施 敏，鮑昌昊，馬雯雯，程 寒，2*

（1.中南民族大學 藥學院，湖北 武漢 430074；2.中南民族大學 民族藥學國家級實驗教學示范中心，湖北 武漢 430074）

木犀草素（Luteolin）是一類具有典型C6-C3-C6 結(jié)構(gòu)的天然黃酮類化合物，存在于金銀花、白毛夏枯、紫蘇葉、菊花、蓮花、芹菜、香菜、花生殼、胡蘿卜和石榴等植物材料中［1-4］。其主要藥理活性表現(xiàn)為抗菌、抗炎、抗過敏、抗癌、抗氧化、抗腫瘤［5-10］等方面，在臨床上廣泛應用于止咳、祛痰、治療心血管系統(tǒng)、保護肝臟、促進免疫調(diào)節(jié)和保護神經(jīng)系統(tǒng)［11］等。目前，木犀草素的測定方法主要有高效液相色譜法［12］、毛細管電泳法［13］及紫外分光光度法［14］等。上述方法可對木犀草素進行含量測定，但普遍存在方法繁瑣、儀器昂貴、實驗要求較高等問題。電化學分析法［15］具有靈敏度高、選擇性好、準確度高、測量范圍廣、儀器設備簡單等特點，逐漸成為一種不可或缺的中藥有效成分測定的方法。

碳纖維超微電極（CFME）具有比表面積大、靈敏度高、制備成本低［16］等優(yōu)點，在神經(jīng)遞質(zhì)［17］、其他生物因子、金屬離子［18］、活細胞釋放H2O2［19］和生物活體檢測［20］等方面有著廣泛應用。化學修飾電極是當前電化學和電分析化學領域非?；钴S的研究熱點，在藥物分析領域有著廣闊的應用前景。納米金為直徑1～100 nm 的微小金顆粒，其制備過程簡單，具有獨特的光電效應，且具有比表面積大、生物相容性能優(yōu)良等特點［21］，其優(yōu)異的電導性和生物相容性能可提升CFME 電極表面的電子轉(zhuǎn)移速率，極大地改善了電極的電催化性能。楊莉莉等［22］制備了線狀納米金修飾碳纖維超微電極，用于蘆薈大黃素的電化學檢測，結(jié)果顯示修飾后的電極具有優(yōu)異的電催化活性，可用于實際樣品蘆薈汁中蘆薈大黃素的測定。

本研究采用化學還原法制備納米金顆粒，通過電沉積方法將納米金修飾在碳纖維超微電極上構(gòu)建電化學傳感器（AuNPs/CFME），建立了一種簡單、高效檢測木犀草素含量的新方法（如圖1），并成功應用于實際樣品獨一味膠囊中木犀草素的含量測定。

圖1 基于AuNPs/CFME的木犀草素傳感器的檢測原理圖Fig.1 Principle of luteolin sensor based on AuNPs/CFME

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

XD-RFL 型倒置顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）；CHI660D 型電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；SU8010 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本Hitachi）；TECNAI G2 F20 S-TWIN 型投射式電子顯微鏡（美國FEI 公司）；AR224CN 型分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；雙電極系統(tǒng)（CFME 為工作電極，Ag/AgCl為參比電極）；PHS-3C型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）。

碳纖維（直徑5 μm，吉林市神舟碳纖維有限責任公司）；木犀草素（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O，純度≥47.8%，國藥集團化學試劑有限公司）；檸檬酸三鈉、單寧酸、碳酸鉀、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；獨一味膠囊（康縣獨一味生物制藥有限公司）；AB 膠（廣東愛必達膠粘劑有限公司）；碳粉導電膠（自制）；PBS 緩沖溶液：Na2HPO4∶KH2PO4（6∶1）；以pH 1.0的PBS緩沖溶液為底液，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 AuNPs 及AuNPs/CFME 的制備AuNPs 的制備參考文獻［23］。將40 mL 水加熱至沸騰，邊攪拌邊加入500 μL 1%的氯金酸（HAuCl4）溶液。隨后快速加入900 μL 1%的檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7）溶液，繼續(xù)加熱20 min，直至溶液呈酒紅色，冷卻至室溫，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取10 mL AuNPs 溶膠置于50 mL 小燒杯中，將Ag/AgCl 參比電極與潔凈的CFME 置于AuNPs 溶膠中，采用恒電位電流-時間法，在1.5 V電位下進行電沉積，即在CFME表面構(gòu)建納米金修飾層，制得AuNPs/CFME。

