廖春麗，袁 源，李紹沖，王泓云，梁家琪，趙 靜，楊 云，李冰冰

(1.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036；2.河南城建學(xué)院 河南省健康食品工程技術(shù)研究中心，河南 平頂山 467036；3.河南城建學(xué)院 河南省水體污染防治與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 平頂山 467036)

昆蟲(chóng)體內(nèi)的腸道微生物構(gòu)成了昆蟲(chóng)腸道的微生態(tài)體系，它們?cè)诶ハx(chóng)腸道內(nèi)定殖,完成生長(zhǎng)、代謝、增殖等全部生命活動(dòng)。昆蟲(chóng)腸道定居著大量的微生物，其與宿主在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中形成了緊密的互利共生關(guān)系[1-2]，影響著昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育，參與昆蟲(chóng)的消化、營(yíng)養(yǎng)吸收和繁殖，而且腸道細(xì)菌對(duì)信息素的產(chǎn)生、維生素的合成、殺蟲(chóng)劑的降解以及病菌的防御也有重要作用。鑒于昆蟲(chóng)腸道微生物的重要功能，相關(guān)研究已越來(lái)越受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者重視。

大蠟螟(Galleria mellonella)是昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)重要寄主之一，人們常利用大蠟螟幼蟲(chóng)對(duì)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)進(jìn)行分離、誘集和對(duì)昆蟲(chóng)致病力進(jìn)行測(cè)定[3]。可采用大蠟螟誘捕法分離韭菜土壤樣品中的線蟲(chóng)，從異小桿屬昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)腸道內(nèi)分離到具有較高殺蟲(chóng)活性的腸桿菌株NK，通過(guò)其形態(tài)、生理和生化特征，并結(jié)合16S rDNA序列分析等手段將其鑒定為新屬-腸桿菌屬(Enterobacter)[4]。

近年來(lái)，已有一些關(guān)于Bt殺蟲(chóng)蛋白對(duì)昆蟲(chóng)腸道細(xì)菌影響的研究報(bào)道。Broderick等[5-6]從舞毒蛾Lymantria dispar中腸中發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲(chóng)活性的發(fā)揮必須依賴(lài)于腸桿菌Enterobactersp.NAB3，并且還發(fā)現(xiàn)Bt活性與中腸微生物的關(guān)系因昆蟲(chóng)種類(lèi)而異。張浩等[7]發(fā)現(xiàn)腸道菌在Bt殺蟲(chóng)過(guò)程中對(duì)棉鈴蟲(chóng)起到保護(hù)作用。李振等[8]發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bt殺蟲(chóng)蛋白處理后二化螟幼蟲(chóng)中腸細(xì)菌群落的豐富度出現(xiàn)變化，推測(cè)可能與二化螟取食Bt殺蟲(chóng)蛋白有關(guān)。鑒于目前新屬-NK菌株(日溝維腸桿菌)殺蟲(chóng)蛋白對(duì)大蠟螟腸道細(xì)菌群落的影響狀況仍未清楚，因此研究取食NK菌株殺蟲(chóng)蛋白后大蠟螟幼蟲(chóng)腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)于明確大蠟螟腸道細(xì)菌與NK菌株殺蟲(chóng)蛋白之間的關(guān)系具有重要的意義。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于核酸序列分析的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用到昆蟲(chóng)的腸道微生物學(xué)研究中。細(xì)菌核糖體16S rDNA 基因可變區(qū)是此類(lèi)生物物種的特征核酸序列，可用來(lái)進(jìn)行細(xì)菌的分類(lèi)鑒定。本文采用高通量測(cè)序技術(shù)手段對(duì)未飼喂蛋白和飼喂不同時(shí)間蛋白的大蠟螟幼蟲(chóng)中腸細(xì)菌的16S rDNA 基因 V3-V4 區(qū)的PCR產(chǎn)物采集4個(gè)樣本，檢測(cè)其群落多樣性及群落結(jié)構(gòu)的變化，探討腸道細(xì)菌與昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌NK殺蟲(chóng)蛋白之間的關(guān)系，進(jìn)而為闡明昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌NK殺蟲(chóng)機(jī)制提供一定的借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 共生菌NK殺蟲(chóng)蛋白

從昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌NK胞內(nèi)提取純化殺蟲(chóng)蛋白(-80 ℃冷凍保存)。

1.1.2 供試?yán)ハx(chóng)

大蠟螟3齡幼蟲(chóng)(Galleria mellonella larvae)，于網(wǎng)上選購(gòu)。將3齡的大蠟螟幼蟲(chóng)，每個(gè)平板分裝15條，用含有0.2 mg/g濃度殺蟲(chóng)蛋白的飼料進(jìn)行投喂，飼喂3個(gè)不同時(shí)間段(36 h、48 h和60 h)作為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，編號(hào)分別為BG1、BG2、BG3，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行，同時(shí)用不含殺蟲(chóng)蛋白的飼料喂養(yǎng)大蠟螟幼蟲(chóng)作為空白對(duì)照組,編號(hào)為BG0。培養(yǎng)溫度25～30 ℃，濕度75%，避光。

1.2 方法

1.2.1 腸道的解剖與保存

選取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大蠟螟幼蟲(chóng)120條。在無(wú)菌操作條件下解剖出中腸，將中腸放入2 mL離心管中，每管放入40條幼蟲(chóng)的中腸，每個(gè)處理3管。離心管中提前放入0.7% 的生理鹽水500 μL，單管編號(hào)，放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 DNA的提取和 PCR擴(kuò)增

使用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(OMEGA，美國(guó))試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)提取大蠟螟幼蟲(chóng)腸道總基因組，并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提質(zhì)量，檢測(cè)合格后的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR接頭引物如表1所示，引物為Miseq測(cè)序平臺(tái)中細(xì)菌16S rDNA，V3-V4區(qū)通用引物。

表1 PCR擴(kuò)增時(shí)引物序列

PCR反應(yīng)的擴(kuò)增程序包含兩輪。第一輪擴(kuò)增：首先在94 ℃、 94 ℃、45 ℃、65 ℃溫度下，依次進(jìn)行 3 min、 30 s、20 s、30 s，共5個(gè)循環(huán)；然后在94 ℃、55℃、 72 ℃溫度下，依次進(jìn)行20 s、20 s、30 s，共20個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃條件持續(xù)延伸5 min。第二輪擴(kuò)增(引入Illumina橋式PCR兼容引物)：首先在94 ℃、94 ℃、55 ℃、72 ℃ 溫度下，依次進(jìn)行3 min、20 s、20 s、30 s，共5個(gè)循環(huán)，然后在72 ℃持續(xù)延伸5 min；最后將得到的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。濃度和特異性合格后送上海生工生物有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。上樣順序依次為BG0、BG1、BG2和BG3。

1.2.3 大蠟螟幼蟲(chóng)中腸微生物基因組高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

采用Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣品的16S rDNA V3-V4區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序。利用RDP、Silva、NCBI 16S數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)大蠟螟中腸細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)郝浞诸?lèi)?；贠UT的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，利用Mothur軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，包括反映樣品中群落豐富度的Chao1指數(shù)和觀測(cè)物種數(shù)(number of observed species)以及反映樣品中物種多樣性的Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蠟螟腸道DNA的提取和PCR擴(kuò)增

大蠟螟腸道DNA提取結(jié)果如圖1所示，圖1中4個(gè)不同處理組中1條帶存在輕微的降解與斷裂，不影響PCR擴(kuò)增的結(jié)果，其他2、3、4條帶明亮清晰，表明DNA含量豐富，符合PCR擴(kuò)增所需的濃度要求。大蠟螟腸道DNA16S rDNA V3-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物見(jiàn)圖2，經(jīng)電泳檢測(cè)均在600 bp左右出現(xiàn)明顯的條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符，且特異性良好，故直接用于高通量測(cè)序。

