李佩珍，許建，朱優(yōu)秀，馮建新，江炎亮，張瀚元*

(1. 上海海洋大學(xué)， 水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水生動(dòng)物基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100141； 3. 河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院， 河南 鄭州 450044)

鯉(Cyprinuscarpio)是世界上淡水魚類中養(yǎng)殖范圍最廣的物種之一，目前有100多個(gè)國家和地區(qū)養(yǎng)殖[1]。中國是世界最大的鯉養(yǎng)殖和消費(fèi)國，2020年養(yǎng)殖產(chǎn)量289.7萬t，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中占有重要的地位[2]。黃河鯉具有金鱗赤尾、體型梭長、肉質(zhì)細(xì)嫩、氣味清香等特點(diǎn)，“豫選黃河鯉”新品種2005年通過全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會(huì)審定后，迅速在沿黃各地推廣開來，形成了年產(chǎn)數(shù)十萬噸的養(yǎng)殖規(guī)模，在沿黃地區(qū)漁民增收、產(chǎn)業(yè)增效和優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品供給等方面貢獻(xiàn)顯著。然而，由于長期自繁自養(yǎng)造成種質(zhì)退化，生長減慢，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖效益。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析是篩選分子輔助育種標(biāo)記的重要手段，對(duì)解析魚類生長等經(jīng)濟(jì)性狀的調(diào)控機(jī)制具有重要意義[3]，因此有必要借助魚類轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，系統(tǒng)解密魚類發(fā)育、生長等問題。目前已有大量研究通過分析多種不同魚類的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探究其生長性狀相關(guān)基因，并取得了一定成果，Sun等[4]利用RNA-seq鑒定了珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus×E.lanceolatus)腦和肝臟組織的差異表達(dá)基因并發(fā)現(xiàn)GH / IGF軸和下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的差異表達(dá)基因能夠潛在提高雜交種的生長優(yōu)勢。Fu等[5]對(duì)高體重組和低體重組鳙(Hypophthalmichthysnobilis)的肝臟、下丘腦-垂體軸進(jìn)行RNA-seq分析，分別鑒定出173和204個(gè)差異基因，其中9個(gè)基因位于生長相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL，quantitative trait loci)內(nèi)。Guan等[6]通過對(duì)鱖(Sinipercachuatsi)生長差異的個(gè)體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定出與生長速率相關(guān)的32個(gè)差異表達(dá)基因，功能主要涵蓋脂肪酸生物合成(fasn和acacb)、集合管酸分泌(atp6e和kcc4)、細(xì)胞周期(cdc20和ccnb)和胰島素樣生長因子(igfbp1)調(diào)控。然而關(guān)于鯉生長性狀相關(guān)基因的挖掘，目前主要通過全基因組關(guān)聯(lián)分析方法來篩選鯉生長性狀相關(guān)QTL和SNP。Peng等[7]通過構(gòu)建鯉高密度遺傳連鎖圖譜，運(yùn)用QTL定位和關(guān)聯(lián)分析方法鑒定出22個(gè)生長相關(guān)QTL，并確定了候選基因，包括kiss2、igf1、smtlb、npffr1和cpe。Feng[8]等通過限制性位點(diǎn)相關(guān)的DNA標(biāo)記和微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了長江鯉的高分辨率遺傳連鎖圖譜，檢測到21個(gè)生長相關(guān)性狀的QTL。陳琳[9]基于全基因組關(guān)聯(lián)分析和QTL方法，鑒定了parv、srpk2、fsrp5、igf1、igf3、grb10、igf1r、notch2、sfrp2等與鯉骨骼和個(gè)體生長相關(guān)的基因，鑒定了441個(gè)生長相關(guān)的SNP。因此有必要基于黃河鯉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探究其生長性狀相關(guān)基因，且研究發(fā)現(xiàn)黃河鯉生長性狀相關(guān)基因主要在其腦、肝臟和肌肉組織中表達(dá)。研究表明在硬骨魚類中，體重、體長等生長性狀與神經(jīng)激素調(diào)節(jié)密切相關(guān)，機(jī)體通過下丘腦-垂體-肝臟軸，調(diào)控生長激素和類胰島素生長因子軸(GH/IGF軸)分泌重要的信號(hào)因子，如生長激素(GH)、類胰島素生長因子1(IGF-1)和類胰島素生長因子2(IGF-2)等[10]，并通過血液循環(huán)作用于肝臟細(xì)胞表面的受體，最終促進(jìn)肌肉組織細(xì)胞的生長和分化[11]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，挖掘體重差異顯著的兩組黃河鯉腦、肝臟和肌肉組織中的差異表達(dá)基因，通過功能富集探究影響其生長性狀的功能基因和代謝通路，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因功能，為黃河鯉生長性狀的分子標(biāo)記輔助育種提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用黃河鯉采自河南省滎陽市王村鎮(zhèn)河南省大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系黃河鯉育種基地。選取同一家系中體重最低的5尾和體重最高的5尾，記錄體重(表1)。從高體重組和低體重組中，各選取3尾體重差異極顯著的個(gè)體，作為研究生長性狀遺傳差異的樣本。解剖采集其腦、肝臟及肌肉組織，裝入無RNA酶管，立即在液氮中冷凍，并放置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序和基因表達(dá)分析。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取、文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序