1.2.2 電化學測定電化學檢測均在CHI660D 型電化學工作站上進行，采用雙電極體系：以AuNPs/CFME 為工作電極，Ag/AgCl 為參比電極。循環(huán)伏安法（CV）實驗參數(shù)為：電位掃描范圍為-0.2～0.9 V；掃描速度0.1 V/s；采樣間隔0.01 V；靜置時間2 s。差分脈沖伏安法（DPV）實驗參數(shù)為：電位掃描范圍為-0.2～0.6 V；振幅0.05 V；脈沖寬度0.05 s；脈沖時間0.2 s；靜置時間20 s。整個實驗過程均在室溫下進行。

1.2.3 樣品預處理將獨一味膠囊的外殼去除，取其內(nèi)容物置于缽體中，研磨成細粉后，精密稱取5.00 g 藥粉，用50 mL 無水乙醇溶解后，超聲振蕩1 h，過濾后取上層清液制得樣品溶液，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs/CFME的制備及表征

圖2A 是制備的AuNPs 的TEM 圖，圖中可見AuNPs 粒子大小均勻，其平均粒徑約為13 nm。圖2B為AuNPs 溶膠的紫外-可見吸收光譜圖，在520 nm 處出現(xiàn)1 個特征吸收峰，為AuNPs 的特征吸收峰［24］，表明AuNPs 制備成功。圖2C、D 分別為CFME、AuNPs/CFME 的SEM 圖。由圖可知，未修飾的CFME 表面光滑平整，經(jīng)AuNPs 修飾后的電極表面吸附大量球狀納米顆粒，電極直徑略有增加，比表面積增大，表明CFME表面已成功鍵合AuNPs。

圖2 AuNPs的透射電鏡圖（A）、AuNPs溶膠的紫外-可見吸收光譜圖（B），以及CFME（C）和AuNPs/CFME（D）的掃描電鏡圖Fig.2 TEM image of gold nanoparticles（A），UV-Vis absorption spectrum of gold nanosol（B），SEM images of CFME（C）and AuNPs/CFME（D）

圖3A 為0.01 Hz～100 kHz 頻率范圍內(nèi)，CFME 和AuNPs/CFME 在含0.1 mol/L KCl 的5 mmol/L［Fe（CN）6］3-/［Fe（CN）6］4-溶液中的電化學阻抗譜（EIS），由圖可知，CFME 的轉(zhuǎn)移阻抗值（Rct）較大，為3.378×105Ω，AuNPs/CFME 修飾電極的Rct 小于CFME，為3.601×104Ω。表明AuNPs 已成功修飾在電極表面，AuNPs 降低了CFME 的界面阻抗值，主要原因可能是納米金粒子的納米效應及表面原子的空位效應使其具有良好的電催化活性，從而提高了電極表面的電子轉(zhuǎn)移速率。采用DPV法于1 μmol/L木犀草素溶液中考察了修飾電極的電化學行為（圖3B），曲線a為CFME在1 μmol/L PBS（pH 7.0）溶液中的DPV 曲線，曲線b和c分別為CFME 和AuNPs/CFME 在1 μmol/L 木犀草素溶液中的DPV 曲線。從圖中可以看出，木犀草素在CFME 表面于0.1 V左右出現(xiàn)1個氧化還原峰，峰電流值為1.948 nA，經(jīng)AuNPs修飾后，木犀草素的氧化峰電位略有正移，且峰電流值增至4.519 nA，約為CFME 電化學響應的2.3倍，表明AuNPs對木犀草素的氧化具有明顯的催化作用。

圖3 CFME和AuNPs/CFME在含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L［Fe（CN）6］3-/［Fe（CN）6］4-溶液中的電化學阻抗譜（A）；CFME在1 μmol/L PBS（pH 7.0）緩沖溶液中的DPV曲線（a），以及CFME（b）和AuNPs/CFME（c）在1 μmol/L木犀草素溶液中的DPV曲線（B）Fig.3 Nyquist diagrams of CFME，AuNPs/CFME in 5 mmol/L［Fe（CN）6］3-/［Fe（CN）6］4-containing 0.1 mol/L KCl（A）；DPV curve of CFME in 1 μmol/L PBS（pH 7.0）buffer solution（a），DPV curves of CFME（b）and AuNPs/CFME（c）in 1 μmol/L luteolin（B）

