楊兵坤， 張彥坤， 謝鵬飛， 張春暖， 徐世曉， 孫平*

(1. 河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽471003； 2. 中國科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧810008)

塑料制品因質(zhì)輕、防水、絕緣、耐用和抗腐蝕等優(yōu)點(diǎn)，在人類生產(chǎn)生活中得到廣泛應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年的塑料使用量不少于3.5×10t，塑料制品在自然環(huán)境下難降解，導(dǎo)致環(huán)境中的廢棄塑料越來越多(侯淼淼等，2020)。廢棄塑料如塑料袋、礦泉水瓶、一次性飯盒、廢棄漁網(wǎng)等在物理、化學(xué)或其他因素作用下分解成更小的塑料碎片或顆粒，其中直徑<5 mm的塑料碎片或顆粒被稱為微塑料(Thompson.，2004)。部分微塑料顆粒會隨降雨或地表徑流等進(jìn)入水環(huán)境，因其大小與浮游生物相似，而極易被水生生物誤食，如：微塑料會引起牡蠣、貽貝、鯡海鯛等消化道堵塞(Pascal & Patricia 2016；Rossana.，2016；Savoca.，2019)，導(dǎo)致這些動物的攝食率降低，嚴(yán)重時甚至引起個體死亡等(Saskia.，2016)。此外，被水生生物誤食的微塑料(Oliveira.，2013；Wright.，2013；Annika.，2016)還可以通過物理性損傷、載體效應(yīng)(如富集其他污染物)、生物積累與食物鏈傳遞等途徑產(chǎn)生一系列生態(tài)毒理效應(yīng)，如：行為毒性(如運(yùn)動能力下降、攝食能力降低)、生殖毒性(如生長發(fā)育緩慢、繁殖速度降低)、免疫毒性(如引發(fā)機(jī)體免疫炎癥)、氧化應(yīng)激(如造成機(jī)體氧化損傷)等(Moos.，2012；Julia.，2014；Rossana.，2016；Chen.，2017)。Ali等(2017)將斑馬魚幼魚暴露于聚苯乙烯微塑料環(huán)境中，其腸道過氧化氫酶(CAT)活性在暴露20 d時的表達(dá)量高于第10天；Wen等(2018)將七彩神仙魚暴露于70～80 μm聚苯乙烯微塑料環(huán)境 30 d后，發(fā)現(xiàn)其胰蛋白酶(TRY)活性顯著降低；Tang等(2020)將泥蚶暴露于30 μm微塑料環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)其溶菌酶(LZM)活性隨著微塑料濃度的升高而降低。因此，推測聚苯乙烯微塑料對劍尾魚的消化、抗氧化及免疫酶活性也存在一定程度的影響，預(yù)期可能會造成消化酶活性降低、抗氧化酶活性和免疫酶活性升高。

劍尾魚是一種小型熱帶淡水魚類，也是我國首個通過審定的淡水魚類實(shí)驗(yàn)動物，體型小、易飼養(yǎng)、繁殖力強(qiáng)、繁殖周期短、對多種重金屬毒物較敏感，可作為水環(huán)境監(jiān)測、水產(chǎn)藥物安全性評價、化學(xué)用品毒性檢測、動物疾病檢驗(yàn)及生態(tài)毒理學(xué)研究的模式魚類(吳淑勤等，2003)。關(guān)于微塑料對劍尾魚的毒效研究較少，因此本文以劍尾魚為實(shí)驗(yàn)對象，將其暴露于粒徑1 μm、5 μm及混合粒徑聚苯乙烯微塑料環(huán)境中72 h，測定腸道中消化酶、抗氧化酶和免疫酶活性，以期積累微塑料對魚類生物毒性數(shù)據(jù)，并為深入研究微塑料的毒理學(xué)影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