采集所選樣本的腦、肝臟及肌肉組織，分別在液氮中研磨，使用RNeasy Mini Kit試劑盒(Qiagen公司，中國)對(duì)上述樣本進(jìn)行RNA提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的質(zhì)量。對(duì)質(zhì)量檢測合格的RNA樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，每個(gè)樣本測序數(shù)據(jù)不少于6Gb。使用FastQC、Trimmomatic軟件去除轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中低質(zhì)量的序列，獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。

1.2.2 篩選差異表達(dá)基因

利用Bowtie2構(gòu)建Bowtie索引，使用Tophat2將過濾后的序列比對(duì)到鯉參考基因組[12]。利用Samtools對(duì)bam文件建立索引，用Cufflinks和Cuffmerge計(jì)算每個(gè)基因單位長度內(nèi)的表達(dá)片段數(shù)目(FPKM，F(xiàn)ragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)并生成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄本集合。將基因表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化，設(shè)置篩選參數(shù)為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR，false discovery rate)小于0.05和差異倍數(shù)(FC，fold change)大于2。用Cuffdiff鑒定差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，尋找各組織中的差異表達(dá)基因，用VennDiagram軟件包繪制韋恩圖。用ggplot2軟件包繪制腦、肝臟及肌肉組織差異表達(dá)基因火山圖，用pheatmap軟件包繪制腦、肝臟及肌肉組織差異基因聚類熱圖。

1.2.3 功能注釋和通路富集分析

得到候選基因列表之后，使用DAVID 6.8軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的功能注釋(GO，Gene Ontoloty)和通路富集分析(KEGG，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)。使用clusterProfiler軟件包構(gòu)建GO和KEGG富集分析圖；并使用Cytoscape軟件繪制基因互作網(wǎng)絡(luò)分析圖，展示差異表達(dá)基因富集到的GO通路和KEGG代謝通路之間的關(guān)系。

1.2.4 定量PCR驗(yàn)證

利用定量PCR方法對(duì)黃河鯉腦、肝臟和肌肉組織中的差異候選基因進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證方法為：從黃河鯉群體中，選取3尾低體重和3尾高體重個(gè)體，提取其腦、肝臟和肌肉組織的RNA，對(duì)總RNA純度和完整性進(jìn)行檢測，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備合成cDNA(Qiagen，中國)。使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)候選基因引物，內(nèi)參基因選用經(jīng)過驗(yàn)證的β-actin[13]，引物由Qiagen公司合成。定量PCR反應(yīng)總體系為15 μL，其中cDNA為1 μL，上下引物各0.3 μL，SYBR Green Master Mix(TOYOBO，日本)為7.5 μL，ddH2O為5.9 μL。每個(gè)基因的程序設(shè)置為95 ℃持續(xù)2 min，接下來是95 ℃持續(xù)15 s，59 ℃持續(xù)30 s，72 ℃持續(xù)1 min進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，熔解曲線為默認(rèn)條件，進(jìn)而完成定量PCR檢測。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，以P值小于0.05作為顯著差異水平，驗(yàn)證候選基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果是否一致。

