夏翠鋒，李云峰，楊之斌，李強(qiáng)，沈燾，程先碩

EZH2（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit）是果蠅E（z）基因的同源基因，屬于Ploycomb Group家族基因的成員之一，是新人類基因，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，主要是通過抑制染色體中靶基因來促進(jìn)細(xì)胞增殖［1-2］。相關(guān)研究指出，Zeste同源物增強(qiáng)子2（EZH2）蛋白是轉(zhuǎn)錄抑制因子，對諸如腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因等多種活性基因進(jìn)行抑制，在腫瘤細(xì)胞增殖過程中具有重要作用［3］。相關(guān)研究指出，EZH2的表達(dá)參與到多種腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲過程中，與腫瘤病癥密切相關(guān)［4］。但是，在直腸癌診斷過程中，該種物質(zhì)的相關(guān)研究較少。NF-E1b也是轉(zhuǎn)錄因子的重要成員，相關(guān)研究指出，NFE1b在諸多癌癥患者身上異常表達(dá)，被認(rèn)為其參與到腫瘤細(xì)胞增殖過程當(dāng)中，與癌癥病情密切相關(guān)［5］。為了進(jìn)一步明確EZH2、NF-E1b表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后效果，本研究特此選取相關(guān)結(jié)直腸癌患者相關(guān)資料進(jìn)行回顧性研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取云南省腫瘤醫(yī)院2012年1月至2015年8月收治的86例結(jié)直腸癌患者資料，其中男、女各50、36例，年齡40～89歲，平均年齡（53.56±9.82）歲，體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）18～28 kg/m2，平均（22.62±4.28）kg/m2，平均腫瘤直徑（3.62±0.78），腫瘤距肛緣距離（5.38±1.28）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料齊全；②無嚴(yán)重的肝腎疾病患者；③未接受放化療；④患者經(jīng)病理學(xué)診斷確診為直腸癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①子宮肌瘤惡性腫瘤癌變患者；②并發(fā)嚴(yán)重腸道、肝腎、心肺疾病患者；③并發(fā)嚴(yán)重心血管疾病、凝血功能疾病患者；④手術(shù)禁忌患者；⑤嚴(yán)重精神病患者。本研究符合醫(yī)院倫理會(huì)要求，倫理受理編號(hào)為：SLKYLX202155。

1.2 檢測方法

采用免疫組織化學(xué)方法檢測納入標(biāo)本中EZH2、NF-E1b的表達(dá)情況，具體步驟：將標(biāo)本用40 g/L的甲醛固定，石蠟包埋，按3μm的厚度連續(xù)切片，放入恒溫烤箱烤片。常規(guī)脫蠟脫水，PBS沖洗，檸檬酸高壓修復(fù)，滴加EZH2（美國CST公司）、NF-E1b（美國Santa Cruz Biotech-nology公司），4℃冰箱過夜，PBS沖洗，滴加對應(yīng)二抗，室溫孵育，PBS沖洗，滴加DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。以正常的結(jié)直腸黏膜上皮核染色作陽性對照。

1.3 觀察指標(biāo)

EZH2、NF-E1b表達(dá)陽性：分析陽性染色細(xì)胞占比，陽性細(xì)胞數(shù)≥10%則判定為陽性。表達(dá)強(qiáng)度：觀察切片，不著色為陰性，淡黃色為弱陽性，棕黃色為中陽性，棕褐色為強(qiáng)陽性。

統(tǒng)計(jì)患者臨床病理特征資料，包括年齡、性別、腫瘤直徑、病灶部位、組織學(xué)分型、分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高血壓、糖尿病，研究EZH2、NF-E1b表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。高分化指的是原始的細(xì)胞已經(jīng)分化到非常接近于成熟，有不同功能細(xì)胞的程度，而低分化就是細(xì)胞還是在比較原始的階段。

生存情況通過隨訪或患者復(fù)查知曉，隨訪5年，根據(jù)患者預(yù)后情況進(jìn)行分組，并探討EZH2、NF-E1b表達(dá)與生存率的關(guān)系，同時(shí)采用生存COX回歸分析影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后生存的影響因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布采用M（Q1，Q3）表示，采用滿惠-惠特尼檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。生存預(yù)后影響因素采用生存COX回歸分析。強(qiáng)制Kaplan-Meier生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EZH2、NF-E1b表達(dá)在結(jié)直腸癌患者的表達(dá)情況

