陳中釤，杜文麗，許端祥，高 山*，林碧英

（1.福州市蔬菜科學(xué)研究所，福建 福州 350111；2.福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福建 福州 350002）

近年來，隨著全球氣候變暖，極端高溫天氣頻發(fā)，高溫?zé)岷σ殉蔀橛绊懽魑锷L的一個重要環(huán)境因子［1］，苦瓜（Momordica charantia L.）性喜溫暖，較耐熱而不耐寒，但不同苦瓜種質(zhì)資源耐熱能力差異明顯，對于育種工作者而言，快速、準(zhǔn)確地開展苦瓜種質(zhì)資源耐熱性的鑒定和評價，能有效地減少育種盲目性，提高育種效率，縮短育種周期。因此，開展苦瓜種質(zhì)資源耐熱性鑒定和評價具有十分重要的意義。目前，已有學(xué)者從生理特性、農(nóng)藝性狀等方面開展了苦瓜耐熱性的鑒定及評價指標(biāo)的篩選等研究，郭培國等［2］研究表明，電解質(zhì)滲透率、丙二醛含量、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm等與耐熱性相關(guān)的生理指標(biāo)可用于苦瓜耐熱性評價。鄭巖松［3］、李家明［4］等通過調(diào)查夏季高溫環(huán)境下苦瓜植株田間表現(xiàn)，篩選出與苦瓜耐熱性相關(guān)的農(nóng)藝性狀指標(biāo)。曾晶等［5］研究結(jié)果表明：產(chǎn)量、商品果數(shù)和單果重的變化率可作為苦瓜成株期耐熱性強(qiáng)弱的鑒定指標(biāo)。

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，植物耐熱性的遺傳是由多對基因控制的數(shù)量性狀，且不同植物耐熱機(jī)制不同，相關(guān)研究表明，苦瓜苗期耐熱性的遺傳是受2對加性—顯性—上位性主基因控制［6］，因此僅通過單一指標(biāo)無法準(zhǔn)確地鑒定和評價苦瓜的耐熱性，需要從眾多指標(biāo)中篩選出若干重要指標(biāo)，建立可靠的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行耐熱性綜合評價，而綜合評價法是將主成分分析、隸屬函數(shù)分析和聚類分析這3種方法相結(jié)合，可綜合反映植物的耐熱能力，此方法已經(jīng)在棉花［7］、黃瓜［8］、大白菜［9］、番茄［10］、茄子［11］等作物的耐熱性評價中廣泛應(yīng)用，但針對苦瓜苗期耐熱性評價的研究鮮見報(bào)道。

本研究以20份苦瓜自交系為材料，測定高溫脅迫下苦瓜苗期13項(xiàng)生理生化和光合特性指標(biāo)，采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法開展了苦瓜的耐熱性綜合評價，并建立了苦瓜苗期耐熱性評價數(shù)學(xué)模型，以期為苦瓜種質(zhì)資源耐熱性的鑒定和評價，以及為耐熱苦瓜新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為經(jīng)多年田間觀察，耐熱性差異顯著的苦瓜高代自交系20份，均由福州市蔬菜科學(xué)研究所苦瓜課題組提供，20份苦瓜自交系的來源和主要形態(tài)、生物學(xué)特征參考《苦瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》［12］展開調(diào)查，調(diào)查結(jié)果見表1。

表1 各苦瓜自交系的來源、主要形態(tài)和生物學(xué)特征

1.2 試驗(yàn)處理

將20份苦瓜自交系點(diǎn)播于50孔穴盤中，置于人工氣候室28 ℃恒溫催芽，待種子破土后，設(shè)置晝夜溫度28 ℃/18 ℃，光照強(qiáng)度5000 lx，光周期12 h，相對濕度為70%，待2片真葉展開時，移栽至直徑8 cm的營養(yǎng)缽內(nèi)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基質(zhì)配比為泥炭∶蛭石∶珍珠巖=7∶2∶1（v∶v∶v），培養(yǎng)環(huán)境同上，待苗長至3葉1心期時，選擇長勢一致的幼苗置于人工氣候室內(nèi)38 ℃恒溫脅迫，設(shè)置光照強(qiáng)度5000 lx，光周期12 h，相對濕度為70%，每份材料8株，設(shè)3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，高溫脅迫72 h后進(jìn)行相關(guān)參數(shù)測定，以常規(guī)培養(yǎng)（晝夜溫度28℃/18 ℃）72 h的苦瓜幼苗作對照。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生理指標(biāo)的測定 參照李合生［13］的實(shí)驗(yàn)方法，采用丙酮提取法測定葉綠素（Chl）含量、硫代巴比妥酸法（TBA）測定丙二醛（MDA）含量、電導(dǎo)儀測定相對電導(dǎo)率（REC）、氮藍(lán)四唑法（NBT）測定超氧化物岐化酶（SOD）活性、愈創(chuàng)木酚顯色法測定過氧化物酶（POD）活性、紫外光吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性、磺基水楊酸提取法（SA）測定游離脯氨酸（Pro）含量、羥胺氧化法法測定超氧陰離子自由基（O2-·）含量、硫酸鈦比色法測定過氧化氫（H2O2）含量。