表2 腦組織候選基因的定量PCR引物Tab.2 Quantitative PCR primers of candidate genes for brain tissue

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)

利用Illumina Hiseq 2500高通量測序系統(tǒng)(Illumina，美國)對(duì)所有樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，質(zhì)控和比對(duì)結(jié)果見表3。由表3可以看出，所有樣本的測序數(shù)據(jù)有效率平均值為98.34%，比對(duì)率平均值為76.58%。由以上數(shù)據(jù)可以得出，該轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量和比對(duì)率都較高，可為后續(xù)數(shù)據(jù)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供可靠的原始數(shù)據(jù)。

表3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控和比對(duì)結(jié)果Tab.3 Quality control and comparison results of transcriptome sequencing data

2.2 差異表達(dá)基因鑒定與分析結(jié)果

篩選高體重組和低體重組黃河鯉各組織的差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示，腦組織顯著差異表達(dá)基因6 519個(gè)，肝臟組織顯著差異表達(dá)基因499個(gè)，肌肉組織顯著差異表達(dá)基因19個(gè)，其中三個(gè)組織共表達(dá)基因1個(gè)(圖1)。分別對(duì)腦、肝臟、肌肉組織中所有差異表達(dá)基因和樣品進(jìn)行雙向聚類分析，結(jié)果表明，相關(guān)性較高，均一性較好(圖2)。對(duì)黃河鯉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生長性狀候選基因挖掘，分析發(fā)現(xiàn)，腦組織中有6 519個(gè)差異表達(dá)基因，剔除錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率或q值缺失基因后，有效差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)為6 385個(gè)，其中上調(diào)基因3 443個(gè)，下調(diào)基因2 942個(gè)(圖3 A)。肝臟組織中有499個(gè)差異表達(dá)基因，有效差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)為461個(gè)，其中上調(diào)基因275個(gè)，下調(diào)基因186個(gè)(圖3B)。肌肉組織中有18個(gè)差異表達(dá)基因，有效差異表達(dá)基因11個(gè)，其中上調(diào)基因6個(gè)，下調(diào)基因5個(gè)(圖3C)。

圖1 兩組黃河鯉差異表達(dá)基因的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of differentially expressed genes in two Cyprinus carpio groups

圖2 差異表達(dá)基因聚類熱圖注：A-腦組織；B-肝臟組織；C-肌肉組織,下同。Fig.2 Clustering heatmap of differential expression genes in different tissueNote: A- Brain tissue; B-Liver tissue; C-Muscle tissue,the same below.

圖3 黃河鯉生長性狀差異表達(dá)基因的火山圖注：紅色圓點(diǎn)表示顯著上調(diào)基因；藍(lán)色圓點(diǎn)表示顯著下調(diào)基因；灰色圓點(diǎn)表示差異不顯著的基因。Fig.3 The volcano plots of differentially expressed genes related to growth traits in Cyprinus carpioNote: Red dot means significantly up-regulated gene; blue dot means significantly down-regulated gene; gray dot means no significant difference gene.