5月齡紅眼紅體雄性劍尾魚購自陜西紅劍尾魚養(yǎng)殖基地，于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)曝氣24 h的自來水中飼養(yǎng)與馴化。飼養(yǎng)與馴化過程中水體持續(xù)24 h曝氣及活性炭處理，氧溶解度≥5.7 mg·L。馴化及實(shí)驗(yàn)過程中保持水溫27 ℃±1 ℃，pH7.2～7.6，光周期 14 h L∶10 h D。每天 09∶00 和 17∶00 喂食，飼料投喂量為劍尾魚體質(zhì)量的3%，飼料購于深圳市寸金觀賞魚飼料有限公司。聚苯乙烯微塑料為粒徑1 μm與5 μm的球形單分散綠色熒光塑料微球，可均勻分散于水中，最大激發(fā)和發(fā)射波長為470 nm和526 nm，購于天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在實(shí)驗(yàn)室馴化2周后，選取顏色和體型相近、活潑健康的個體(體質(zhì)量1.63 g±0.29 g，體長5.6 cm±0.55 cm)作為實(shí)驗(yàn)動物，濃度設(shè)置參考微塑料環(huán)境濃度調(diào)查結(jié)果及其對水生生物的毒性效應(yīng)的研究方法(Watts.，2015；Yin.，2018)，試驗(yàn)共分為7組：M0組(無微塑料)、M1-1組(微塑料顆粒直徑：1 μm，濃度：1×10粒/L)、M1-2組(微塑料顆粒直徑：1 μm，濃度：1×10粒/L)、M2-1組(微塑料顆粒直徑：5 μm，濃度：1×10粒/L)、M2-2組(微塑料顆粒直徑：5 μm，濃度：1×10粒/L)、M3-1組(微塑料顆粒直徑：1 μm與5 μm按顆粒數(shù) 1∶1 混合，濃度：1×10粒/L)和M3-2組(微塑料顆粒直徑：1 μm 與5 μm按顆粒數(shù) 1∶1 混合，濃度：1×10粒/L)。每個處理組設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)10尾，共210尾。暴露前配制各組聚苯乙烯微塑料溶液，并進(jìn)行超聲波處理，確保微塑料顆粒均勻分布于水環(huán)境中，暴露期間的環(huán)境與馴養(yǎng)時保持一致，依據(jù)《化學(xué)品 魚類急性毒性試驗(yàn)GB/T27861-2011》(中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會，2012)暴露72 h，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至36 h時更換1/3提前曝氣及活性炭處理過的水，并添加相應(yīng)聚苯乙烯微塑料以維持暴露濃度。

72 h暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即使用MS-222麻醉劑麻醉，待魚無反應(yīng)后，用蒸餾水沖洗魚身3次，冰上解剖。每個重復(fù)中取3尾魚的腸道作為1個樣本，每個處理組6個平行樣本。剔除腸道外脂肪及內(nèi)容物，用生理鹽水沖洗后裝入已編號的凍存管中，放入液氮中速凍，-80 ℃保存。取出凍存管中的腸道置于稱量紙上準(zhǔn)確稱取其質(zhì)量并記錄，按照體積(mL)∶質(zhì)量(g)=9∶1 的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，隨后在冰水浴中對腸道組織進(jìn)行機(jī)械研磨，制成濃度為10%的組織勻漿，低溫高速離心(3 000 r·min，15 min)，取上清用于測定淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)、TRY、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)、CAT、丙二醛(MDA)、LZM和總蛋白活性。所有試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測定方法及原理參照試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果

2.1 1 μm聚苯乙烯微塑料對劍尾魚腸道消化酶、抗氧化酶和免疫酶活性的影響

隨著水環(huán)境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，AMS活性總體呈上升趨勢：M0組的AMS活性為(0.404 5±0.004 0) U·mg，M1-1組為(0.417 1±0.050 0) U·mg，未發(fā)生顯著變化(>0.05)，M1-2組為(0.430 9±0.007 8) U·mg，升高顯著(<0.05)。LPS活性顯著上升：M0組為(26.79±0.85) U·g，M1-1組和M1-2組顯著上升[(35.90±1.30) U·g和(49.26±1.83) U·g；<0.05]。TRY活性呈先上升后下降的趨勢：M0組為(850.05±69.23) U·mg，M1-1組顯著上升至(1 113.25±22.53) U·mg(<0.05)，M1-2組顯著下降為(969.67±16.66) U·mg(<0.05)，但仍高于M0組(圖1)。

隨著水環(huán)境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，SOD活性總體呈顯著下降趨勢：M0組為(122.46±3.75) U·mg，M1-1組和M1-2組顯著下降[(109.38±2.08) U·mg和(101.83±2.68) U·mg；<0.05]。GSH活性總體呈顯著下降趨勢：M0組為(83.08±3.19) U·g，M1-1組和M1-2組顯著下降[(65.63±1.90) U·g和(72.53±2.47) U·g；<0.05]。CAT活性總體呈上升趨勢：M0組為(18.47±0.49) U·mg，M1-1組和M1-2組顯著上升[(23.71±0.85) U·mg和(23.03±1.06) U·mg；<0.05](圖1)。

