廖 輝，劉 林，戴先芝，趙文慧

（阿壩師范學(xué)院，四川汶川 623000）

汶川縣產(chǎn)茶歷史悠久，距今已有一千多年的歷史。水磨鎮(zhèn)是汶川縣南部的一個(gè)重要茶葉產(chǎn)地，2014年5 月成立水磨鎮(zhèn)二村溝茶葉種植專(zhuān)業(yè)合作社，其茶園種植面積達(dá)200 多hm2。水磨鎮(zhèn)位于北緯30°～31°、東經(jīng)102°～103°，海拔1 000 m，屬亞熱帶山區(qū)，河流廣闊，降雨量豐富，氣候宜人，空氣濕度相對(duì)較大，利于茶葉生長(zhǎng)[1-2]。

近年來(lái)，茶葉花青素成為研究熱點(diǎn)[3-5]。茶葉花青素具有很強(qiáng)的生物活性，可廣泛用于食品、飲料、醫(yī)藥、化工和紡織等行業(yè)。前人研究表明，茶樹(shù)芽葉顏色與花青素含量呈明顯的正相關(guān)?；ㄇ嗨睾颗c茶樹(shù)生長(zhǎng)環(huán)境關(guān)系密切，光照強(qiáng)有利于花青素的累積，強(qiáng)紫外光條件下，茶樹(shù)體內(nèi)新陳代謝也會(huì)促進(jìn)花青素的形成[4]?；ㄇ嗨厥侵匾纳锘钚匝a(bǔ)充劑，紅茶加工會(huì)導(dǎo)致茶葉花青素含量顯著減少，綠茶加工對(duì)茶葉花青素含量的影響不大[6]。

花青素提取大多采用有機(jī)溶劑提取方法，輔以超聲、微波、加壓或者酶解等可以提高花青素的提取率。徐燁等[7]采用微波與超聲處理花青素-多酚液態(tài)和固態(tài)模擬體系，闡釋微波與超聲處理對(duì)花青素-多酚相互作用呈色的影響機(jī)制。魏心源等[8]綜述了乙醇浸提法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法提取黑豆中花青素的研究進(jìn)展。張東方等[9]以茄子果實(shí)作試驗(yàn)材料，利用光譜儀掃描果皮獲取其光譜反射率，使用pH 示差法測(cè)量花青素含量。黃武等[10]在超聲輔助提取的基礎(chǔ)上，結(jié)合水浴浸提探究花生紅衣中原花青素的提取方法，用正交試驗(yàn)對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化。呂品等[11]利用香草醛法測(cè)定莽吉柿果殼原花青素的含量，借助響應(yīng)面法分析顯色條件，發(fā)現(xiàn)采用硫酸作為酸化介質(zhì)，體系的穩(wěn)定性較強(qiáng)；對(duì)測(cè)定影響最大的因素是硫酸濃度，其次是香草醛濃度，影響最小的是反應(yīng)溫度。

目前相關(guān)研究中大多是以酸性極性溶劑作為提取劑。國(guó)外學(xué)者Deineka 等[12]把從東方紫荊葉中提取的物質(zhì)，動(dòng)態(tài)固相純化后，在Agilent1200 上分離出花青素，考查酸/磷酸-水體系、乙腈和酸濃度對(duì)花青素色譜行為的影響。Huang 等[13]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法提取紅豆杉果實(shí)花青素，結(jié)果在“大紅1號(hào)”果皮中鑒定出17 種花青素，發(fā)現(xiàn)果實(shí)顏色變異與某幾種花青素含量相關(guān)。Li 等[14]用50% AcOHMeOH 提取劑從“香港紅山茶”的山茶科植物中提取鑒定了12 種花青素。王秋霜等[15]以80%乙醇、0.6%鹽酸為提取劑，利用超聲輔助從紅紫芽茶葉中提取分離到的花青素含量達(dá)3.782 5 mg·g-1；劉長(zhǎng)姣等[16]以0.8%鹽酸-50%乙醇水溶液作提取劑，通過(guò)水浴振蕩從黑米提取到的花青素含量為1.249 mg·g-1；李紹波等[17]用0.5%硫酸乙醇作提取劑，從紫甘薯中提取出3.671 6 mg·g-1的花青素?；ㄇ嗨睾繙y(cè)定常用pH 示差法、紫外分光光度法、高效液相色譜法。目前，水磨綠茶茶葉的花青素相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取并以超聲水浴作為輔助，設(shè)計(jì)了4 個(gè)單因素試驗(yàn)，并結(jié)合正交試驗(yàn)探討水磨綠茶中花青素的最佳提取條件，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定出花青素含量。

