李靜浩，孫光偉，白 森，馬俊桃，楊艷華，孫敬國，陳振國*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.湖北省煙草科學(xué)研究院，湖北 武漢 430030；3.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，廣西 南寧 530001）

煙葉耐烤性是煙葉重要烘烤特性之一，指煙葉在變黃、定色期對環(huán)境的耐受程度，耐烤性好的煙葉表現(xiàn)為容易定色、烤后黑糟雜色煙葉少［1］。因此，明確煙葉耐烤性的判斷指標(biāo)對烘烤工藝的設(shè)計以及煙葉烤后質(zhì)量的提升具有重要意義。煙葉耐烤性與其營養(yǎng)積累、成熟過程密切相關(guān)，例如鮮干比大于9.0的煙葉往往難以定色［2］，成熟過程較為緩慢的煙葉大多耐烤性較好，落黃衰老較快的煙葉耐烤性一般較差［3］。成熟度也是影響煙葉耐烤性的主要因素，成熟度適宜煙葉的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等保護(hù)酶活性較高，多酚氧化酶（PPO）活性較低，在烘烤過程中不易發(fā)生棕色化反應(yīng)［4］。由于大田期的管理措施不當(dāng)，煙葉因氣候等因素影響產(chǎn)生的黑暴煙，以及感染病毒病、葉斑病等的煙葉，往往也會因為PPO活性較高而表現(xiàn)出較差的耐烤性［5］。通過大量的基礎(chǔ)研究，研究人員們提出了以變褐時間［6］、變褐指數(shù)［7］、PPO活性等指標(biāo)來判斷煙葉的耐烤性，制定出相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［8］，也揭示出耐烤性差的煙葉容易在烘烤過程中因酶促棕色化反應(yīng)而發(fā)生褐變。而PPO作為煙葉酶促棕色化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，其活性與煙葉耐烤性之間存在密切關(guān)聯(lián)［9-10］。但是PPO能否與多酚類物質(zhì)接觸并發(fā)生反應(yīng)受到煙葉細(xì)胞膜完整性、含水率等多個因素影響［9，11］。組織電導(dǎo)率常作為衡量細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于種子活力測定和植物抗逆性研究［12-14］。植物組織電導(dǎo)率，相比于丙二醛（MDA）等反映細(xì)胞膜透性的指標(biāo)而言，具有檢測快速、低成本的特點，烤煙在烘烤過程中的細(xì)胞膜完整性可通過測定電導(dǎo)率來動態(tài)監(jiān)測。本研究對2個品種烤煙的烘烤特性及其在烘烤過程中的生理生化指標(biāo)變化進(jìn)行測定，分析電導(dǎo)率與其余生理生化指標(biāo)間的關(guān)聯(lián)，探究了煙葉組織電導(dǎo)率與其耐烤性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2019~2020年在湖北省煙草科學(xué)研究院利川柏楊實驗基地進(jìn)行，供試品種為云煙87和K326，土壤為沙壤土，有機(jī)質(zhì)為2.32%、pH值為5.77、速效氮90.00 mg/kg、有效磷58.63 mg/kg、速效鉀125.00 mg/kg。依照優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程進(jìn)行大田管理。

1.2 試驗方法

按照宮長榮等［1］正常采收云煙87和K326適熟煙葉，進(jìn)行烘烤特性試驗和烘烤試驗。烘烤特性試驗在常溫下進(jìn)行，每隔24 h觀察煙葉顏色變化情況，并取樣測定電導(dǎo)率；烘烤試驗采用小型電烤箱依照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)烘烤工藝進(jìn)行掛桿烘烤，分別于烤前和烤后關(guān)鍵溫度點（鮮樣、38、40、42、44、48、54℃）末期取樣，切去葉尖和基部各1/3區(qū)域，留中部用于對相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3 測定項目及方法

烘烤特性測定方法［8］：煙葉采收后，2個品種煙葉各選取素質(zhì)相近的15片，每12 h觀察1次，記錄2個品種煙葉的變黃、變褐程度，并計算變黃指數(shù)（YI）、變褐指數(shù)（BI）。