2.3 功能注釋和富集分析結(jié)果

對(duì)腦、肝臟和肌肉組織中的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。圖4 A展示了腦組織KEGG富集結(jié)果，篩選出與黃河鯉生長性狀相關(guān)度較高的10個(gè)代謝通路，分別顯著富集在絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、鈣(calcium)信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用(extracellular matrix receptor interaction，ECM-receptor interaction)等信號(hào)通路。圖4B展示了肝臟組織KEGG富集分析結(jié)果，篩選出與黃河鯉生長性狀相關(guān)度較高的10個(gè)信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)胰島素(insulin)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、精氨酸和脯氨酸代謝(arginine and proline metabolism)通路、MAPK信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)(regulation of actin cytoskeleton)等通路與生長密切相關(guān)。由于肌肉組織顯著差異基因較少，未富集到相應(yīng)的KEGG通路。用Cytoscape繪制候選基因和通路之間的網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)，MAPK和Wnt信號(hào)通路均為富集到候選基因較多的代表性信號(hào)通路。根據(jù)文獻(xiàn)中脊椎動(dòng)物生長相關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)控模式和差異基因的功能，結(jié)合富集分析、網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果，在黃河鯉腦組織中初步篩選出13個(gè)參與調(diào)控生長性狀通路的候選基因，分別為mapk1、mapk7、mapk10、mapk12、wnt16、wnt8b、wnt10b、fgf13、fgf19、tgfbr2、notch2、ednra和lpl(表4)。其中，參與MAPK信號(hào)通路的有4個(gè)基因，分別為mapk1、mapk7、mapk10和mapk12基因。在網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果中，mapk1和mapk12是MAPK通路的節(jié)點(diǎn)基因，且mapk1基因在4個(gè)代表性通路中都發(fā)揮作用，表明mapk1基因可能在黃河鯉生長性狀中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。參與Wnt信號(hào)通路的有3個(gè)基因，分別為wnt16、wnt8b和wnt10b基因。在網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果中，wnt8b和wnt10b基因是Wnt信號(hào)通路的節(jié)點(diǎn)基因，且參與mTOR通路的調(diào)控。此外，參與成纖維細(xì)胞生長因子/成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor/ fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GF/FGFR)信號(hào)通路的有3個(gè)基因，分別為fgf13、fgf19和tgfbr2，以及參與Notch信號(hào)通路的notch2基因，參與內(nèi)皮素受體A(endothelin receptor type A，EDNRA)信號(hào)通路的ednra基因，和參與脂肪代謝的蛋白脂肪酶基因(lpl)。這些基因在高、低體重組黃河鯉中，表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。在黃河鯉肝臟組織中篩選出9個(gè)與生長性狀相關(guān)的基因，分別是fgf19、fasn、fgfr2、srebf1、acac、igf2、acod、fads6和acsl3；在黃河鯉肌肉組織中篩選出lpl基因與生長性狀密切相關(guān)。

圖4 差異表達(dá)基因的通路富集結(jié)果Fig.4 KEGG enrichment results of differentially expressed genes

2.4 qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果

通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測兩組生長差異顯著的黃河鯉腦、肝臟和肌肉組織的候選基因相對(duì)表達(dá)水平，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦組織部位的13個(gè)候選基因的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組預(yù)測趨勢相吻合，然而肝臟組織候選基因的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組預(yù)測趨勢差異較大，且肌肉組織候選基因數(shù)量太少，因此重點(diǎn)分析腦組織部位候選基因的相對(duì)表達(dá)量(圖6)。結(jié)果表明，腦組織中mapk1、mapk7、mapk10、mapk12、wnt16、wnt8b、wnt10b基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)，fgf13、ednra、notch2、tgfbr2、fgf19、lpl基因的表達(dá)量均顯著下調(diào)，這些基因qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表達(dá)趨勢相同，然而上調(diào)和下調(diào)程度有所差異。

圖5 生長性狀關(guān)鍵通路的基因互作網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig.5 Gene interaction network analysis diagram among key pathways related to growth traits

表4 黃河鯉生長性狀相關(guān)的13個(gè)候選基因信息Tab.4 Information of 13 candidate genes related to growth traits of Cyprinus carpio

圖6 黃河鯉腦組織候選基因qRT-PCR結(jié)果Fig.6 qRT-PCR results of candidate genes in brain tissue of Cyprinus carpio

3 討論

本研究基于兩組高、低體重的黃河鯉群體腦、肝臟、肌肉組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)生長性狀相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，研究發(fā)現(xiàn)雙向聚類分析可將表達(dá)譜相似的基因歸納成簇，不僅有助于推斷基因的功能，并且可以有效的發(fā)現(xiàn)基因之間存在的調(diào)控關(guān)系，如果高、低體重組中某樣本歸類錯(cuò)誤，說明該樣本數(shù)據(jù)出現(xiàn)問題，可信度不高，需要剔除。本研究雙向聚類熱圖分析結(jié)果顯示，高、低兩組黃河鯉群體的差異表達(dá)基因相關(guān)性較高，均一性較好?；鹕綀D分析結(jié)果可直觀、合理的篩選出兩樣本間的差異表達(dá)基因及其上調(diào)、下調(diào)水平。通過剔除log2FC或q值缺失基因后，火山圖分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)了腦、肝臟、肌肉組織中的有效差異表達(dá)基因。