EZH2陽性表達(dá)為52例，占比為60.5%，陰性表達(dá)為34例，占比39.5%；NF-E1b陽性表達(dá)為53例，占比為61.6%，陰性表達(dá)為33例，占比38.4%。個(gè)別案例結(jié)直腸癌患者的EZH2、NF-E1b陽性表達(dá)數(shù)多于陰性表達(dá)數(shù)。見圖1和圖2。

2.2 EZH2、NF-E1b表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

低分化直腸癌患者EZH2陽性率顯著高于中、高分化患者；淋巴轉(zhuǎn)移患者EZH2陽性率顯著高于淋巴未轉(zhuǎn)移患者；年齡≥60歲直腸癌患者EZH2陽性率顯著高于＜60歲患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。低分化直腸癌患者NF-E1b陽性率顯著高于中、高分化患者；糖尿病患者NF-E1b陽性率顯著高于非糖尿病患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 EZH2、NF-E1b表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征［n（%）］

2.3 EZH2、NF-E1b表達(dá)與 結(jié)直腸癌患者生存率情況

EZH2、NF-E1b陽性表達(dá)的存活率均低于陰性表達(dá)，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.4 結(jié)直腸癌預(yù)后生存COX回歸分析

結(jié)果顯示：兩組在性別、腫瘤直徑、病灶部位、組織學(xué)分型、分期、年齡、高血壓、糖尿病無明顯差異，但兩組在分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、NF-E1b、EZH2存在明顯差異，見表2。

表2 生存與死亡組單因素對比［n（%）］

首先統(tǒng)計(jì)EZH2、NF-E1b表達(dá)生存時(shí)間，其中EZH2、NFE1b不同表達(dá)的生存時(shí)間有所不同，EZH2陽性、陰性存活時(shí)間分別是33.14（24.43，49.28）個(gè)月、47.78（33.34，63.65）個(gè)月，檢驗(yàn)值Z為-2.997，P值為0.003；NF-E1b陽性陰性存活時(shí)間分別是33.14（24.43，49.28）、47.78（33.34，63.65），檢驗(yàn)值Z為-3.855，P值為0.000。以生存時(shí)間作為時(shí)間變量，以存活與否作為狀態(tài)變量（賦值：0=是，1=否），其中以“死”作為發(fā)生事件，將NF-E1b、EZH2、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等作為協(xié)變量納入其中（賦值見表3），得到模型系數(shù)的Omnibus檢驗(yàn)中-2對數(shù)似然值為387.131，χ2值為52.017，P值小于0.05，表示該種生存函數(shù)模型成立，具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。得到影響結(jié)直腸癌患者存活狀態(tài)危險(xiǎn)影響因素是NF-E1b陽性、EZH2陽性、分化程度、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，見表5。同時(shí)繪制生存曲線，從生存曲線集圖3來看，總體上結(jié)直腸癌患者的生存率隨著時(shí)間的增加，出現(xiàn)下降趨勢，尤其是在20月-50月區(qū)間，下降趨勢明顯。而在NF-E1b、EZH2不同表達(dá)上，一致表現(xiàn)為陰性表達(dá)的存活率要高于陽性表達(dá)率。

圖3 生存曲線圖

表3 結(jié)直腸癌預(yù)后生存COX回歸分析賦值情況

表4 模型系數(shù)的Omnibus檢驗(yàn)

表5 結(jié)直腸癌預(yù)后生存COX回歸分析

3 討論

結(jié)直腸癌是比較常見的消化道腫瘤疾病，其中95%以上的為散發(fā)性，相關(guān)病理機(jī)制及其病因還處于研究當(dāng)中［6-7］。NF-E1b也稱之GATA結(jié)合蛋白2（GATA2），屬于轉(zhuǎn)錄因子家族之一，可編碼四百多個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)錄因子，對細(xì)胞繁殖、凋亡等具有調(diào)控作用［8-9］。相關(guān)研究指出，NF-E1b與前列腺癌、乳腺癌等發(fā)展密切相關(guān)，影響患者身心健康和生命安全［10-11］。本研究當(dāng)中，NF-E1b的陽性表達(dá)為60.5%，而且與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移年齡密切相關(guān)，本研究在性別中存在差異，這或許與樣本量選用較少相關(guān)，還需要通過單樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。相關(guān)研究指出，NF-E1b陽性表達(dá)主要見于分化低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者身上，會(huì)推動(dòng)癌癥進(jìn)一步發(fā)展［12-13］。