隨著水環(huán)境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，MDA活性總體呈上升趨勢：M0組為(5.66±0.11) nmol·mg，M1-1組和M1-2組顯著上升[(6.84±0.13) nmol·mg和(6.70±0.14) nmol·mg；<0.05]。LZM活性呈顯著上升趨勢：M0組為(244.85±12.89) U·mL，M1-1組和M1-2組顯著上升[(318.19±11.09) U·mL和(456.21±13.13) U·mL；<0.05](圖1)。

圖1 1 μm聚苯乙烯微塑料對劍尾魚腸道酶活性的影響Fig. 1 Effect of 1 μm polystyrene microplastic on intestinal enzyme activity of Xiphophorus helleri

2.2 5 μm聚苯乙烯微塑料對劍尾魚腸道消化酶、抗氧化酶和免疫酶活性的影響

隨著水環(huán)境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，AMS活性呈上升趨勢：M0組為(0.404 5±0.004 0) U·mg，M2-1 組為(0.436 5±0.010 5) U·mg，升高顯著(<0.05)，M2-2組為(0.505 8±0.005 6) U·mg，升高顯著(<0.05)。LPS活性呈顯著上升趨勢：M0組為(26.79±0.85) U·g，M2-1組和M2-2組顯著上升[(45.31±2.12) U·g和(50.13±1.79) U·g；<0.05]。TRY活性呈先上升后下降的趨勢：M0組為(850.05±69.23) U·mg，M2-1組顯著上升為(1 094.60±82.97) U·mg(<0.05)，M2-2組顯著下降為(1 023.27±28.79) U·mg(<0.05)，但仍高于M0組(圖2)。

隨著水環(huán)境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，SOD活性總體呈下降趨勢：M0組為(122.46±3.75) U·mg，M2-1組顯著下降至(95.99±1.66) U·mg(<0.05)，M2-2組顯著下降至(101.40±2.31) U·mg(<0.05)。GSH活性總體呈下降趨勢：M0組為(83.08±3.19) U·g，M2-1組和M2-2組顯著下降[(57.74±0.70) U·g和(55.25±1.03) U·g；<0.05]。CAT活性呈上升趨勢：M0組為(18.47±0.49) U·mg，M2-1組和M2-2組顯著上升[(21.01±0.66) U·mg和(23.08±0.61) U·mg；<0.05](圖2)。

隨著水環(huán)境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，MDA活性總體呈上升趨勢：M0組為(5.66±0.11) nmol·mg，M2-1組和M2-2組顯著上升[(6.83±0.90) nmol·mg和(6.82±0.71) nmol·mg；<0.05]。LZM活性呈顯著上升趨勢：M0組為(244.85±12.89) U·mL，M2-1組和M2-2組顯著上升[(359.55±6.44) U·mL和(476.67±9.14) U·mL；<0.05](圖2)。

圖2 5 μm聚苯乙烯微塑料對劍尾魚腸道酶活性的影響Fig. 2 Effects of 5 μm polystyrene microplastics on intestinal enzyme activity of Xiphophorus helleri

2.3 混合粒徑聚苯乙烯微塑料對劍尾魚腸道消化酶、抗氧化酶和免疫酶活性的影響

隨著水環(huán)境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，AMS活性總體呈上升趨勢：M0組為(0.404 5±0.004 0) U·mg，M3-1組和M3-2組上升[(0.441 2±0.008 9) U·mg和(0.457 4±0.009 5) U·mg；<0.05]。LPS活性呈先上升后下降的趨勢：M0組為(26.79±0.85) U·g，M3-1組顯著上升至(47.45±1.37) U·g(<0.05)，M3-2組下降至(53.93±1.24) U·g，仍顯著高于M0組(<0.05)。TRY活性呈上升趨勢：M0組為(850.05±69.23) U·mg，M3-1組顯著上升至(1 196.24±114.03) U·mg(<0.05)，M3-2組顯著上升至(1 020.18±45.34) U·mg(<0.05)，但仍高于M0組(圖3)。

隨著水環(huán)境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，SOD活性總體呈下降趨勢：M0組為(122.46±3.75) U·mg，M3-1組顯著下降至(105.53±3.08) U·mg(<0.05)，M3-2組下降至(109.01±1.68) U·mg(<0.05)。GSH活性總體呈下降趨勢：M0組為(83.08±3.19) U·g，M3-1組和M3-2組顯著下降[(72.83±0.73) U·g和(69.67±0.44) U·g；<0.05]。CAT活性呈上升趨勢：M0組為(18.47±0.49) U·mg，M3-1組和M3-2組顯著上升[(24.28±0.73) U·mg和(24.08±0.35) U·mg；<0.05](圖3)。