1.3.2 光合指標(biāo)的測定 凈光合速率的測定：使用LI-6800型便攜式光合作用測定儀（美國LICOR公司）測定苦瓜葉片凈光合速率（Pn），選擇苦瓜植株從基部向上數(shù)第3片功能葉于早上9:00~11:00進(jìn)行測量，每個材料測定3次，結(jié)果取平均值。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定：使用LI-6800型便攜式光合作用測定儀測定苦瓜葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)，測定前植株暗處理30 min，選擇苦瓜植株從基部向上數(shù)第3片功能葉進(jìn)行測量，每個材料測定3次，結(jié)果取平均值，測定指標(biāo)包括初始熒光（Fo）、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、實(shí)際光化學(xué)效率（ΦPSⅡ）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，SPSS 22.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析、主成分分析與聚類分析。

耐熱系數(shù)（heat-tolerance coefficient，HTC）：

各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值：

式（2）中，Xj表示第j個綜合指標(biāo)值；Xmax表示第j個綜合指標(biāo)的最大值，Xmin表示第j個綜合指標(biāo)的最小值。

各綜合指標(biāo)的權(quán)重：

式（3）中，Wj表示第j個綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的權(quán)重，Pj為各品種第j個綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

綜合耐熱性評價值：

式（4）中，D為不同苦瓜自交系在高溫脅迫下由綜合指標(biāo)評價所得的耐熱性綜合評價值。

2 結(jié)果與分析

2.1 各單項(xiàng)指標(biāo)的耐熱系數(shù)及相關(guān)性分析

由表2可知，不同苦瓜自交系經(jīng)高溫脅迫后，其POD、SOD、CAT、Pro、O2-·、H2O2與對照相比均不同程度上升（HTC＞1），而Chl、Pn、Fv/Fm、ΦPSⅡ與對照相比均不同程度下降（HTC＜1），MDA、REC、Fo在各材料間的耐熱系數(shù)表現(xiàn)不一致，有的上升，有的下降。從變異系數(shù)可以看出，CAT、H2O2變異系數(shù)排在第1位、第2位，分別為35.261%和33.959%，ΦPSⅡ的變異系數(shù)為14.259%，在所有13項(xiàng)指標(biāo)中變異系數(shù)最小，表明高溫脅迫對苦瓜葉片的CAT、H2O2影響較大，對ΦPSⅡ的影響較小。由于同一材料不同單項(xiàng)指標(biāo)以及同一指標(biāo)不同材料的耐熱系數(shù)變化不盡相同，因此難以根據(jù)單一指標(biāo)的耐熱系數(shù)判斷材料耐熱性強(qiáng)弱。

表2 不同苦瓜自交系的各項(xiàng)指標(biāo)耐熱系數(shù)

相關(guān)分析結(jié)果表明（表3），各單項(xiàng)指標(biāo)與其他指標(biāo)間至少存在1個或多個顯著相關(guān)或極顯著相關(guān)，其中，抗氧化酶活性（POD、SOD、CAT）兩兩之間呈極顯著正相關(guān)；光合指標(biāo)（Pn、Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ）兩兩之間呈極顯著相關(guān)；MDA、Pro均與O2-·、H2O2呈極顯著正相關(guān)；REC與光合指標(biāo)（Pn、Fo、Fv/Fm、ΦPSⅡ）呈極顯著正相關(guān)；Chl與REC、Pn、Fo、Fv/Fm呈極顯著相關(guān)；O2-·與H2O2呈極顯著正相關(guān)。由于各單項(xiàng)指標(biāo)之間的耐熱系數(shù)存在不同程度的相關(guān)性，造成它們所提供的信息發(fā)生重疊，表明苦瓜耐熱性是一個復(fù)雜的綜合性狀，單一指標(biāo)不能準(zhǔn)確地評價苦瓜的耐熱性，因此，需要利用多元統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析和評價。

