胡 云， 陳中庸， 周芯吉， 劉美紅， 周 希,*

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210042； 2.南通大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南通 226019)

金屬銀作為工業(yè)社會(huì)的重要原料，被普遍用于制藥、電氣和航空航天等領(lǐng)域[1]。銀離子較易被生物體吸收，經(jīng)過食物鏈富集會(huì)對(duì)人體的免疫系統(tǒng)、消化和神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，是最具毒性的貴金屬離子之一[2]。根據(jù)我國(guó)新版生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，飲用水中Ag+含量不得高于0.05 mg/L，因此，對(duì)水體環(huán)境中Ag+檢測(cè)一直是熱點(diǎn)研究問題[3]。目前常規(guī)的Ag+檢測(cè)方法有原子吸收光譜測(cè)定法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法、電化學(xué)法等[4]。然而，這些方法涉及的儀器設(shè)備昂貴且樣品前處理過程繁瑣，限制了它們?cè)阢y離子快速檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，亟需開發(fā)一種簡(jiǎn)單高效且靈敏度高的銀離子檢測(cè)技術(shù)。近年來，碳量子點(diǎn)(別名碳納米點(diǎn)，CQDs)作為尺寸在10 nm以下具有光學(xué)性質(zhì)的新型碳基材料，可作為光學(xué)傳感器廣泛應(yīng)用于環(huán)境檢測(cè)、化學(xué)與生物傳感、食品分析等領(lǐng)域[5]。目前制備碳量子點(diǎn)的方法有電化學(xué)氧化法、微波輻照法、電弧放電法、水熱炭化法等[6]。碳量子點(diǎn)在制備過程中通常是由微波輻照、酸處理、電化學(xué)或加熱技術(shù)引發(fā)，從而形成共軛碳芯[7]。因此，發(fā)展低成本、簡(jiǎn)單易行且可大規(guī)模生產(chǎn)的制備技術(shù)成為碳量子點(diǎn)目前研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。池毓務(wù)團(tuán)隊(duì)[8]于2012年首次通過熱解檸檬酸合成了碳基熒光材料，得到具有顯著熒光效應(yīng)的碳量子點(diǎn)。Liu等[9]通過將秸稈粉碎處理后，在250 ℃條件下水熱反應(yīng)10 h，制得碳點(diǎn)并成功應(yīng)用于銅離子光學(xué)探針檢測(cè)。

木質(zhì)素是一種芳香族天然聚合物，在自然界中來源廣泛、儲(chǔ)量巨大且無毒[10-12]。木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中豐富的芳香基團(tuán)和較高的含碳量，被認(rèn)為是制備CQDs優(yōu)良的前驅(qū)體。本研究將木質(zhì)素磺酸鈣作為制備CQDs的主要原料，通過超聲波輔助處理及大分子自組裝得到具有光學(xué)性能的CQDs，探究木質(zhì)素及還原劑NaBH4濃度對(duì)CQDs熒光性能的影響，考察CQDs對(duì)Ag+的響應(yīng)識(shí)別性能及其細(xì)胞毒性，以期為將CQDs應(yīng)用于環(huán)境水體中Ag+濃度檢測(cè)及食品醫(yī)藥分析提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

木質(zhì)素磺酸鈣，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；pH值7.0磷酸緩沖溶液(0.1 mol/L，PBS)、NaBH4、硫酸喹啉、AgNO3、無水乙醇，二甲亞砜，均為市售分析純。超純水、Hela細(xì)胞，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)，西亞化學(xué)科技(山東)有限公司。胎牛血清(FBS)和DMEM達(dá)爾伯克細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

Nicolet IS50型傅里葉紅外光譜(FT-IR)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；JEM-2100 PLUS透射電子顯微鏡(TEM)，日本電子株式會(huì)社；Nano ZS ZEW 3600激光粒度測(cè)試儀，英國(guó)馬爾文公司；RS-5301熒光光譜儀和UV-2600i紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；UPHI 5700 Versa ProbeX射線光電子能譜(XPS)儀，日本UIVAC-PHI公司。