從預(yù)后生存情況來看，該種物質(zhì)陽性表達(dá)的生存率與陰性表達(dá)的生存率之間存在差異，表現(xiàn)為陰性生存率要大于陽性生存率，這表示該種物質(zhì)的表達(dá)與直結(jié)腸癌患者的存亡密切相關(guān)。從存活時(shí)間來看，EZH2、NF-E1b陰性表達(dá)生存時(shí)間分別為47.78（33.34，63.65）個(gè)月、47.78（33.34，63.65）個(gè)月，遠(yuǎn)大于陽性表達(dá)存活時(shí)間。相關(guān)研究指出，EZH2、NF-E1b低表達(dá)的直結(jié)腸癌患者的存活率要高于高表達(dá)直結(jié)腸癌患者的存活率，這是因?yàn)樵谀[瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲的過程中，這兩種物質(zhì)積極參與其中，患者病情加重，EZH2、NF-E1b呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)［14-15］。這說明這兩種物質(zhì)與患者的預(yù)后生存情況密切相關(guān)，臨床中應(yīng)該加以重視。

從結(jié)直腸癌預(yù)后生存COX回歸分析，影響結(jié)直腸癌患者存活獨(dú)立危險(xiǎn)因素有NF-E1b陽性、EZH2陽性、低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。其中，NF-E1b、EZH2赫然在列，結(jié)直腸癌分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移表明結(jié)直腸癌屬于晚期，直接影響患者的生存期，需要通過手術(shù)、化療等方式進(jìn)行治療，同時(shí)輔助營養(yǎng)、心理等方面治療，減緩病癥發(fā)展，增加患者的存活時(shí)間［16-17］。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也影響患者的生存時(shí)長，危及患者生命安全［18-19］。相關(guān)研究認(rèn)為，結(jié)直腸癌早期癥狀比較隱秘，難以發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤侵潤加深，5年的生存概率為50%左右，在此期間患者將面臨巨大的身心疼痛，直接危及生命安全［20-21］。

從生存曲線來看，結(jié)直腸患者的生存概率顯著下降，其中40月的生存概率在40%左右，這與相關(guān)研究略有差異，這或許與本研究中直結(jié)腸癌晚期患者居多相關(guān)，使得5年內(nèi)生存率并不高。同時(shí)，在EZH2、NF-E1b表達(dá)劃分下的生存率來看，兩者的陰性表達(dá)生存率顯著高于陽性表達(dá)生存率，但是隨著時(shí)間增加這種生存概率處于下降趨勢，這反映EZH2、NFE1b表達(dá)情況也與結(jié)直腸癌患者的生存概率相關(guān)。其中，國外研究也認(rèn)為贊同這一觀點(diǎn)，EZH2［22-23］、NF-E1b［24-25］表達(dá)與結(jié)腸癌相關(guān)。

綜上所述，EZH2表達(dá)情況與直結(jié)腸癌患者的分化程度明顯相關(guān)，NF-E1b表達(dá)情況與結(jié)腸癌患者的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，兩者陽性表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)，臨床應(yīng)該加以重視。當(dāng)然。本研究還存在一些不足，主要有以下幾點(diǎn)：一是小樣本研究，由于跟蹤時(shí)間較長、樣本數(shù)有限，這在一定程度上會(huì)影響本研究結(jié)果。二是缺乏多中心實(shí)驗(yàn)，本研究偏于本院患者當(dāng)中，相關(guān)研究結(jié)果還需相關(guān)醫(yī)院進(jìn)一步作證，以便豐富該領(lǐng)域的研究。三是選取多為結(jié)直腸癌晚期患者，由于晚期患者存在分化程度較高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯，加上部分存在糖尿病、高血壓等并發(fā)癥，這在一定程度上影響生存率，還需大樣本進(jìn)一步考證。