安 琪，孫 紅，武林芝，劉亮亮，陳素娥

(山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，山西生物樣品分析檢測中心，山西 晉中 030619)

高效液相色譜是藥物分析中最常用的定性和定量分析手段。在分析的過程中，色譜工作者通常進(jìn)行流動相優(yōu)化和色譜柱篩選以獲得良好的峰形和較高的分離度，而常常忽略了溶解樣品所用溶劑(簡稱溶樣溶劑)的重要性。如果溶樣溶劑選擇不合適容易造成“溶劑效應(yīng)”，即溶樣溶劑與流動相比例存在差異時會導(dǎo)致色譜保留行為異常，如在反相高效液相色譜中，尤其是前者的洗脫強(qiáng)度較強(qiáng)時，極易引起目標(biāo)物保留時間漂移、色譜峰展寬、分叉甚至峰穿透等現(xiàn)象[1]。文獻(xiàn)報道避免溶劑效應(yīng)通用準(zhǔn)則是使用流動相或是與流動相組成匹配的溶劑作為溶樣溶劑[2-5]。但是在實(shí)際中，考慮到樣品的溶解性、化學(xué)穩(wěn)定性及實(shí)際操作的可行性，通用準(zhǔn)則實(shí)用性存在一定的局限性。

文章選取了筆者在檢測工作中遇到的三個具有代表性的案例，初步探討了溶樣溶劑對色譜行為的影響并分析其產(chǎn)生的原因，同時提出了判斷和消除溶劑效應(yīng)的方法，以期為高效液相色譜方法建立提供新的分析視角。

1 溶劑效應(yīng)對色譜峰峰形影響的案例

1.1 儀器和試藥

儀器：Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀，美國Agilent公司；LK/CSJ-30超聲波清洗機(jī)，成都老肯科技股份有限公司；XPE105電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Fresco 21高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Scientific公司。

試劑：甲醇(色譜級)、乙腈(色譜級)和磷酸(色譜級)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

藥材：黨參藥材(批號2020102601，產(chǎn)地山西省平順縣)，山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院楊翠玲副教授鑒定為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.干燥根，藥材粉碎，待用。

對照品：5-羥甲基糠醛(批號為G1032933，純度為94.6%)，天津諾爾醫(yī)藥技術(shù)有限公司；紫丁香苷(批號1506569，純度為99.12%)，伊普賽諾科技(天津)有限公司；黨參苷Ⅰ(純度≥98%，批號CHB180123)，成都克洛瑪生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 案例一

色譜條件：色譜柱Waters XSelect HSS T3(4.6 mm× 250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水，5%乙腈等度洗脫，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 μL，流速1 mL/min，采用190～400 nm全波長掃描，檢測波長為230 nm。

1.2.2 案例二

色譜條件：色譜柱Waters XSelect HSS T3(4.6 mm× 250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.5%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min，5%～10%B；20～60 min，10%～25%B；60～61 min，25%～90%B；61～65 min，90%B)，柱溫 35 ℃，流速1 mL/min，檢測波長為220 nm。

1.2.3 案例三

色譜條件：色譜柱Waters XSelect HSS T3(4.6 mm× 250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.5%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min，5%～10%B；20～45 min，10%～20%B；45～46 min，20%～90%B；46～50 min，90%B)，柱溫 30 ℃，流速1 mL/min，采用紫外(190～400 nm)全波長掃描，檢測波長為220 nm。

1.3 樣品制備

1.3.1 案例一

樣品溶液的制備：精密稱取5-羥甲基糠醛對照品適量，甲醇溶解，配制成1 mg/mL對照品儲備液，采用不同濃度乙腈水溶液(100%、80%、50%、20%和5%)稀釋得5 μg/mL的樣品溶液。

1.3.1 案例二

樣品溶液的制備：取黨參藥材(過3號篩)約1 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，振搖混勻，稱定重量，進(jìn)行超聲提取30 min，超聲完成取出，待錐形瓶溫度接近室溫，稱重并補(bǔ)足差額重量，過濾，精密量取15 mL濾液，水浴蒸干，甲醇復(fù)溶至5 mL容量瓶得到樣品溶液。