1.2 木質(zhì)素基碳量子點(diǎn)(CQDs)的制備

取20 mL無水乙醇，分別按質(zhì)量濃度10～100 g/L稱取木質(zhì)素磺酸鈣，加入并攪拌至完全溶解。隨后超聲波處理1 h，移入50 mL反應(yīng)釜中，在150 ℃溫度下反應(yīng)12 h，冷卻至室溫后，離心分離去除不溶物得到上清液。

在上述上清液中加入還原劑NaBH4(50 g/L)，室溫反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，利用截留分子質(zhì)量1 000 u透析袋將所得反應(yīng)液透析48 h除去鈣離子，最后冷凍干燥得到CQDs粉末。

按上述操作實(shí)驗(yàn)還考察了木質(zhì)素磺酸鈣質(zhì)量濃度60 g/L時(shí)，不同質(zhì)量濃度(10～100 g/L)還原劑NaBH4對(duì)CQDs的熒光強(qiáng)度的影響。

1.3 分析與表征

1.3.1激光粒度及TEM分析 先使用去離子水配制10 g/L CQDs溶液置于U型樣品池中，采用激光粒度測(cè)試儀對(duì)樣品粒徑進(jìn)行分析。將CQDs溶液滴于超薄碳膜表面，待自然風(fēng)干后采用透射電子顯微鏡觀察其形貌與尺寸，測(cè)試加速電壓200 kV。

1.3.2FT-IR分析 通過KBr壓片制得測(cè)試樣品，采用紅外光譜儀掃描樣品，波長(zhǎng)范圍500～4000 cm-1。

1.3.3XPS分析 通過光電子能譜儀考察CQDs表面化學(xué)組成與化學(xué)態(tài)，采用Al Kα射線(hv=1 340 eV)為X射線源，污染碳C1α(Ea=230 eV)為能量校正。

1.3.4紫外光譜分析 采用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)CQDs溶液進(jìn)行掃描，波長(zhǎng)范圍200～800 nm，掃描間隔為0.5 nm。

1.3.5熒光光譜分析 采用熒光光譜儀對(duì)CQDs溶液進(jìn)行掃描，掃描范圍200～600 nm，發(fā)射和激發(fā)光譜波長(zhǎng)分別為340～600 nm和200～425 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。

1.3.6熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定 采用參比法測(cè)定熒光量子產(chǎn)率。分別測(cè)定參比標(biāo)準(zhǔn)物硫酸喹啉(YQ為55%)和CQDs溶液在相同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光積分面積(I)和吸光度值(A)，再根據(jù)式(1)計(jì)算熒光量子產(chǎn)率(YCQDs)：

(1)

式中：YQ—硫酸喹啉熒光量子產(chǎn)率,55%；ACQDs、AR—CQDs和硫酸喹啉吸光度；ICQDs、IR—CQDs和硫酸喹啉熒光積分面積；nCQDs、nR—CQDs和硫酸喹啉溶劑折光率。

1.4 CQDs的應(yīng)用

1.4.1熒光光譜法測(cè)定Ag+采用PBS溶液配制0.05 g/L的CQDs溶液。取300 μL混合CQDs溶液、 1 200 μL AgNO3溶液(0～500 μmol/L)和1 500 μL超純水置于比色皿中混合，搖勻后在室溫下靜置5 min，隨后測(cè)定在340 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜，平行測(cè)定3次。按相同操作測(cè)定其他不同金屬離子(400 μmol/L)與CQDs混合溶液在340 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜。