圖3 混合粒徑聚苯乙烯微塑料對劍尾魚腸道酶活性的影響Fig. 3 Effects of polystyrene microplastics with mixed particle sizes on intestinal enzyme activity of Xiphophorus helleri

隨著水環(huán)境中聚苯乙烯微塑料濃度的增加，MDA活性呈上升趨勢：M0組為(5.66±0.11) nmol·mg，M3-1組和M3-2組顯著上升[(6.51±0.94) nmol·mg和(6.56±0.12) nmol·mg；<0.05]。LZM活性呈上升趨勢：M0組為(244.85±12.89) U·mL，M3-1組和M3-2組顯著上升[(354.12±9.02) U·mL和(353.51±8.29) U·mL；<0.05](圖3)。

3 討論

3.1 不同粒徑微塑料對劍尾魚腸道消化酶活性的影響

在水生生物中，已經(jīng)證實(shí)消化速率會影響機(jī)體的消化吸收能力，而消化酶活性水平是反映機(jī)體消化速率和能量吸收的相關(guān)指標(biāo)(Gu.，2019)。其中,AMS、LPS和TRY分別參與碳水化合物、脂質(zhì)纖維素和蛋白質(zhì)的消化過程(Charlene.，2021)，在消化吸收過程中扮演重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)攝入不同粒徑微塑料后劍尾魚腸道消化酶活性均發(fā)生改變，1 μm粒徑組、5 μm粒徑組和混合粒徑組中AMS、TRY和LPS 3種消化酶活性的變化結(jié)果基本一致，其中5 μm粒徑組較其他暴露組對AMS活性影響更大，但差異不顯著，各粒徑組暴露結(jié)果顯示，低濃度組中TRY活性升高顯著，高濃度組中AMS和LPS活性升高顯著，推測可能是微塑料暴露粒徑越大、濃度越高對劍尾魚腸道消化吸收能力影響更顯著。已有研究表明，將銀魚幼魚暴露于粒徑<40 μm聚氯乙烯微粒的環(huán)境96 h后，其腸道TRY活性顯著升高(Romano.，2018)，機(jī)體的消化吸收能力降低，與本研究結(jié)果相似。而Gu等(2020)將大黃魚暴露于粒徑 100 nm、濃度 1.8×10粒/mL的聚苯乙烯微塑料環(huán)境中14 d后，與對照組相比，其腸道TRY活性顯著降低，但AMS和LPS活性沒有顯著變化，結(jié)果仍會引起機(jī)體消化系統(tǒng)紊亂。Huang等(2020)將孔雀魚暴露于粒徑40 μm聚苯乙烯微塑料環(huán)境中 28 d 后，其腸道AMS、TRY和LPS活性均降低，導(dǎo)致機(jī)體從食物中獲得能量儲備的能力下降。Wang等(2020)將貽貝在粒徑2 μm聚苯乙烯微球環(huán)境中暴露14 d后，與對照組相比，其AMS和LPS活性均被顯著抑制，導(dǎo)致機(jī)體消化能力下降。由此看來，無論消化酶活性是升高還是降低，不同粒徑和濃度微塑料暴露均會對機(jī)體消化吸收造成影響，而本研究中消化酶活性升高的原因可能是劍尾魚個體較小、腸腔狹窄，攝入的微塑料在消化道內(nèi)聚團(tuán)、堆積造成機(jī)械阻塞，產(chǎn)生虛假“飽腹感”，導(dǎo)致機(jī)體攝入營養(yǎng)和能量不足(Watts.，2015)。機(jī)體通過增加消化酶活性的方式來提高對食物的消化率，補(bǔ)償其能量攝入的不足，從而維持機(jī)體正常需要。但微塑料對消化吸收的影響僅用消化酶活性的變化無法系統(tǒng)闡釋，接下來會進(jìn)行更多的研究，如劍尾魚腸道組織切片及腸道微生物菌群分析等。