注：1、2、3、4分別代表BG0、BG1、BG2和BG3。

注：1、2、3、4分別代表BG0、BG1、BG2和BG3。

2.2 序列拼接組裝信息

大蠟螟幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌16S rDNA高通量測(cè)序基本信息見(jiàn)表2。

表2 大蠟螟幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌16S rDNA高通量測(cè)序基本信息

由表2可知：大蠟螟幼蟲(chóng)中腸腸道細(xì)菌 4個(gè)樣本(BG0、BG1、BG2和BG3)16S rRNA高通量測(cè)序共產(chǎn)生原始序列分別為71 722、67 559、65 549、63 200條；質(zhì)控拼接后得到優(yōu)質(zhì)序列分別為70 350、67 559、64 370、61 725條；基于97%的相似水平，大蠟螟幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌OTU聚類(lèi)分析分別獲得1 872、1 445、1 262和1 591個(gè)OTUs?；贠TUs的分類(lèi)結(jié)果，大蠟螟幼蟲(chóng)腸道樣本中細(xì)菌分屬于14、15、9、11個(gè)門(mén)，27、27、20、22個(gè)綱，41、33、31、39個(gè)目，58、58、45、56個(gè)科，71、80、57、84個(gè)屬。

2.3 大蠟螟腸道細(xì)菌的種類(lèi)組成及其豐度

大蠟螟幼蟲(chóng)腸道樣本在高通量測(cè)序的16S rDNA序列4個(gè)處理組注釋?zhuān)涸陂T(mén)、綱、目和科分類(lèi)階元水平上的微生物群落組成如表3所示。在門(mén)分類(lèi)階元上，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)細(xì)菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。在綱分類(lèi)階元上，芽孢桿菌綱(Bacilli)和γ-變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)細(xì)菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。在目分類(lèi)階元上，乳桿菌目(Lactobacillales)和腸桿菌目(Enterobacteriales)細(xì)菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。在科分類(lèi)階元上腸球菌科(Enterococcaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細(xì)菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌。當(dāng)然還有一些未注釋成功的。

表3 大蠟螟幼蟲(chóng)腸道內(nèi)在門(mén)、綱、目和科分類(lèi)階元上相對(duì)豐度(%)靠前的細(xì)菌

運(yùn)用Blast軟件對(duì)本次樣本的物種分類(lèi)進(jìn)行分析，在4個(gè)樣本屬的水平上共注釋到48個(gè)菌屬，如圖3所示。相對(duì)豐度靠前的細(xì)菌見(jiàn)表4。從圖3和表4可知：厚壁菌門(mén)中的腸球菌屬(Enterococcus)為優(yōu)勢(shì)菌，在4個(gè)處理組中所占比重分別為94.85%、48.02%、55.99%、48.94%；變形菌門(mén)中的腸桿菌屬(Enterobacter)為優(yōu)勢(shì)菌，在4個(gè)處理組中所占比重分別為1.00%、40.39%、19.54%、36.22%，其次變形桿菌屬、假單胞菌屬和鞘脂單胞菌屬等也占一定比重。

昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌NK胞內(nèi)殺蟲(chóng)蛋白的侵入不僅影響了屬的類(lèi)別，而且改變了不同菌屬間的數(shù)量。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組腸球菌屬的數(shù)量明顯降低，而實(shí)驗(yàn)組腸桿菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬的數(shù)量則明顯上升。由圖3和表4可知，昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌NK胞內(nèi)殺蟲(chóng)蛋白對(duì)大蠟螟中腸微生物的腸球菌屬、腸桿菌屬、變形桿菌屬、假單胞菌屬的數(shù)量影響最大。