在對(duì)腦、肝臟組織中差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析，基因主要富集在MAPK、Wnt、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、ErbB、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等與機(jī)體生長、發(fā)育、代謝、蛋白質(zhì)合成相關(guān)的信號(hào)通路。脊椎動(dòng)物中生長發(fā)育過程主要涉及MAPK、FGF/FGFR、Wnt、Notch、TGF、EDNRA等經(jīng)典信號(hào)通路。Dai等[14]通過研究青魚(Mylopharyngodonpiceus)在饑餓條件下的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在胰島素信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、內(nèi)吞作用和凋亡等信號(hào)通路。由于肌肉組織顯著差異基因較少，未富集到相應(yīng)的KEGG通路。候選基因和通路的網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示，MAPK和Wnt信號(hào)通路為富集到候選基因較多的代表性信號(hào)通路。

根據(jù)文獻(xiàn)中脊椎動(dòng)物生長相關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)控模式和差異基因的功能，結(jié)合富集分析、網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果，初步篩選出13個(gè)參與黃河鯉生長調(diào)控通路的候選基因。熒光定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)mapk1、mapk7、mapk10、mapk12表達(dá)水平上調(diào)，這與腫瘤細(xì)胞增殖[15-16]和斑馬魚(Daniorerio)[17]發(fā)育過程中MAPK家族基因表達(dá)趨勢一致，證明了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，說明MAPK家族基因在黃河鯉生長過程中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用。MAPK家族基因在不同物種中相對(duì)保守，是調(diào)節(jié)生長和新陳代謝的關(guān)鍵基因，參與水生動(dòng)物細(xì)胞的生長、增殖、分化、遷移和死亡等多種生理過程。其通過保守的三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，磷酸化底物蛋白或轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用[18]，且MAPK信號(hào)通路在胰島素樣生長因子1(Insulin-like growth factor 1，Igf1)受體的下游。通過Tian等[19]對(duì)鱸魚(Lateolabraxjaponicus)MAPK信號(hào)通路的研究可知，根據(jù)基因的磷酸化作用位點(diǎn)，可將MAPK信號(hào)通路分為三個(gè)亞家族，其中mapk1、mapk7基因?qū)儆诩?xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signalregulated protein kinase，ERK)亞家族，mapk10基因?qū)儆赾-Jun氨基末端激酶(JNK)亞家族，mapk12基因?qū)儆趐38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)亞家族。每個(gè)MAPK亞家族磷酸化靶蛋白底物的特定絲氨酸和蘇氨酸，并介導(dǎo)生物化學(xué)上不同的信號(hào)級(jí)聯(lián)，控制細(xì)胞對(duì)環(huán)境的反應(yīng)，并調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞生長和凋亡。

在本研究中，fgf13基因表達(dá)上調(diào)，這與Li等[20]在軸突再生中的研究結(jié)果一致，說明fgf13基因上調(diào)有助于發(fā)育。成纖維細(xì)胞生長因子13(fibroblast growth factor 13，fgf13)、成纖維細(xì)胞生長因子19(fibroblast growth factor 19，fgf19)基因?qū)儆贔GF家族，F(xiàn)GF家族基因在發(fā)育個(gè)體和成體組織中廣泛表達(dá)，在體內(nèi)和體外都具有各種生物學(xué)活性，包括血管生成、促有絲分裂、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生存、細(xì)胞趨性、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和組織損傷修復(fù)等[21]。FGF13是FGF家族的一種非分泌性蛋白，通過穩(wěn)定微管在皮質(zhì)神經(jīng)元的發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。然而，卻發(fā)現(xiàn)同屬于FGF家族的fgf19基因在高體重組黃河鯉中表達(dá)水平下調(diào)，這與Tomlinson等[22]研究結(jié)果相似，fgf19轉(zhuǎn)基因小鼠(Musmusculus)通過增加能量消耗降低體質(zhì)量。fgf19是一種由遠(yuǎn)端小腸分泌的激素，作用類同胰島素，可刺激肝臟蛋白質(zhì)和糖原合成，但不能促進(jìn)脂肪合成，可調(diào)節(jié)人體內(nèi)葡萄糖、脂質(zhì)和能量穩(wěn)態(tài)，具有減輕體重、增強(qiáng)胰島素敏感性等作用[23]。因此推測該基因表達(dá)下調(diào)，將有助于黃河鯉體重增長。