3.2 不同粒徑微塑料對劍尾魚腸道抗氧化酶活性的影響

機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化酶SOD、GSH和CAT等在抑制和分解自由基和預(yù)防氧化損傷等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Li LL.，2020)。已有研究表明，微塑料可以引起珊瑚、斑馬魚、貽貝、南美白對蝦、金魚等抗氧化酶活性的改變，從而誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激(Soares.，2020；Wang.，2020；Hsieh.，2021；Xu.，2021)。本實(shí)驗(yàn)中，5 μm粒徑組較其他暴露組對SOD和GSH活性影響更顯著，可能是該組劍尾魚腸道氧化損傷更嚴(yán)重。各暴露組中SOD和GSH活性顯著降低，CAT活性顯著升高，可能由于SOD和GSH是保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的內(nèi)源性抗氧化酶，具有協(xié)同作用，同時CAT活性增加以維持體內(nèi)抗氧化過程的動態(tài)平衡。Lei等(2018)將斑馬魚幼魚暴露于粒徑 0.1 μm、濃度1.5×10粒/L聚苯乙烯微塑料環(huán)境中，其GSH活性下降，推測微塑料暴露可能會導(dǎo)致機(jī)體能量代謝紊亂，誘發(fā)氧化損傷。Tang等(2018)將石珊瑚暴露于粒徑1 μm、濃度9×10粒/L聚苯乙烯微塑料環(huán)境中 12 h后，發(fā)現(xiàn)其SOD活性升高，機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激。而Carlo等(2015)將紫貽貝暴露于粒徑2 μm聚苯乙烯微塑料環(huán)境中，其SOD活性降低，且機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)出現(xiàn)過氧化損傷，這與本研究結(jié)果基本相似，抗氧化酶活性的改變表明微塑料的攝入確實(shí)會干擾到機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，當(dāng)面對環(huán)境中微塑料的脅迫時，機(jī)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)啟動，以抵御不良環(huán)境的刺激。但是微塑料暴露在腸道組織中誘導(dǎo)氧化損傷的詳細(xì)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

3.3 不同粒徑微塑料對劍尾魚腸道免疫酶活性的影響

MDA和LZM在非特異性免疫中起著至關(guān)重要的作用，被認(rèn)為是評價機(jī)體內(nèi)免疫狀況的重要指標(biāo)。MDA是機(jī)體內(nèi)重要的氧自由基的代謝產(chǎn)物，可間接反映細(xì)胞損傷程度(Xia.，2020)。而LZM由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，通過激活補(bǔ)體和巨噬細(xì)胞來清除病原菌(Liu.，2019)。在本研究中，5 μm粒徑組MDA和LZM的活性較其他 2組升高更顯著，可能是該組劍尾魚腸道免疫損傷更嚴(yán)重，但各粒徑組中MDA的結(jié)果未出現(xiàn)濃度效應(yīng)，表明在環(huán)境污染或不利條件下，生物體試圖通過免疫反應(yīng)來適應(yīng)相關(guān)的不良環(huán)境。淡水微藻在粒徑300 nm、濃度100 mg·L微塑料環(huán)境中，MDA活性顯著升高，并出現(xiàn)脂質(zhì)損傷(Li SX.，2020)，與本研究結(jié)果相似。大型蚤暴露于粒徑1 μm、濃度0.1 mg·L的聚苯乙烯微塑料環(huán)境中48 h后，MDA活性升高，并引起組織損傷(Zhang.，2019)。鯉魚暴露于粒徑6 μm、濃度 50 mg·L微塑料環(huán)境中60 d后，MDA活性顯著降低，相關(guān)基因表達(dá)量減少(Xia.，2020)。而將中華絨螯蟹暴露于粒徑 5 μm、濃度40 mg·L的微塑料環(huán)境中7 d、14 d、21 d后，LZM活性先升高后降低，出現(xiàn)酶活性被抑制的現(xiàn)象并引起毒性效應(yīng)(Liu.，2019)。本研究采用的 72 h 急性微塑料暴露實(shí)驗(yàn)中，尚未觀察到免疫酶活性先升高后降低的趨勢，下一步計(jì)劃采用短期和長期結(jié)合暴露實(shí)驗(yàn)，觀察是否會出現(xiàn)免疫酶活性先升高再降低的趨勢，并結(jié)合個體、組織、細(xì)胞和基因水平進(jìn)行測試，以便為進(jìn)一步研究微塑料的免疫毒性效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

在本研究中，5 μm粒徑組較其他暴露組對劍尾魚腸道消化酶、抗氧化酶及免疫酶活性影響更大，但差異不顯著。不同粒徑聚苯乙烯微塑料均會影響消化酶、抗氧化酶及免疫酶活性的表達(dá)，以此干擾劍尾魚對食物的消化和能量的吸收，并對腸道的抗氧化能力和免疫能力造成影響。