1.3.1 案例三

樣品溶液的制備：精密稱取紫丁香苷和黨參苷Ⅰ對照品適量，甲醇溶解，配制成濃度分別為250 μg/mL、2 mg/mL對照品儲備液，50%甲醇稀釋得到50 μg/mL紫丁香苷和黨參苷Ⅰ混合對照品溶液，即樣品溶液。

1.4 結(jié)果分析

1.4.1 案例一

從色譜圖(圖1)中可以看出，隨著溶樣溶劑中乙腈體積分?jǐn)?shù)的降低(100%乙腈、80%乙腈、50%乙腈、20%乙腈和5%乙腈)，5-羥甲基糠醛的峰形逐漸改善，其中100%乙腈、80%乙腈、50%乙腈和20%乙腈作為溶樣溶劑色譜峰出現(xiàn)保留時間提前，峰展寬或峰前沿，均呈現(xiàn)不同程度的溶劑效應(yīng)，當(dāng)采用起始流動相比例5%乙腈溶解樣品時，5-羥甲基糠醛峰形對稱。對比前沿峰和對照峰的紫外吸收圖譜(190～400 nm)(圖2)，可知100%乙腈溶樣溶劑中5-羥甲基糠醛前沿峰(取色譜峰兩個時間點(diǎn)7.557 min和7.997 min)與5-羥甲基糠醛對照色譜峰(保留時間8.009 min)的紫外吸收圖譜完全吻合，佐證前沿峰與5-羥甲基糠醛是同一物質(zhì)，提示強(qiáng)溶劑效應(yīng)導(dǎo)致了5-羥甲基糠醛出現(xiàn)峰扭曲變形，引起溶劑效應(yīng)，選擇使用流動相溶解樣品可以避免溶劑效應(yīng)。

圖1 5-羥甲基糠醛在不同溶劑強(qiáng)度稀釋液下色譜圖

圖2 100%乙腈稀釋液中5-羥甲基糠醛前沿峰與對照色譜峰的紫外吸收圖譜對比圖

1.4.2 案例二

這是黨參指紋圖譜研究案例，實(shí)驗(yàn)中考慮盡可能多目標(biāo)物提取及各目標(biāo)物的提取效率，采用甲醇作為提取溶劑，由于目標(biāo)物溶解性的原因，依舊采用甲醇作為復(fù)溶溶劑。當(dāng)進(jìn)樣體積為100 μL，呈現(xiàn)出較早洗脫的峰(40 min前)出現(xiàn)前沿，較晚洗脫的峰(40 min后)峰形影響程度小或者不受影響的現(xiàn)象(圖3)，進(jìn)樣體積降低至為5 μL，所有色譜峰均獲得良好峰形，可見溶劑效應(yīng)會受到進(jìn)樣體積的影響，在梯度洗脫模式下尤其保留弱的化合物，它的洗脫強(qiáng)度與初始比例流動相越接近，越容易受溶劑效應(yīng)影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用強(qiáng)溶劑溶解樣品可通過選擇小體積進(jìn)樣消除溶劑效應(yīng)。

1.4.3 案例三

這是紫丁香苷和黨參苷Ⅰ含量測定的案例，采用50%甲醇作為稀釋溶劑，從色譜圖(圖4)中可以看出，當(dāng)進(jìn)樣體積為100 μL，紫丁香苷和黨參苷Ⅰ保留時間提前，均出現(xiàn)峰裂分和峰前沿現(xiàn)象，當(dāng)進(jìn)樣體積降至10 μL，色譜峰峰形明顯改善，均獲得單一良好峰形。對比裂分峰、前沿峰與對照峰的紫外吸收圖譜(190～400 nm)(圖5和圖6)，可知裂分峰(紫丁香苷保留時間15.440 min、黨參苷Ⅰ保留時間35.427 min)、前沿峰(紫丁香苷保留時間23.387 min、黨參苷Ⅰ保留時間39.200 min)和與對照峰(紫丁香苷保留時間24.324 min、黨參苷Ⅰ保留時間39.870 min)紫外吸收圖譜完全吻合，推測與對照品為同一物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)采用起始流動相接近溶液5%甲醇稀釋紫丁香苷和黨參苷Ⅰ，即使增大進(jìn)樣體積仍能獲得較好的單一峰形。由此可見，溶劑效應(yīng)會受到進(jìn)樣體積和溶劑強(qiáng)度的綜合影響。實(shí)驗(yàn)中為了兼顧所有測定目標(biāo)物的溶解度和靈敏度，方法建立的時候需要對進(jìn)樣體積和溶劑強(qiáng)度進(jìn)行優(yōu)化。

