組細(xì)胞活力最高（P＜0.01）。因此將功率密度2 mW/cm2、能量密度8 J/cm2作為最佳光照條件，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同光照參數(shù)下營養(yǎng)缺乏SH-SY5Y細(xì)胞活力（±s）

表1 不同光照參數(shù)下營養(yǎng)缺乏SH-SY5Y細(xì)胞活力（±s）

功率密度（mW/cm2）0 2 2 2 2 4 4 4 4 8 8 8 8能量密度（J/cm2）0 2 4 8162 4 8162 4 816細(xì)胞活力1.00±0.061.12±0.031.15±0.041.22±0.060.98±0.021.02±0.090.95±0.141.05±0.081.01±0.090.84±0.030.90±0.050.88±0.040.90±0.02

2.2 660 nm 波長紅光對SH-SY5Y 細(xì)胞數(shù)量的影響 見表2。光照組光照8、16、24 h 后，細(xì)胞匯合度與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

表2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞匯合度比較（±s）

表2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞匯合度比較（±s）

注：與對照組比較，P均＞0.05。

組別光照組對照組細(xì)胞匯合度8 h 1.09±0.041.10±0.0316 h 1.16±0.061.15±0.0424 h 1.16±0.061.16±0.05

2.3 660 nm 波長紅光對SH-SY5Y 細(xì)胞線粒體膜電位的影響 對照組及光照組1、2、3、4、5、6 h 細(xì)胞線粒體膜電位紅色/綠色熒光強(qiáng)度比值分別為1.00 ±0.02、1.11 ± 0.01、1.13 ± 0.02、1.13 ± 0.02、1.40±0.49、1.03±0.01、0.97±0.00。光照組隨光照時(shí)間延長，線粒體膜電位水平逐漸升高；與對照組相比，光照后1 h 后開始上升（P＜0.05），2、3 h 時(shí)上升到平臺期（P＜0.01），4～6 h時(shí)回落（P＞0.05）。

2.4 660 nm 波長紅光對SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響 對照組及光照組1、2、3、4、5、6 h 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平分別為1.00 ± 0.01、0.90 ± 0.01、0.87 ±0.02、0.83 ± 0.02、1.15 ± 0.02、0.96 ± 0.00、1.12 ±0.01。光照組隨光照時(shí)間延長，ROS 水平逐漸降低；與對照組相比，光照1、2 時(shí)降低（P均＜0.05），3 h 時(shí)降至最低（P＜0.01），4、6 h 時(shí)升高（P＜0.05或＜0.01），5 h時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

3 討論

在神經(jīng)退行性疾病進(jìn)程中，部分患者由于認(rèn)知障礙導(dǎo)致營養(yǎng)攝入不均衡，而營養(yǎng)元素缺乏會對其病情產(chǎn)生不利影響［8］，在細(xì)胞層面上表現(xiàn)為代謝活動(dòng)降低，進(jìn)而引起細(xì)胞活力下降，甚至細(xì)胞凋亡［9］。目前臨床上普遍通過營養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)篩查和評估對患者狀況進(jìn)行診斷與分級，制定不同的治療策略。常見的營養(yǎng)補(bǔ)充方法為口服營養(yǎng)補(bǔ)充劑，用來補(bǔ)充營養(yǎng)素（蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪酸）和微量營養(yǎng)素（維生素、礦物質(zhì)）。而PBM 作為一種光療法，通過將特定波長的單色光施加到病變部位，促進(jìn)組織修復(fù)，降低炎癥水平，從而達(dá)到治療效果。最初關(guān)于PBM 的研究主要集中于創(chuàng)面愈合，例如PBM 可加速牙髓手術(shù)后早期階段的軟硬組織愈合，并降低患者疼痛感［10］；隨著研究的逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)PBM 能夠促進(jìn)腦血液代謝，降低炎癥和氧化應(yīng)激水平，改善衰老過程中大腦的認(rèn)知障礙［11］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，使用660 nm 紅光經(jīng)顱照射D 半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠大腦時(shí)，可調(diào)節(jié)線粒體功能、ROS產(chǎn)生和神經(jīng)元凋亡，從而改善小鼠的認(rèn)知障礙［12］。PITZSCHKE 等［13］報(bào)道，用腦室照明代替經(jīng)顱照明，可將光傳輸?shù)缴畈看竽X的效率提高20倍，使用671 nm波長紅光可以照射到深部腦組織，使PBM 在臨床應(yīng)用成為可能。本研究采用波長660 nm 的LED 芯片作為光源，從細(xì)胞底部進(jìn)行照射，對于貼壁細(xì)胞來說，最大程度減少了光反射次數(shù)，降低了能量損耗。

