程 斌， 張創(chuàng)娟， 楊 樂， 冷 艷， 李師翁

(蘭州交通大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070)

乙醇脫氫酶(ADH)是生物體內(nèi)主要短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，廣泛存在于所有生物細胞中，由多基因家族編碼，主要分為3個亞家族：短鏈脫氫酶/還原酶，少于250個氨基酸殘基；中鏈脫氫酶/還原酶，約含350個氨基酸殘基；長鏈脫氫酶/還原酶，含385～900個氨基酸殘基[1]。典型的ADH是鋅結(jié)合酶，鋅結(jié)合位點含206～340個氨基酸殘基[2]，其結(jié)構(gòu)域包含底物結(jié)合或催化結(jié)構(gòu)域和輔酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中，底物結(jié)合或催化結(jié)構(gòu)域為N末端的不規(guī)則β卷曲和一小段C末端區(qū)域，含35～164個氨基酸殘基；而輔酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域則含有結(jié)合NAD的Rossmann折疊[3]。

植物的ADH基因?qū)儆谝粋€小的多基因家族，如水稻(OryzasativaLinn.)[4]和玉米(ZeamaysLinn.)[5]等含有2或3個ADHs。ADHs基因可參與果實成熟過程，如番茄(LycopersiconesculentumMill.)ADH2基因參與果實成熟過程中的揮發(fā)性香氣成分的代謝，過表達ADH2可以改善水果風(fēng)味[6]，且在甜瓜(CucumismeloLinn.)[7]和杧果(MangiferaindicaLinn.)[8]中也有相似的結(jié)果。ADHs基因還可參與植物激素調(diào)控，如白梨(PyrusbretschneideriRehd.)的ADH基因參與激素調(diào)節(jié)作用，且對脫落酸、吲哚乙酸和乙烯的調(diào)節(jié)模式不同[9]。在脅迫條件下，ADH基因能夠通過調(diào)節(jié)活性氧(ROS)相關(guān)基因的表達水平保持細胞內(nèi)ROS的穩(wěn)定狀態(tài)[10]，同時，ADH基因也有助于植株積累更多的可溶性糖和胼胝質(zhì)等物質(zhì)，對植物細胞的滲透壓起到調(diào)節(jié)作用[11-14]。Komatsu等[15]發(fā)現(xiàn)，水淹脅迫后大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕幼苗ADH2基因的表達顯著增強，但ADH2基因的表達對滲透、低溫和干旱等脅迫處理均不響應(yīng)，表明ADH2基因是在大豆根中表達的對淹水響應(yīng)的特異性基因。另外，低氧脅迫環(huán)境下ADH基因的表達增強，能提高綠豆的耐澇性[16]。上述研究結(jié)果均表明：ADH基因參與植物生長發(fā)育、有氧代謝及各種脅迫響應(yīng)等多項生理生化過程[17,18]。

土壤Cd污染是嚴重的環(huán)境問題之一，不但影響作物的生長和產(chǎn)量，而且通過食物鏈危害人類健康。一些植物種類可通過根系從土壤中吸收重金屬，并產(chǎn)生耐受性[19]，因而可用于土壤重金屬污染的修復(fù)。豆科(Fabaceae)植物的根瘤使其在土壤重金屬污染修復(fù)方面具有獨特優(yōu)勢[20]。因而，研究豆科植物對重金屬耐受性的分子機制，特別是特定基因?qū)χ亟饘俚捻憫?yīng)特征，對了解植物對重金屬的耐受機制，以及重金屬污染土壤的植物修復(fù)機制都具有重要意義。

綠豆〔Vignaradiata(Linn.) R. Wilczek〕為種植較為廣泛的豆科植物之一，為掌握綠豆對Cd脅迫的耐受性及其耐受機制，前期本課題組的研究人員運用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究了Cd脅迫對綠豆根基因表達的影響[21]。為進一步揭示綠豆對Cd脅迫的分子響應(yīng)機制，作者在前期研究工作的基礎(chǔ)上，采用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和酶學(xué)等方法，鑒定并分析綠豆的ADHs基因及其編碼的氨基酸序列特征，并對正常和Cd脅迫條件下綠豆不同部位ADHs基因表達特性以及ADH酶活性的變化進行比較分析，以期為植物ADHs基因的功能研究及應(yīng)用提供科學(xué)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

綠豆種子經(jīng)自來水清洗后，用體積分數(shù)6%NaClO溶液浸泡15 min，并用無菌水清洗后，置于(25.0±0.5)℃恒溫箱中浸種24 h；在塑料育苗盤中加入適量育苗基質(zhì)〔V(珍珠巖)∶V(蛭石)=1∶1〕，每盤15個育苗格，每個育苗格的長、寬、高分別為9、8、7 cm。每個育苗格播種20粒綠豆種子，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)條件為溫度(25.0±1.0)℃、光照時間14 h·d-1、光照強度100 μmol·m-2·s-1。