表3 各單項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣

2.2 主成分分析

對13個單項(xiàng)指標(biāo)的耐熱系數(shù)進(jìn)行主成分分析，選取特征值大于1的主成分，結(jié)果顯示，13個單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化成4個主成分（表4），貢獻(xiàn)率分別為44.735%、18.491%、14.553%、9.479%，累積貢獻(xiàn)率87.258%，表明這4個主成分能夠包含本試驗(yàn)所有13個耐熱性評價指標(biāo)的絕大部分信息。

表4 各性狀的主成分系數(shù)和貢獻(xiàn)率

從各項(xiàng)指標(biāo)特征向量可以看出，第1主成分（CI1）貢獻(xiàn)率為44.735%，主要由Chl、REC、Pn、Fo、Fv/Fm構(gòu)成，可稱為光合和相對電導(dǎo)率因子；第2主成分（CI2）貢獻(xiàn)率為18.491%，主要由MDA、O2-·、H2O2構(gòu)成，可稱為活性氧和丙二醛因子；第3主成分（CI3）貢獻(xiàn)率為14.553%，主要由POD、SOD、CAT構(gòu)成，可稱為抗氧化酶因子；第4主成分（CI4）貢獻(xiàn)率為9.479%，主要由Pro構(gòu)成，可稱為脯氨酸因子。

2.3 綜合評價

2.3.1 隸屬函數(shù)分析 根據(jù)公式（2）分別計(jì)算20個苦瓜自交系4個綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值（表5），隸屬函數(shù)值的范圍在同一綜合指標(biāo)中介于0.000~1.000之間，如果某一材料隸屬函數(shù)值為0.000，表明該材料在對應(yīng)的綜合指標(biāo)中耐熱性表現(xiàn)最弱，如果其隸屬函數(shù)值為1.000，表明該材料在對應(yīng)的綜合指標(biāo)中耐熱性表現(xiàn)最強(qiáng)。由表5可知，T9、T13、T14、T19分別對應(yīng)綜合指標(biāo)u（X1）、u（X2）、u（X3）、u（X4）的隸屬函數(shù)值為1.000，表明其在對應(yīng)的綜合指標(biāo)耐熱性表現(xiàn)最強(qiáng)，而T19、T5、T19、T8分別對應(yīng)綜合指標(biāo)u（X1）、u（X2）、u（X3）、u（X4）的隸屬函數(shù)值為0.000，表明其在對應(yīng)的綜合指標(biāo)耐熱性表現(xiàn)最弱。

2.3.2 權(quán)重確定 將4個綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率代入公式（3）中計(jì)算得到4個綜合指標(biāo)的權(quán)重分別為0.513、0.212、0.167、0.109（表5）。

2.3.3 綜合評價 運(yùn)用公式（4）計(jì)算各苦瓜自交系綜合耐熱評價值D（表5），并根據(jù)D值的大小對各材料耐熱性強(qiáng)弱進(jìn)行排序。結(jié)果表明，20個苦瓜自交系耐熱性由強(qiáng)到弱排序依次為T9＞T13＞T10＞T17＞T14＞T8＞T7＞T4＞T16＞T11＞T2＞T6＞T15＞T12＞T 18＞T3＞T1＞T19＞T20＞T5。

表5 各苦瓜自交系的綜合指標(biāo)值、權(quán)重、u（Xj）、D值和綜合評價

2.4 不同苦瓜自交系耐熱性的聚類分析

采用歐氏距離，離差平方和法對各苦瓜自交系的綜合耐熱評價值（D值）進(jìn)行聚類分析（圖1），在綜合評價值距離為6.1的位置，將20個苦瓜自交系根據(jù)耐熱能力強(qiáng)弱劃分為3類。第Ⅰ類為強(qiáng)耐熱型，共5個材料，分別為T9、T10、T13、T14、T17；第Ⅱ類為中耐熱型，共14個材料，分別為T1、T2、T3、T4、T6、T7、T8、T11、T12、T15、T16、T18、T19、T20；T5歸為第Ⅲ類，屬于弱耐熱型材料。

圖1 20個苦瓜自交系的D值聚類圖

2.5 逐步回歸分析及耐熱性鑒定指標(biāo)的選擇

為進(jìn)一步分析各指標(biāo)與耐熱性之間的關(guān)系，篩選苦瓜苗期耐熱性鑒定指標(biāo)，分別以各單項(xiàng)指標(biāo)的耐熱系數(shù)和耐熱性綜合評價值作為自變量和因變量進(jìn)行逐步回歸分析，獲得回歸方程：D=-0.650+0.143SOD+0.352Chl+0.088MDA-0.149 REC+0.102H2O2+0.846Fv/Fm，方程決定系數(shù)R2=0.991。由回歸方程可知，13個單項(xiàng)指標(biāo)中有6個指標(biāo)對苦瓜苗期耐熱性有顯著影響，分別是SOD、Chl、MDA、REC、H2O2、Fv/Fm，將這6個指標(biāo)的耐熱系數(shù)代入回歸方程中對各苦瓜自交系耐熱性進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明（表6），各苦瓜自交系D值估計(jì)精度均在93.04%以上，平均估計(jì)精度96.92%，表明該方程適用于苦瓜苗期耐熱性評價。