PBM 所使用的光源在紅色或近紅外光譜中通常具有窄光譜寬度，功率密度為1～5000 mW/cm2。光照參數(shù)在PBM 中起到?jīng)Q定性作用，不同波長、能量密度、功率密度均可對細(xì)胞和組織產(chǎn)生不同作用，或有助于組織修復(fù)，或?qū)M織無顯著影響，或有害于細(xì)胞造成組織損傷［14］。ROJAS 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，PBM可增加活體大鼠前額葉皮質(zhì)活性，當(dāng)能量密度在10.9 J/cm2時(shí)，細(xì)胞活力增加14%，21.6 J/cm2時(shí)增加10%，而32.9 J/cm2時(shí)細(xì)胞活力增加3%。本研究使用不同光照參數(shù)照射營養(yǎng)缺乏SH-SY5Y 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在功率密度為2 mW/cm2、能量密度為8 J/cm2條件下，660 nm 紅光照射使細(xì)胞活力顯著升高；而在功率密度為4 mW/cm2時(shí)，細(xì)胞活力無明顯變化；在功率密度為8 mW/cm2時(shí)，660 nm 紅光對細(xì)胞活力有輕微抑制作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在能量密度為16 J/cm2時(shí)，不論功率密度多寡，對細(xì)胞活力均無促進(jìn)作用。以上數(shù)據(jù)表明，功率密度可能是660 nm紅光PBM 效應(yīng)的首要影響因素，過高的功率密度可能對細(xì)胞存在抑制作用，而能量密度對細(xì)胞活力的調(diào)節(jié)作用較小，并且在2 mW/cm2功率密度下能量密度與細(xì)胞活力可能存在倒U 型劑量效應(yīng)，低劑量表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)，高劑量表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。

CCK-8 試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞活力分析，其原理是電子耦合試劑WST-8 可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成橙黃色的甲臜產(chǎn)物，其顏色深淺與線粒體脫氫酶活性、數(shù)量成正比。當(dāng)細(xì)胞線粒體功能不變時(shí)，細(xì)胞活力上調(diào)可以反映為細(xì)胞數(shù)量的增加；當(dāng)細(xì)胞數(shù)量不變時(shí)，細(xì)胞活力上調(diào)意味著線粒體功能的增強(qiáng)。本研究通過Incucyte 長時(shí)程活細(xì)胞成像技術(shù)監(jiān)測細(xì)胞匯合度變化進(jìn)而判斷細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示，光照組光照后8、16、24 h的細(xì)胞匯合度與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這意味著PBM 是通過增強(qiáng)線粒體功能而不是通過增加細(xì)胞數(shù)量來上調(diào)細(xì)胞活力的。

線粒體功能障礙是幾乎所有疾病的標(biāo)志。一部分疾病由線粒體基因組DNA的獲得性或遺傳性突變產(chǎn)生；另一類疾病則是由其他因素引起的線粒體損傷，最終會導(dǎo)致細(xì)胞能量抑制，其特征是胞質(zhì)磷酸化電位降低，從而抑制控制細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)及其氧化還原狀態(tài)的能力［16］。本研究使用熒光探針JC-1檢測線粒體膜電位，觀察營養(yǎng)缺乏SH-SY5Y 細(xì)胞接受光照后線粒體膜電位的變化，結(jié)果顯示，光照后膜電位開始上升，并隨時(shí)間延長逐漸升高，提示線粒體膜電位發(fā)生超極化，在2 h和3 h達(dá)到最高；此后膜電位逐漸回落，提示線粒體功能恢復(fù)至光照前水平。光照后線粒體膜電位變化表明，660 nm 紅光照射能在短時(shí)間內(nèi)增強(qiáng)營養(yǎng)缺乏SH-SY5Y細(xì)胞的線粒體功能。

ROS主要來源于線粒體，其作為信號分子，能夠調(diào)節(jié)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性、介導(dǎo)細(xì)胞自噬過程，參與多種信號通路的傳導(dǎo)［17-18］。當(dāng)ROS 過量或出現(xiàn)在錯(cuò)誤的地方時(shí)會造成細(xì)胞損傷［19］，因此ROS 水平直接決定了其對細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用。本研究結(jié)果顯示，營養(yǎng)缺乏SH-SY5Y 細(xì)胞在接受光照后，活細(xì)胞中的ROS水平逐漸下降，在3 h時(shí)降至最低點(diǎn)，隨后開始上升，在4、5、6 h 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)ROS 水平均不低于對照組。這表明660 nm 紅光照射可以在短時(shí)間內(nèi)降低細(xì)胞ROS 水平，改善體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)；但隨著時(shí)間增加，ROS水平又出現(xiàn)上升，這可能是由于光照后短期內(nèi)線粒體膜電位發(fā)生超極化進(jìn)而加快呼吸鏈中電子傳遞，在電子從還原電位低的地方向還原電位高的地方傳遞時(shí)，電子會在呼吸鏈底物端和氧端漏出，進(jìn)而產(chǎn)生ROS，因此存在一定的滯后效應(yīng)［20］。

綜上所述，在功率密度為2 mW/cm2、能量密度為8 J/cm2時(shí)，波長660 nm 紅光照射對營養(yǎng)缺乏SH-SY5Y 細(xì)胞活力有促進(jìn)作用；660 nm 紅光能夠快速超極化線粒體膜電位、降低ROS 生成，從而增強(qiáng)線粒體功能。