1.4.2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 利用10%的胎牛血清(FBS)的DMEM細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)基中Hela細(xì)胞濃度調(diào)整至60 000個(gè)/mL，隨后按每孔100 μL(6 000個(gè)細(xì)胞)轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。隨后，除去上層清液，將培養(yǎng)液替換成200 μL CQDs溶液(質(zhì)量濃度分別為0.01、 0.05、 0.1、 0.5、 1.0 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h(對(duì)照組加入200 μL DMEM培養(yǎng)基)，去除CQDs溶液，并加入20 μL MTT溶液。在37 ℃、 5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)4 h后用150 μL二甲亞砜去除MTT并充分震蕩，然后于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組溶液吸光度。采用相同操作測(cè)定未加Hela細(xì)胞空白組的吸光度。細(xì)胞成活率(η)計(jì)算公式見式(2)。

η=(ACQDs-A0)/(Ac-A0)×100%

(2)

式中：ACQDs、A0、Ac—在490 nm處CQDs、空白組和對(duì)照組的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 CQDs制備工藝優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中考察了還原劑NaBH450 g/L條件下木質(zhì)素磺酸鈣的質(zhì)量濃度對(duì)CQDs熒光性能的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 木質(zhì)素磺酸鈣(a)和NaBH4(b)對(duì)CQDs熒光強(qiáng)度的影響

由圖可知，在木質(zhì)素磺酸鈣質(zhì)量濃度低于60 g/L時(shí)，隨著反應(yīng)過程中木質(zhì)素磺酸鈣質(zhì)量濃度增加，所得CQDs濃度增加，其熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到60 g/L時(shí)，其熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。當(dāng)木質(zhì)素質(zhì)量濃度高于60 g/L時(shí)，因?yàn)閮?nèi)濾效應(yīng)導(dǎo)致所得CQDs溶液熒光強(qiáng)度減弱。在木質(zhì)素磺酸鈣為60 g/L條件下，考察NaBH4質(zhì)量濃度對(duì)CQDs熒光性能的影響，結(jié)果亦見圖1。由圖可知，當(dāng)NaBH4質(zhì)量濃度低于50 g/L時(shí)，由于CQDs表面官能團(tuán)未被充分還原，使得其熒光強(qiáng)度較弱，當(dāng)NaBH4質(zhì)量濃度為50 g/L 時(shí)其熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。繼續(xù)提升NaBH4質(zhì)量濃度，由于CQDs表面含有的羥基、羧基等含氧官能團(tuán)解離程度發(fā)生改變，使得其熒光強(qiáng)度減弱。

2.2 CQDs的結(jié)構(gòu)分析

圖2 木質(zhì)素磺酸鈣(a)及其碳量子點(diǎn)(b)的紅外譜圖

圖3 木質(zhì)素基碳量子點(diǎn)的透射電鏡圖Fig.3 The TEM of CQDs

圖4 CQDs的XPS圖(a)及分峰圖(b)

2.3 CQDs的光學(xué)性質(zhì)

圖5 CQDs溶液的紫外吸收(a)與熒光激發(fā)(b)、發(fā)射(c)光譜圖Fig.5 The spectra of ultraviolet absorption(a), fluorescence excitation(b), and emission(c) of CQDs solution