表6 回歸方程估計(jì)精度分析

3 討論

高溫是植物生長發(fā)育過程中最常遭受的環(huán)境脅迫因子之一［14］，植物在高溫脅迫下，其內(nèi)部生理機(jī)制會發(fā)生一系列諸如細(xì)胞膜透性增大［15-16］，葉綠素降解［17］，活性氧含量增加［18-19］，抗氧化酶活性升高［20］，葉片光合作用受到抑制［21］等復(fù)雜的連鎖反應(yīng)。國內(nèi)外眾多學(xué)者已篩選出與植物耐熱性密切相關(guān)的眾多表型性狀、生理生化、光合特性等指標(biāo)，但不同指標(biāo)對高溫脅迫的響應(yīng)程度不同，因此，需要運(yùn)用多元分析方法對植物耐熱性進(jìn)行綜合評價，建立準(zhǔn)確、可靠的耐熱評價體系。

本研究通過因子分析將13個生理生化和光合特性指標(biāo)轉(zhuǎn)換為4個新的彼此獨(dú)立的綜合指標(biāo)，4個綜合指標(biāo)累積貢獻(xiàn)率達(dá)87.258%，并進(jìn)一步通過隸屬函數(shù)和聚類分析將20個參試材料，根據(jù)其耐熱能力的大小分為強(qiáng)耐熱、中耐熱、弱耐熱3種類型。5個強(qiáng)耐熱類型苦瓜自交系中，T9、T13、T10都來源廣東，T14、T17來源我國臺灣省，均是近年來收集的耐熱性表現(xiàn)突出的優(yōu)良品種，經(jīng)多代定向選擇而育成的穩(wěn)定自交系，其中T9在田間表現(xiàn)為葉片厚、葉色深綠、在夏季高溫環(huán)境下生長勢強(qiáng)、坐果性好且生育期長，在南方地區(qū)能正常越夏；而弱耐熱類型苦瓜自交系T5來源重慶市，田間表現(xiàn)極早熟、連續(xù)坐果能力強(qiáng)，耐低溫不耐高溫，在夏季高溫環(huán)境下生長受阻、畸形瓜多、易早衰，定位為早春設(shè)施栽培材料。由此可見，本研究中各苦瓜自交系聚類分析結(jié)果與田間表現(xiàn)基本一致。

本研究通過逐步回歸分析建立了苦瓜苗期耐熱性評價回歸方程：D=-0.650+0.143SOD+0.352 Chl+0.088MDA-0.149REC+0.102H2O2+0.846Fv/Fm，平均估計(jì)精度為96.92%，表明該方程可用于苦瓜苗期耐熱性評價，從回歸方程中篩選出6個顯著影響苦瓜苗期耐熱性評價的單項(xiàng)指標(biāo)可替代本研究調(diào)查的13個生理生化指標(biāo)，能運(yùn)用于苦瓜種質(zhì)資源耐熱性快速鑒定，從而提高苦瓜耐熱性鑒定效率。從各單項(xiàng)指標(biāo)的耐熱系數(shù)（表2）可知，強(qiáng)耐熱型苦瓜自交系在高溫脅迫下Chl、Pro、Fv/Fm均維持在較高水平，而REC變化較小，推測強(qiáng)耐熱類型苦瓜自交系的幼苗葉片在高溫脅迫下通過積累更多的Pro，以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)免受高溫脅迫的影響，同時葉綠素合成受抑制程度較低，光合作用能維持在較高水平，這與郭培國［2］、毛靜［22］、吳震［23］等的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

本 研 究 篩 選 出SOD、Chl、MDA、REC、H2O2、Fv/Fm等6個顯著影響苦瓜苗期耐熱性評價的單項(xiàng)指標(biāo)，為苦瓜苗期耐熱性鑒定和評價提供了理論依據(jù)，但在苦瓜耐熱評價過程中仍需要綜合考慮田間農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量性狀等其他指標(biāo)的影響，以提高綜合評價的準(zhǔn)確性。篩選出T9、T10、T13、T14、T17等5個強(qiáng)耐熱類型苦瓜自交系，可作為耐熱苦瓜新品種選配的親本材料。