圖4 50%甲醇作為稀釋溶劑不同進(jìn)樣體積下紫丁香苷和黨參苷Ⅰ色譜圖

圖5 紫丁香苷裂分峰、前沿峰與對照峰的紫外吸收圖譜對比圖

圖6 黨參苷Ⅰ裂分峰、前沿峰與對照品的紫外吸收圖譜對比圖

2 討 論

2.1 溶劑效應(yīng)的影響因素和消除方法

2.1.1 溶劑強(qiáng)度

在反相色譜系統(tǒng)中溶劑強(qiáng)度的順序?yàn)樗?最弱)<甲醇<乙腈。當(dāng)溶樣溶劑強(qiáng)度大于流動相強(qiáng)度，一部分樣品溶解于溶劑中會被迅速洗脫出色譜柱，而一部分樣品溶解于流動相，被流動相洗脫出，在經(jīng)過檢測器，形成色譜峰的展寬或者分叉，同一目標(biāo)物給出了兩個色譜峰，其中進(jìn)柱前即擴(kuò)散進(jìn)入流動相的那部分目標(biāo)物組成了后面的色譜峰，它的保留時間與目標(biāo)物的真實(shí)保留時間基本吻合，處于溶劑范圍的那部分目標(biāo)物保留時間提前，樣品在柱前的不充分?jǐn)U散導(dǎo)致了峰前沿，嚴(yán)重會出現(xiàn)峰穿透現(xiàn)象，降低柱效，影響分離度。相反，而當(dāng)溶樣溶劑強(qiáng)度小于流動相強(qiáng)度，則保留時間延后，但延后幅度較小，即使發(fā)生裂分，前后兩峰均能保持良好峰形。

針對溶劑強(qiáng)度造成溶劑效應(yīng)的現(xiàn)象，結(jié)合上述案例可以嘗試采取以下的消除辦法：在不影響目標(biāo)物溶解性的情況下，盡量用流動相或者與流動相接近的溶劑作為樣品溶劑；為了滿足多目標(biāo)物的提取或溶解度，必須使用強(qiáng)洗脫溶劑時，比如天然產(chǎn)物分析，在不影響靈敏度的情況下降低進(jìn)樣體積；如果無法更改溶劑強(qiáng)度或者降低進(jìn)樣體積，可以采用梯度洗脫模式，降低起始流動相比例避免溶劑效應(yīng)，因?yàn)槌跏急壤鲃酉酂o法洗脫目標(biāo)物，而且強(qiáng)洗脫溶劑也無法讓目標(biāo)物快速移動，它們會富集在柱頭，等流動相洗脫強(qiáng)度提高到一定程度，化合物才會逐漸被洗脫；另外反相條件可以嘗試HILIC色譜柱，該色譜柱使用的溶劑系統(tǒng)的順序?yàn)橐译?最弱)<甲醇<水，與反相色譜系統(tǒng)中溶劑強(qiáng)度的順序剛好相反，反相強(qiáng)溶樣溶劑與HILIC色譜柱流動相比例接近或稍弱，不會引起溶劑效應(yīng)。

2.1.2 進(jìn)樣體積

進(jìn)樣體積造成的溶劑效應(yīng)一般與溶劑種類有關(guān)。流動相作為溶劑時，增加進(jìn)樣體積后，目標(biāo)分析物色譜峰不會發(fā)生遷移，保留時間基本穩(wěn)定。使用強(qiáng)度大于流動相強(qiáng)度的溶劑，增加進(jìn)樣體積后，目標(biāo)分析物色譜峰會向前遷移，直至裂分，峰高降低且峰展寬。對于粒徑為5 μm或更小粒徑的色譜柱，為了獲得最優(yōu)的峰形，推薦進(jìn)樣體積不大于10 μL。實(shí)際情況為了提高靈敏度比如痕量物質(zhì)的定量，經(jīng)常會優(yōu)化進(jìn)樣體積，采用20 μL、50 μL甚至100 μL。上述案例分析表明，進(jìn)樣體積較大時強(qiáng)溶劑影響更為明顯，因此實(shí)驗(yàn)中盡量選擇流動相作為稀釋劑。若無法使用流動相作稀釋劑，需要通過試驗(yàn)優(yōu)化溶劑效應(yīng)的進(jìn)樣體積臨界值，避免溶劑效應(yīng)導(dǎo)致的峰型異常。