通過紫外光譜和熒光光譜對(duì)CQDs的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5和圖6。由圖可知，曲線a在300及360 nm處有兩個(gè)明顯的紫外吸收峰，前者證實(shí)了源自木質(zhì)素磺酸鈣中多芳基發(fā)色團(tuán)存在，后者歸因于芳香族π結(jié)構(gòu)及含氧官能團(tuán)[6]。曲線b為發(fā)射波長(zhǎng)在450 nm處測(cè)得的激發(fā)光譜(激發(fā)波長(zhǎng)230～425 nm)，由圖可知最大激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm。曲線c為在340 nm激發(fā)光作用下的發(fā)射光譜，發(fā)現(xiàn)CQDs的最大發(fā)射波長(zhǎng)在432 nm。同時(shí)，通過參比法(以硫酸喹啉為參比物)得到該CQDs的YCQDs為12.4%。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)在310～400 nm之間變化時(shí)，對(duì)應(yīng)的CQDs熒光發(fā)射強(qiáng)度也隨之變化，表現(xiàn)出明顯的依賴于激發(fā)波長(zhǎng)變化的特性(圖6(a))。在激發(fā)波長(zhǎng)340 nm下測(cè)定不同pH值(用1 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)pH值)的CQDs溶液在432 nm處熒光強(qiáng)度變化情況(圖6(b))顯示：當(dāng)所得CQDs溶液pH值在1～8之間時(shí)，對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度隨pH值增大而增強(qiáng)。當(dāng)pH值處于8～10之間時(shí)，其熒光發(fā)射強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)且較穩(wěn)定，隨后熒光強(qiáng)度逐漸減弱。這主要是因?yàn)樵趶?qiáng)堿性環(huán)境下，生成的羧酸鹽會(huì)破壞CQDs表面鈍化層，從而使得熒光強(qiáng)度減弱；當(dāng)CQDs處于酸性條件下時(shí)，CQDs表面的羧基和羥基等含氧官能團(tuán)易形成氫鍵，誘導(dǎo)CQDs發(fā)生聚集并使得熒光猝滅[5]。

圖6 不同激發(fā)波長(zhǎng)下的CQDs熒光強(qiáng)度(a)及pH值對(duì)CQDs熒光強(qiáng)度的影響(b)

2.4 CQDs的應(yīng)用

圖7 不同濃度Ag+對(duì)CQDs熒光強(qiáng)度(a)與熒光猝滅強(qiáng)度比值(b)的變化圖

2.4.2CDQs對(duì)細(xì)胞的毒性檢測(cè) 低生物毒性是納米碳點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)之一，同時(shí)也是其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮關(guān)鍵作用的重要前提[12]。為了驗(yàn)證所制備CQDs良好的生物相容性和低毒性，通過MTT法檢測(cè)其對(duì)Hela細(xì)胞的生物毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著CQDs溶液質(zhì)量濃度(0、 0.01、 0.05、 0.1、 0.5和1.0 g/L)逐漸增加，Hela細(xì)胞存活率(分別為99%±2.95%、 94%±2.85%、 93%±2.65%、 92%±2.6%、 95%±2.5% 和90%±2.5%)并未發(fā)現(xiàn)有顯著的下降趨勢(shì)，甚至當(dāng)CQDs質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 g/L時(shí)，并未出現(xiàn)明顯抑制細(xì)胞活性的效果。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，該CQDs對(duì)Hela細(xì)胞無明顯生物毒性。

3 結(jié) 論

3.1以木質(zhì)素磺酸鈣為碳源，通過超聲波處理及大分子組裝，設(shè)計(jì)合成了一種具有熒光特性的水溶性碳量子點(diǎn)(CQDs)，通過FT-IR、XPS和TEM等確證結(jié)構(gòu)。紫外-可見光譜和熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：其最大發(fā)射波長(zhǎng)和最大激發(fā)波長(zhǎng)分別為432 nm和340 nm，且具有較高的熒光量子產(chǎn)率(12.4%)。

3.2不同質(zhì)量濃度Ag+溶液對(duì)CQDs熒光強(qiáng)度的影響規(guī)律：隨著Ag+濃度增加，CQDs熒光逐漸猝滅；在0～250 μmol/L范圍內(nèi)，Ag+濃度與CQDs熒光猝滅強(qiáng)度比值有良好線性關(guān)系(R2=0.998)，檢測(cè)限低至525 nmol/L。

3.3離子選擇性試驗(yàn)和細(xì)胞毒性測(cè)試表明：其他金屬離子對(duì)CQDs熒光猝滅作用較小，CQDs對(duì)Ag+熒光選擇性較高且無明顯細(xì)胞毒性，有望將其應(yīng)用于環(huán)境水體中Ag+濃度檢測(cè)及食品醫(yī)藥分析。