通過(guò)溶劑極性減少其他雜質(zhì)的浸出，并以1%鹽酸維持提取劑的酸性以保證花青素的穩(wěn)定性，同時(shí)使茶葉中的原花青素、花白素二者部分轉(zhuǎn)化成花青素，通過(guò)溶劑萃取法再次分離出提取液中的花青素，采用乙酸乙酯萃取出提取液中的咖啡堿、兒茶素等[18-19]，最終測(cè)得茶葉中的總花青素含量。已有的試驗(yàn)結(jié)果表明，使用甲醇提取能在提取過(guò)程中很大程度上減小除花青素以外的極性雜質(zhì)浸出對(duì)花青素純度的影響[5]，但甲醇的毒性大且揮發(fā)性強(qiáng)，秉著綠色生態(tài)理念，選擇乙醇作提取劑更好。此外，利用單純的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取的效果并不好，因?yàn)槠錆B透性較差，加入一定比例的蒸餾水作傳質(zhì)[5]反而起了很好的效果，因而在本試驗(yàn)中選擇酸性乙醇水溶液作提取溶劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣品：選取水磨鎮(zhèn)大二溝村4 月的綠茶茶葉（一芽二葉，烘干），粉碎，備用。

藥品：花青素（標(biāo)準(zhǔn)品）、矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷（CAS：7084-24-4，BZP0428）、鹽酸（AR）、無(wú)水乙醇（AR），均購(gòu)自四川西隴科學(xué)有限公司；乙酸乙酯（AR），購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

儀器設(shè)備：UV-1800PC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；JJ324BC 型電子天平；PS-100A 超聲清洗儀；880Y高速多功能粉碎機(jī)；蜀牛GG-17 抽濾瓶；SHB-Ⅲ循壞水式多用真空泵；TDZ6B-WS 臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 確定最大吸收波長(zhǎng)

準(zhǔn)確稱(chēng)量0.005 0 g 矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷（標(biāo)準(zhǔn)品），用無(wú)水乙醇、1%鹽酸、蒸餾水體積比為2∶1∶1的溶劑進(jìn)行溶解，并將其轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，定容，配制成0.10 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。在準(zhǔn)確移取1.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL 容量瓶中，定容。在240～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)光譜掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)確移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL 容量瓶中，加入無(wú)水乙醇、1%鹽酸、蒸餾水體積比為2∶1∶1 的溶劑定容，即得到6 個(gè)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在步驟1.2.1 所確定的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到線性回歸方程。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

乙醇濃度的選擇：準(zhǔn)確稱(chēng)量7 份1.2 g 綠茶樣品于250 mL 錐形瓶中，分別加入濃度為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的30 mL 乙醇溶液，15 mL 1%鹽酸，15 mL 蒸餾水，超聲水浴溫度60 ℃，提取時(shí)間25 min。抽濾、放置冷卻，乙酸乙酯萃取。以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，測(cè)定并記錄各澄清液的吸光度值。

料液比的選擇：準(zhǔn)確稱(chēng)量6 份1.2 g 綠茶樣品于250 mL 錐形瓶中，各加入料液比為1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50 的60%乙醇溶液、1%鹽酸與蒸餾水，三者的用量按照60%乙醇、1%鹽酸、蒸餾水體積比2∶1∶1 確定，超聲水浴溫度60 ℃，提取25 min。抽濾、放置冷卻，乙酸乙酯萃取。以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，測(cè)定并記錄各澄清液的吸光度值。