2.2 AuNPs/CFME電化學沉積時間的優(yōu)化

采用恒電位時間-電流曲線法，保持初始電位為1.5 V，將潔凈的CFME 置于10 mL AuNPs 溶膠中依次電沉積10、20、30、40、50 min（n=3）。結(jié)果顯示，在1 μmol/L 木犀草素溶液中，當AuNPs 的電沉積時間為30 min 時修飾電極的氧化峰電流達到最大，超過30 min 后，氧化峰電流略有下降?？赡苁怯捎陔S著電沉積時間的增加，AuNPs 在碳纖維電極表面不斷聚集，而時間過長則會導致電極表面修飾層脫落，從而降低其電催化活性。因此本實驗選擇最佳AuNPs電沉積時間為30 min。

2.3 掃速和pH值對氧化峰電流的影響

為闡明木犀草素在AuNPs/CFME 電極上的反應機理，以PBS 緩沖液（pH 7.0）為介質(zhì)，考察了1 μmol/L 木犀草素在不同掃速（10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mV/s）下的循環(huán)伏安圖。如圖4A所示，木犀草素的氧化還原峰電流隨掃速的增加而增加，且氧化峰電位隨掃速的增加逐漸正移，還原峰電位逐漸負移，峰電位差逐漸增大，表明木犀草素在修飾電極表面的氧化還原反應是一個準可逆過程，且可逆性隨掃速的增加逐漸變差。從圖4B 可以看出，在10～500 mV/s 范圍內(nèi)，木犀草素的氧化還原峰電流（Ip）與掃描速率（v，mV/s）成正比，其線性回歸方程為：Ipa（nA）=-0.174 3-0.009 1v（mV/s），r2=0.997 3；Ipc（nA）=0.121 9+0.006 8v（mV/s），r2=0.999 3。結(jié)果表明，木犀草素在AuNPs/CFME 電極上的氧化還原反應是吸附控制過程［25］。研究了峰值電流對數(shù)（logIp）與掃描速率對數(shù)（logv）之間的線性關系，得到線性方程為：logIp（nA）=-1.732+1.385 3 logv（mV/s），r2=0.992 6，斜率值為1.385 3，接近吸附控制的理論值1.0［26］。此外，考察了陽極（Epa）和陰極（Epc）峰值電位和掃描速率對數(shù)logv（mV/s）之間的線性關系，得到線性方程分別為：Epc（mV）= 195.7 × 10-3+50.858 × 10-3logv，r2= 0.996 0；Epa（mV）= 385.19 × 10-3-56.653 × 10-3logv，r2= 0.994 7。根據(jù)Laviron′s equation［27-28］，電子轉(zhuǎn)移系數(shù)（α）、電子轉(zhuǎn)移數(shù)（n）可通過下列方程計算：

圖4 AuNPs/CFME在1 μmol/L木犀草素溶液中于不同掃速下的CV圖（A），木犀草素的氧化還原峰電流與掃速的線性關系圖（B）Fig.4 Cyclic voltammograms of 1 μmol/L luteolin with AuNPs/CFME at different scan rate（A）；plot of the anodic and cathodic peak currents of luteolin versus the scan rate（B）

其中Eθ′、R、F 和T分別代表形式氧化還原電勢、理想氣體常數(shù)（8.314 J·mol-1·K-1）、法拉第常數(shù)（96 485 C·mol-1）、熱力學溫度（298 K）。根據(jù)上述方程可計算出α/（1-α）為0.9，接近于1，α和n的值分別為0.47和2.22，n值接近于2，表明木犀草素的電化學氧化過程有2個電子參與，與文獻報道的結(jié)果一致［29］。考慮到掃速過快會使充電電流變大，從而使基線噪音增加，因此后續(xù)實驗均在100 mV/s 掃速下進行。

采用不同pH 值的PBS 溶液配制1 μmol/L 木犀草素溶液，在pH 1.0～8.0 范圍內(nèi)考察pH 值對AuNPs/CFME 電極響應的影響。結(jié)果表明，pH 為1.0 時木犀草素的氧化還原峰值電流最大，因此選擇pH 1.0 的緩沖體系用于后續(xù)實驗。由于質(zhì)子參與了木犀草素的電極反應過程，隨著pH 值的增加，氧化峰電位負移，表明木犀草素的氧化是脫質(zhì)子反應。木犀草素的氧化峰電位（Ep）與pH 值呈線性關系，線性回歸方程為Ep（mV）= 522.11-58.29pH，r2= 0.994 8?；貧w方程斜率與能斯特方程計算的理論值-59.2 mV/pH 接近，表明參與電極反應的電子數(shù)和質(zhì)子數(shù)之比為1∶1，考慮到木犀草素的電子數(shù)n為2，因此木犀草素在AuNPs/CFME 上的電化學反應是雙質(zhì)子雙電子準可逆過程［30］。