2.1.3 溶劑組成

溶劑pH值、離子強(qiáng)度和流動相不兼容同樣會引起溶劑效應(yīng)，影響經(jīng)常表現(xiàn)為保留時間的漂移而不是多個峰或者峰分叉等峰形差現(xiàn)象。易于解離的化合物對流動相的pH值較敏感，化合物處于解離狀態(tài)下極性發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致保留行為發(fā)生較大變化。原則上采用跟流動相匹配的溶劑pH值、離子強(qiáng)度的溶樣溶劑，對于堿性化合物選擇堿性流動相分離的方法，升高進(jìn)樣溶液pH，對于酸性化合物則相反，避免目標(biāo)物處于解離狀態(tài)。

2.1.4 其他因素

柱前管路對溶劑效應(yīng)也有一定的影響，內(nèi)徑越大、管路越長，越利于目標(biāo)物向流動相擴(kuò)散，而且使用更粗的管路比更長的管路有效。雖然粗的管路會造成柱外展寬，降低柱效。也可以采用進(jìn)樣前預(yù)混合將目標(biāo)物擴(kuò)散至流動相中，降低溶劑效應(yīng)對峰形的危害。

2.2 溶劑效應(yīng)的判斷方法

溶劑效應(yīng)中的峰裂分有兩個特點(diǎn)，裂分峰在正常色譜峰的前面，而且出峰越早的化合物裂分越明顯，出峰晚的化合物甚至不會受影響。當(dāng)出現(xiàn)色譜峰異常時，比如色譜峰前沿、峰裂分等現(xiàn)象，可采用UV全波長掃描查看前沿峰、裂分峰紫外吸收情況進(jìn)行單一成分純度判斷，或者降低進(jìn)樣體積(甚至直接降低至0.1 μL)，觀察色譜峰峰型是否改善。若峰型有效改善基本就可以斷定為溶劑效應(yīng)。當(dāng)然，以下情況也會出現(xiàn)溶劑效應(yīng)類似的現(xiàn)象：(1)進(jìn)樣過載會造成峰前伸，但是過載與樣品的紫外吸收性質(zhì)相關(guān)，跟樣品出峰順序無關(guān)。如果目標(biāo)物紫外吸收很弱，雖然峰面積很小，也可能會過載；(2)色譜柱污染塌陷會造成峰前伸，色譜柱損壞(如篩板堵塞)導(dǎo)致峰裂分，色譜柱故障會波及到所有色譜峰，所有色譜峰均會出現(xiàn)峰前伸或裂分且裂分峰在后面；(3)性質(zhì)相似結(jié)構(gòu)相近的組分沒有完全分離也會造成峰前沿，這是由于色譜峰沒有完全分離引起的，可以通過紫外吸收光譜、質(zhì)譜質(zhì)荷比等分析手段來判定是否為同一物質(zhì)。

3 結(jié) 論

在高效液相色譜定性定量過程中，選擇使用流動相或者是與流動相相接近的溶劑溶解樣品可以避免溶劑效應(yīng)，確保峰形良好，從而實(shí)現(xiàn)測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。但是在實(shí)際分析中，我們需要確保樣品在溶劑中的溶解性和穩(wěn)定性，當(dāng)樣品難溶于流動相，需要使用替換溶劑溶解樣品時，為了避免溶劑效應(yīng)，可以選擇在不影響靈敏度的情況下小體積進(jìn)樣；或者用強(qiáng)溶劑溶解樣品后再用流動相稀釋樣品，然后加大進(jìn)樣體積來實(shí)現(xiàn)；或者可以更換HILIC色譜柱。如果上述方法不可行，比如對于某些保留弱的化合物可以采用梯度洗脫的方法，降低起始流動相比例，降低強(qiáng)溶解溶劑的影響，雖然可能目標(biāo)化合物保留時間延后，但是能夠獲得理想峰形，保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。