式（1）中，n為觀察記錄次數(shù)，Y為煙葉平均變黃比例，YI值越小，說明此煙葉易烤性越好；YI值越大，說明該煙葉易烤性越差。

式（2）中，n 為觀察記錄次數(shù)，B為煙葉平均變褐比例，BI值越小，說明此煙葉耐烤性越好；BI值越大，說明該煙葉耐烤性越差。

電導(dǎo)率測定方法［15］：使用8 mm孔徑打孔器，在煙葉主脈兩側(cè)的葉尖、葉中、葉基對稱取0.1 g葉片組織（避開支脈），在裝有10 mL雙蒸水的試管中浸泡3 h，使用GTCON30型便攜式電導(dǎo)率儀測定浸出液電導(dǎo)率，將試管置于100 ℃水浴鍋中10 min，冷卻至室溫后，測定絕對電導(dǎo)率，然后計算相對電導(dǎo)率。計算見公式（3）。

SOD、POD、CAT、PPO活性和MDA含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

煙葉烤后依照國標(biāo)對煙葉進(jìn)行分級，并稱重計算不同色組煙葉比例［16］。

1.4 統(tǒng)計處理

使用Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計及作圖，采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烘烤過程中煙葉電導(dǎo)率與MDA含量的變化

由圖1可知，烘烤過程對煙葉來說也是一種逆境，在逆境狀態(tài)下，煙葉細(xì)胞膜透性逐漸增大，電解質(zhì)外滲，致使電導(dǎo)率升高。2種煙葉烘烤過程中浸出液電導(dǎo)率變化趨勢相同，在烘烤過程中大致呈“S”型曲線上升。2個品種鮮煙葉的浸出液電導(dǎo)率、絕對電導(dǎo)率相似，而K326煙葉的相對電導(dǎo)率略高于云煙87。隨著烘烤進(jìn)行，2個品種煙葉的浸出液電導(dǎo)率在42~44 ℃之間增長幅度最大，K326煙葉的相對電導(dǎo)率從烘烤開始至40 ℃的增幅明顯大于云煙87，云煙87煙葉的相對電導(dǎo)率則在40~44 ℃期間出現(xiàn)較大增長。并且K326烤中各階段的浸出液電導(dǎo)率、相對電導(dǎo)率總是高于云煙87，但是在38、40 ℃時云煙87的絕對電導(dǎo)率較高。

圖1 烘烤過程中煙葉電導(dǎo)率與MDA含量的變化

丙二醛（MDA）是細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其含量與電導(dǎo)率可反映細(xì)胞膜受損程度和細(xì)胞衰老程度。K326鮮樣的丙二醛（MAD）含量稍低與云煙87，但是在烘烤過程中K326的丙二醛含量及上升速度高于云煙87，即K326在烘烤過程中細(xì)胞膜脂過氧化速度快于云煙87。尤其是在40~42℃階段，K326的浸出液電導(dǎo)率、丙二醛含量升高速度均高于云煙87。

2.2 烘烤過程中耐烤性相關(guān)酶活性的變化

由圖2可知，2種煙葉在烘烤過程中SOD、POD、CAT這3種抗氧化酶活性變化大致表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。SOD是清除活性氧的關(guān)鍵酶，其可將多種活性氧歧化為H2O2，云煙87的SOD活性高峰在38 ℃，而K326則出現(xiàn)在42℃，并且K326的SOD活性下降較快。POD、CAT可催化H2O2分解為對細(xì)胞無害的物質(zhì)，其中K326的POD活性總體要高于云煙87，并且其活性高峰出現(xiàn)在40 ℃，而云煙87的POD活性高峰則出現(xiàn)在42 ℃，在48 ℃之后，2種煙葉的POD活性均快速下降。云煙87的CAT活性呈現(xiàn)先下降后上升再下降的規(guī)律，并且這2種煙葉的活性高峰均出現(xiàn)在42 ℃。

圖2 烘烤過程中煙葉SOD、POD、CAT和PPO活性的變化

煙葉的PPO被認(rèn)為是一種與煙葉自身耐烤性密切相關(guān)的酶，正是由于煙葉中多酚類物質(zhì)被PPO氧化為醌類，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為黑色素才造成了煙葉褐變，使煙葉表現(xiàn)出較差的耐烤性。2種煙葉烘烤過程中的PPO活性差異較大，K326的PPO活性一直要高于云煙87。并且K326煙葉的PPO活性呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，在40 ℃時PPO的活性最高；云煙87的PPO活性則呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，38 ℃時的活性最高。