提取溫度的選擇：準(zhǔn)確稱(chēng)量6 份1.2 g 綠茶樣品于250 mL 錐形瓶中，各加入料液比為1∶40 的60%乙醇溶液、1%鹽酸和蒸餾水，三者的用量按照60%乙醇、1%鹽酸、蒸餾水體積比2∶1∶1確定，超聲水浴溫度分別設(shè)定為30、40、50、60、70、80 ℃，提取25 min。抽濾、放置冷卻，乙酸乙酯萃取。以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，測(cè)定并記錄各澄清液的吸光度值。

提取時(shí)間的選擇：準(zhǔn)確稱(chēng)量6 份1.2 g 綠茶樣品于250 mL 錐形瓶中，各加入料液比為1∶40 的60%乙醇溶液、1%鹽酸和蒸餾水，三者的用量按照60%乙醇、1%鹽酸、蒸餾水體積比2∶1∶1 確定，超聲水浴溫度60 ℃，提取時(shí)間分別設(shè)定為10、20、30、40、50、60 min。抽濾、放置冷卻，乙酸乙酯萃取。以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，測(cè)定并記錄各澄清液的吸光度值。

1.2.4 正交試驗(yàn)

以乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間等4因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化綠茶花青素提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

同1.2.1 的操作方法，在240～700 nm 波長(zhǎng)掃描，確定其最大特征吸收波長(zhǎng)為531 nm，并繪制矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷濃度范圍為0.000～0.024 mg·mL-1，得到其線性回歸方程：C＝0.019 8×A+0，相關(guān)系數(shù)R＝0.999 9，如圖1所示。

圖1 矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

式（1）中，C為回歸方程下的花青素濃度，g·L-1；V為提取劑體積，L；m為綠茶樣品質(zhì)量，kg。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，選擇70%乙醇濃度（見(jiàn)圖2），料液比1∶45 （見(jiàn)圖3），超聲水浴溫度為70 ℃（見(jiàn)圖4），超聲提取時(shí)間60 min （見(jiàn)圖5），花青素提取率高。

圖2 乙醇濃度對(duì)綠茶中花青素含量的影響

圖3 料液比對(duì)綠茶中花青素含量的影響

圖4 溫度對(duì)綠茶中花青素含量的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)綠茶中花青素含量的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取4 因素3 水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（見(jiàn)表1）。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

由表2 可知，影響綠茶中花青素提取含量的因素排序?yàn)椋毫弦罕龋疽掖紳舛龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間。提取條件：乙醇濃度70%，料液比1∶45，溫度70 ℃，時(shí)間60 min。平行測(cè)定三個(gè)樣，相對(duì)平均偏差為1.1%，測(cè)定出綠茶中花青素含量為0.460 3 mg·g-1。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

采用超聲水浴輔助-有機(jī)溶劑浸取的方式提取綠茶中的花青素，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其含量。篩選出較優(yōu)的提取條件為乙醇濃度70%，料液比1∶45，溫度70 ℃，時(shí)間60 min，提取到水磨綠茶中花青素含量為0.460 3 mg·g-1。與紅紫芽葉茶相比，水磨當(dāng)?shù)胤N植的綠茶中花青素含量偏低。要發(fā)展水磨綠茶產(chǎn)業(yè)，可從改良水磨當(dāng)?shù)鼐G茶的品種著手，有研究證明芽葉顏色深淺與花青素含量有著密切關(guān)系，開(kāi)發(fā)種植茶樹(shù)新品種，使其具有高含量的花青素，有利于水磨茶葉品質(zhì)改良。

茶產(chǎn)業(yè)帶來(lái)的效益推動(dòng)了當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展，除了通過(guò)打造茶旅融合、對(duì)外銷(xiāo)售的方式來(lái)促進(jìn)茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展外，還可以開(kāi)發(fā)茶葉深加工產(chǎn)品，發(fā)掘茶葉更大的價(jià)值，助推當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展。