基于OTU的樣本聚類(lèi)樹(shù)圖見(jiàn)圖4。根據(jù)圖4樣本間的距離可以看出，樹(shù)枝的長(zhǎng)度代表樣本間的距離，越相似的樣本會(huì)越靠近，反之越遠(yuǎn)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的樣本群落相似度相差甚遠(yuǎn)，而3個(gè)處理組的樣本群落相似性則較為接近，尤其是48 h和60 h處理組相似性最為接近，說(shuō)明用昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌胞內(nèi)殺蟲(chóng)蛋白飼喂大蠟螟會(huì)改變大蠟螟中腸微生物群落之間的相似性，并且飼喂時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大蠟螟中腸微生物群落之間的相似性相差越大。

圖3 不同處理二化螟幼蟲(chóng)中腸細(xì)菌物種注釋結(jié)果柱狀圖

表4 大蠟螟幼蟲(chóng)腸道內(nèi)在屬分類(lèi)階元上相對(duì)豐度(%)靠前的細(xì)菌

圖4 基于OTU的樣本聚類(lèi)樹(shù)圖

2.4 大蠟螟腸道細(xì)菌Alpha分析

Alpha多樣性指數(shù)評(píng)估可以反映樣本內(nèi)菌群的多樣性。選取觀測(cè)物種數(shù)、Chao1、Shannon、Simpson和Coverage 5個(gè)常用指數(shù)來(lái)分析大蠟螟腸道菌群的多樣性，見(jiàn)表5。觀測(cè)物種數(shù)和 Chao1(物種總數(shù)指數(shù)) 指數(shù)值越大，表示樣品中群落豐富度越高；Shannon 指數(shù)越高，Simpson指數(shù)越小，說(shuō)明樣品中的物種多樣性越高；Coverage表明樣品序列的覆蓋率，其值越大覆蓋越完全。由表5可知，大蠟螟腸道中細(xì)菌種類(lèi)均具有較高的豐富度和一定的多樣性，并且樣品序列的覆蓋率也很高。

表5 大蠟螟幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖5 大蠟螟幼蟲(chóng)腸道細(xì)菌OTUs的Rank-abundance曲線

和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中隨著飼喂殺蟲(chóng)蛋白時(shí)間越長(zhǎng)，其Chao1指數(shù)越小，表明昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)殺蟲(chóng)蛋白的侵入降低大蠟螟中腸微生物的物種總數(shù)；其Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，表明昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)殺蟲(chóng)蛋白的侵入增加大蠟螟中腸微生物的群落多樣性。但在BG3(60 h)樣本，物種總數(shù)又稍微升高，推測(cè)在60 h大蠟螟已經(jīng)死亡，微生物大量繁殖的結(jié)果；Shannon指數(shù)稍微降低，Simpson指數(shù)稍微變大，推測(cè)在60 h大蠟螟已經(jīng)死亡，起分解作用的微生物增加，降低群落多樣性。

Rank-abundance 曲線可以同時(shí)展現(xiàn)4個(gè)樣品中所含物種的豐富程度和均勻程度，見(jiàn)圖5。由圖5可知：大蠟螟腸道中的細(xì)菌組成豐富，因?yàn)槲锓N的豐富程度由曲線的橫軸長(zhǎng)度來(lái)反映，4個(gè)樣本曲線寬，說(shuō)明它們的物種組成豐富；但大蠟螟腸道中的細(xì)菌均勻度不高，因?yàn)槲锓N的均勻度由曲線形狀來(lái)反映，4個(gè)樣本曲線不平坦，說(shuō)明它們的均勻度不高，即存在一些豐度占比較高的細(xì)菌種類(lèi)。

3 結(jié)論與討論

以往關(guān)于腸道微生物的研究主要采用離體平板培養(yǎng)和克隆文庫(kù)法，且集中于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析方面[9]。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)為全面掌握腸道菌群結(jié)構(gòu)提供了強(qiáng)有力的分析手段。通過(guò)Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌16S rDNA序列，可系統(tǒng)分析大蠟螟幼蟲(chóng)腸道內(nèi)細(xì)菌的種類(lèi)多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成。