結(jié)合以上實驗結(jié)果，木犀草素在AuNPs/CFME 上氧化還原反應的可能機理如圖5 所示，即木犀草素苯環(huán)上的3′，4′-二羥基取代基被迅速氧化成鄰苯醌基團，與文獻報道相符［31］。

圖5 木犀草素的氧化機理Fig.5 Mechanism of the oxidation of luteolin

2.4 AuNPs/CFME檢測木犀草素的線性關系與檢出限

最佳實驗條件下，pH 為1.0 的PBS 緩沖溶液中不同濃度木犀草素的DPV 曲線如圖6A 所示，其線性關系如圖6B～C所示。結(jié)果表明，當木犀草素的濃度在0.01～10 μmol/L范圍時，峰電流隨木犀草素濃度的增加而增加，且在0.01～0.10 μmol/L 和0.10～10 μmol/L 兩個范圍內(nèi)呈良好的線性關系，線性回歸方程分別為：Ip（nA）= 0.990 1c（μmol/L）+ 1.610 5，r2= 0.994 4；Ip（nA）= 0.135 4c（μmol/L）+1.748 8，r2=0.995 1。檢出限（LOD，S/N=3）為1.58 nmol/L。

圖6 不同濃度木犀草素的DPV曲線（A），0.10～10 μmol/L（B）與0.01～0.10 μmol/L（C）范圍內(nèi)木犀草素的氧化峰電流與濃度的線性關系曲線Fig.6 DPV curves at AuNPs/CFME in the solution of luteolin（A），linear relationship between oxidation peak current and concentration of luteolin in the range of 0.10-10 μmol/L（B）and 0.01-0.10 μmol/L（C）concentration of luteolin（curve a-t）：0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0 μmol/L

比較了AuNPs/CFME 與其他電化學傳感器對木犀草素檢測的線性范圍和檢出限，結(jié)果如表1所示，AuNPs/CFME具有較低的檢出限和較寬的線性范圍。

表1 不同修飾電極測定木犀草素的電化學性能比較Table 1 Comparison of the analytical performance of different modified electrodes for the determination of luteolin

2.5 干擾性與穩(wěn)定性

為了將AuNPs/CFME 應用于實際樣品測定，考察了檢測中可能存在的各種干擾物質(zhì)的影響。在10 000 倍濃度的Na+、K+、Cl-和1 000 倍SO42-存在的情況下，測定AuNPs/CFME 在1 μmol/L 木犀草素中的DPV 響應。結(jié)果顯示，Na+、K+、Cl-、SO42-的加入對木犀草素的檢測無明顯干擾（偏差＜5.0%），表明AuNPs/CFME 對木犀草素的測定具有良好的選擇性。采用新制的AuNPs/CFME 修飾電極連續(xù)10 次在1 μmol/L 木犀草素溶液中進行差分脈沖掃描，木犀草素的電化學響應降低＜5.0%。將修飾電極置于空氣中，連續(xù)10 d 進行相同實驗，木犀草素的氧化峰電流衰減較小，其氧化峰電流的相對標準偏差（RSD）降低＜5.0%，表明AuNPs/CFME修飾電極的電化學性能非常穩(wěn)定。

2.6 實際樣品分析

取10 μL獨一味樣品溶液，用pH 1.0的PBS緩沖溶液稀釋至10 mL，并向樣品溶液中添加一系列已知不同濃度的木犀草素標樣進行加標回收實驗。如表2所示，木犀草素的回收率為96.0%～104%，5次平行測定的RSD 均小于5.0%，表明該方法制備的AuNPs/CFME 修飾電極可用于實際樣品獨一味膠囊中木犀草素的檢測。

表2 獨一味膠囊中木犀草素的含量測定Table 2 Determination of luteolin in Kudo capsule samples

3 結(jié) 論

本文將納米金修飾在碳纖維超微電極表面構(gòu)建了AuNPs/CFME，用于木犀草素的檢測。在優(yōu)化實驗條件下，木犀草素的線性范圍為0.01～0.10 μmol/L 和0.10～10 μmol/L，檢出限為1.58 nmol/L，將其用于獨一味膠囊中木犀草素含量的測定，回收率為96.0%～104%。該傳感器靈敏度高、選擇性好、準確度高、線性范圍寬，為木犀草素在醫(yī)藥、食品等工業(yè)中的開發(fā)利用和深入研究提供了理論依據(jù)。