Wnt通路中的wnt8b、wnt10b、wnt16基因表達(dá)均上調(diào)，這與之前相關(guān)研究的結(jié)果吻合，Wnt信號(hào)通路在所有物種中都很保守[24]。研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)這些基因可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[25]、成骨細(xì)胞分化[26]，說明Wnt家族基因表達(dá)的上調(diào)，有助于體重增長。此外，發(fā)現(xiàn)生長快的黃河鯉群體，tgfbr2基因表達(dá)下調(diào)。tgfbr2基因即TGF-β II 型受體(transforming growth factor beta receptor II)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor beta，TGF-β)家族，是TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。已知tgfbr2基因在各種類型的癌癥中起到腫瘤抑制作用，如胃癌[27]和食管癌[28]，說明該基因過表達(dá)，將阻礙細(xì)胞增殖和分化。本研究中發(fā)現(xiàn)，ednra基因在高體重組黃河鯉中表達(dá)下調(diào)，這與Jacobs等[29]研究結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)miR-200c可通過下調(diào)ednra的表達(dá)調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲，說明ednra基因的過表達(dá)可阻礙細(xì)胞增殖。ednra基因廣泛地表達(dá)于動(dòng)物的心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道之中，與細(xì)胞增殖、血管收縮舒張、胃腸道動(dòng)力和腺體分泌等有密切的關(guān)系，在小鼠和斑馬魚之間高度保守[30]。Notch信號(hào)通路作為進(jìn)化上保守的信號(hào)通路，參與多種細(xì)胞發(fā)育過程[31]。根據(jù)腫瘤類型和細(xì)胞生長環(huán)境不同，Notch受體的激活可以致癌或抑癌[32]，本研究發(fā)現(xiàn)notch2基因的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)與黃河鯉體重增長有一定聯(lián)系。脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，lpl)基因是脂肪酶家族的一員，主要存在于脂肪和肌肉組織中，可在組織損傷、炎癥和腫瘤等細(xì)胞中可大量表達(dá)。雖然LPL蛋白和多肽生長因子結(jié)構(gòu)不同，但均可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性蛋白的合成，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活性蛋白與多個(gè)生長相關(guān)基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵上調(diào)元件結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞生長、分化和活動(dòng)。Goetzl等[33]研究發(fā)現(xiàn)lpl可介導(dǎo)溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)和1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)表達(dá)，而LPA和S1P的功能主要與生長有關(guān)，例如誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、改變細(xì)胞分化和存活狀態(tài)以及抑制細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)lpl基因在生長較快的黃河鯉腦組織中下調(diào)表達(dá)，這與以下研究結(jié)果相吻合，Richelsen等[34]研究發(fā)現(xiàn)生長激素可顯著減少肥胖女性腹腔內(nèi)脂肪組織的含量，同時(shí)使lpl活性降低約50%(P<0.01)。

綜上所述，本研究對(duì)體重差異顯著的兩組黃河鯉的腦、肝臟、肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，挖掘差異表達(dá)基因，鑒定與生長相關(guān)的候選基因和通路。最終在黃河鯉腦組織中篩選出13個(gè)與生長相關(guān)的候選基因和MAPK、Wnt、ErbB等信號(hào)通路。研究結(jié)果為深入挖掘黃河鯉生長性狀的分子調(diào)控機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)，為加速黃河鯉生長相關(guān)的分子輔助育種提供了研究依據(jù)。