根據(jù)Alpha多樣性指數(shù)評(píng)估樣本內(nèi)菌群的多樣性，與對(duì)照組相比經(jīng)昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌NK胞內(nèi)蛋白飼喂的實(shí)驗(yàn)組，大蠟螟中腸細(xì)菌的物種總數(shù)減少，但實(shí)驗(yàn)組大蠟螟中腸微生物的群落多樣性增加，與對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌群腸球菌屬等相比，實(shí)驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)菌群則為腸球菌屬、腸桿菌屬和變形桿菌屬等?；贠TU的樣本聚類(lèi)樹(shù)圖和Rank-abundance 曲線可知：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，大蠟螟中腸微生物群落之間的相似性相差較大；大蠟螟腸道中的細(xì)菌組成豐富，但均勻度不高，即存在一些豐度占比較高的細(xì)菌種類(lèi)。

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組腸球菌屬所占比重明顯下降，說(shuō)明腸球菌屬在大蠟螟幼蟲(chóng)受到NK殺蟲(chóng)蛋白的影響后導(dǎo)致該菌比重降低。通過(guò)用抗生素和不用抗生素處理的無(wú)菌昆蟲(chóng)驗(yàn)證了煙草天蛾 Manduca sexta 和小菜蛾的腸道內(nèi)的腸球菌能部分降低 Cry1Ac 的殺蟲(chóng)活性[10]。舞毒蛾幼蟲(chóng)腸道內(nèi)共生的腸球菌也能降低蘇云金芽孢桿菌的殺蟲(chóng)活性[11]。由此推測(cè)NK殺蟲(chóng)蛋白能抑制腸球菌生存，同時(shí)腸球菌也能抑制NK殺蟲(chóng)蛋白活性，腸球菌屬作為大蠟螟中腸微生物的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群(比重占94.85%)對(duì)昆蟲(chóng)生理可能起到有益的作用，只有通過(guò)降低腸球菌比重，NK殺蟲(chóng)蛋白才能最終發(fā)揮殺蟲(chóng)功能，從而影響大蠟螟幼蟲(chóng)的生理活動(dòng)。

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組腸桿菌屬比重明顯增加，說(shuō)明大蠟螟幼蟲(chóng)腸道內(nèi)可能通過(guò)腸桿菌屬比重的增加，來(lái)適應(yīng)NK 殺蟲(chóng)蛋白的處理，也有可能這類(lèi)菌更能耐受有NK殺蟲(chóng)蛋白的腸道環(huán)境。同時(shí)腸桿菌屬中包含大量的沙門(mén)氏菌、志賀氏菌等條件致病菌，這些腸桿菌屬中的一些細(xì)菌對(duì)大蠟螟可能起著有害的作用，它們和NK殺蟲(chóng)蛋白共同影響大蠟螟幼蟲(chóng)的生理活動(dòng)。

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組新增了不動(dòng)桿菌屬、克呂沃爾氏菌屬這兩種新的菌屬。不動(dòng)桿菌屬是導(dǎo)致腸道感染的重要病原菌之一[12]，克呂沃爾氏菌屬是典型的條件致病菌屬，可見(jiàn)這兩種菌屬也會(huì)對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)造成危害，它們也和NK殺蟲(chóng)蛋白共同影響大蠟螟幼蟲(chóng)的生理活動(dòng)。

大蠟螟腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的變化可能與昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)共生菌NK胞內(nèi)殺蟲(chóng)蛋白的介入有關(guān)，從而為闡明它的殺蟲(chóng)機(jī)制提供一定的借鑒和參考。但是大蠟螟中腸優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落變化是助推還是抑制殺蟲(chóng)蛋白引起大蠟螟幼蟲(chóng)的死亡？還需要進(jìn)一步的探索。