2.3 煙葉耐烤性比較

由圖3、表1可知，在烘烤特性試驗下，2個品種煙葉的變黃變褐規(guī)律相似，變黃速率均為先快后慢，前24 h變黃最快；變褐速率均為先慢后快再減緩。但云煙87的變黃速度相對較快，變黃時間為60 h；K326變黃相對緩慢，變黃時間為84 h；云煙87、K326的變褐指數(shù)分別為0.72、1.36，而且K326在變黃未達(dá)十成的時候就已經(jīng)開始變褐。云煙87相比K326延遲大約12 h才開始出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，在褐變開始之后的48 h內(nèi)，云煙87褐變速度較慢，且K326的烤后雜色煙葉比例較高，說明云煙87的耐烤性較好，K326的耐烤性較差。

表1 2種煙葉的變褐指數(shù)與烤后外觀質(zhì)量

圖3 2種煙葉變黃、變褐程度比較

2.4 烘烤過程中各生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析

由表2可知，2種煙葉的浸出液電導(dǎo)率、絕對電導(dǎo)率、相對電導(dǎo)率之間存在顯著或極顯著的正相關(guān)關(guān)系，并且這3種電導(dǎo)率指標(biāo)與MDA也呈極顯著的正相關(guān)。在云煙87煙葉中，3種電導(dǎo)率指標(biāo)與SOD、POD、CAT、PPO活性的相關(guān)性不顯著，但SOD活性與PPO活性呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性。在K326煙葉中，滲出液電導(dǎo)率、絕對電導(dǎo)率與PPO活性極顯著負(fù)相關(guān)。

表2 2個品種煙葉烘烤過程中各生理指標(biāo)間的相關(guān)性

3 討論

隨著烘烤的進(jìn)行，煙葉的丙二醛含量呈現(xiàn)上升趨勢，而丙二醛作為細(xì)胞膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，其含量的上升說明煙葉細(xì)胞膜正在分解［17-19］，從而致使煙葉細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)外滲，電導(dǎo)率升高，即電導(dǎo)率指標(biāo)在煙葉烘烤過程中可以反映煙葉細(xì)胞膜的完整性。本試驗研究結(jié)果表明，38、40 ℃時K326的相對電導(dǎo)率、滲出液電導(dǎo)率、MDA含量大于云煙87，而絕對電導(dǎo)率小于云煙87，說明滲出液電導(dǎo)率、相對電導(dǎo)率反映煙葉細(xì)胞的完整性更為合適；云煙87相比于K326變黃更快，在變黃前、中期色素降解量較大，所以煙葉絕對電導(dǎo)率在一定程度上可能反映了煙葉細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的分解和衰老程度［15］。

國內(nèi)外一些學(xué)者的研究結(jié)果表明，POD與PPO是引起植物組織褐變的關(guān)鍵酶類［20-22］，這是由于POD在清除H2O2的過程中，會同時將酚類物質(zhì)作為底物而氧化，而PPO則會直接氧化多酶類物質(zhì)。而綠原酸作為煙草中多酚類物質(zhì)之一，其可作為POD、PPO這2種酶的底物而引發(fā)煙葉褐變［23］。本試驗的研究表明，在變黃期，K326的POD、PPO活性均高于云煙87，且K326煙葉的細(xì)胞膜被破壞程度較大，酚類物質(zhì)與PPO、POD接觸過早，致使其烤后雜色煙葉比例較高，耐烤性相比于云煙87較差。因此，在實際烘烤作業(yè)中，POD活性適當(dāng)降低，對阻止煙葉的酶促褐變有利，這一點與岳誠等［24］的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

煙葉的烘烤特性與其烘烤過程中生理生化指標(biāo)的變化密切相關(guān)，僅憑某種單一指標(biāo)難以判斷煙葉的烘烤特性。研究結(jié)果表明，煙葉滲出液電導(dǎo)率和相對電導(dǎo)率與煙葉細(xì)胞膜的完整性關(guān)系密切，可作為判斷煙葉耐烤性的指標(biāo)之一，并可與其POD、PPO活性相結(jié)合來判斷煙葉的耐烤性，同時煙葉的絕對電導(dǎo)率可能與煙葉細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的分解和衰老程度在著一定聯(lián)系。在實際烘烤過程中，可根據(jù)煙葉自身特點，適當(dāng)調(diào)整烘烤工藝，在變黃期盡量維持煙葉細(xì)胞膜的完整性，避免煙葉滲出液電導(dǎo)率和相對電導(dǎo)率大幅增長，以此降低烤后雜色煙葉比例，提升烘烤質(zhì)量。