1.2 方法

1.2.1 Cd脅迫處理和樣品采集 Cd脅迫處理分為對照組和處理組，分別以Hoagland營養(yǎng)液和含100 μmol·L-1CdCl2·2H2O的Hoagland營養(yǎng)液為培養(yǎng)液，每組3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)1盤。對照組和處理組每個育苗格均加入70 mL相應(yīng)培養(yǎng)液，并在處理第5天分別補充70 mL相應(yīng)培養(yǎng)液。

于處理的第1、第5和第9天，從對照組和處理組的育苗盤中分別取出80株綠豆幼苗植株，清洗并吸干表面水分后，分別剪取植株的根、莖和葉片，用液氮速凍后置于-80 ℃條件下保存，用于轉(zhuǎn)錄組分析。于處理的第1、第3、第5、第7和第9天，從對照組和處理組的育苗盤中分別取80株植株，清洗并吸干表面水分后，將根、莖和葉片分開，用于酶活性測定。

1.2.2ADH基因篩選、鑒定和蛋白特性分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載綠豆全基因組及注釋文件信息，篩選已注釋的綠豆ADHs基因序列；從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(http:∥plants.ensembl.org/index.html)檢索擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕ADHs基因序列；從NCBI數(shù)據(jù)庫得到大豆基因組注釋文件和蛋白序列文件，通過檢索后篩選得到大豆ADHs基因序列。

用基于隱馬爾可夫模型(HMMER)的工具(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)對下載的綠豆基因組注釋蛋白序列進行檢索，設(shè)置e-value值為0.000 1，得到綠豆ADH蛋白的氨基酸序列；再利用Pfam數(shù)據(jù)庫(http:∥pfam.xfam.org)進行蛋白結(jié)構(gòu)域鑒定，確定所有獲得的蛋白均含有ADH結(jié)構(gòu)域。

使用ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam)分析ADHs蛋白理化性質(zhì)，包括相對分子質(zhì)量、等電點和氨基酸殘基數(shù)等。使用MEME線上平臺(http:∥meme-suite.org/tools/meme)進行蛋白motif分析，將鑒定的綠豆ADHs蛋白的氨基酸序列與擬南芥和大豆ADHs蛋白的氨基酸序列進行比對；使用MEGA 7.0軟件基于鄰接法(Neighbour-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用Tbtools工具對結(jié)果進行可視化處理。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序 參照文獻[21,22]的方法提取總RNA并制備cDNA文庫。使用MJ-plant植物總RNA提取試劑盒(上海美吉生物醫(yī)藥科技股份有限公司)進行總RNA提取，并用NanoDrop 2000分光光度計(美國Thermo-Fisher公司)和安捷倫2100生物分析儀(美國Agilent公司)評估RNA的數(shù)量和質(zhì)量。使用TruseqTMRNA樣品制備試劑盒(美國Illumina公司)純化mRNA，并用TruseqTMDNA文庫制備試劑盒(美國Illumina公司)構(gòu)建cDNA文庫。用Illumina Novaseq 6000系統(tǒng)對構(gòu)建的cDNA文庫進行測序，測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

參照文獻[21]的方法分析測序數(shù)據(jù)和差異基因。對9個基因和1個內(nèi)參基因進行qRT-PCR分析，并進行qRT-PCR驗證，其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)(r2)為0.925(P≤0.01)，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與qRT-PCR數(shù)據(jù)結(jié)果高度一致。

基因相對表達量以TPM(transcripts per kilobase per million mapped reads)表示；用2-ΔΔCt法計算基因的表達量，并用Tbtools工具基于log2TPM繪制基因表達譜。

1.2.4 ADH酶活性分析 參照施海濤[23]的方法測定ADH酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用EXCEL 2016軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析和顯著性檢驗(LSD檢驗，P<0.05)，采用GraphPad Prism 9軟件繪圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 綠豆ADHs基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1 綠豆ADHs基因鑒定和結(jié)構(gòu)特征 對獲得的綠豆基因組注釋文件進行檢索，共鑒定得到15個ADHs基因，依次命名為VrADH1至VrADH15，基因序列長度為447～15 055 bp，GC含量為26.53%～39.08%。相比之下，綠豆ADHs基因數(shù)量多于擬南芥(8個，AtADH1至AtADH8)，但少于同科的大豆(32個，GmADH1至GmADH32)。

對綠豆、大豆和擬南芥ADHs基因結(jié)構(gòu)(圖1)的比較結(jié)果表明：綠豆、大豆和擬南芥的ADHs基因均含有不同數(shù)量的內(nèi)含子和外顯子。在綠豆的VrADHs基因中，僅VrADH10包含2個內(nèi)含子和2個外顯子，其他VrADHs分別包含7～9個內(nèi)含子和7～10個外顯子。

: 非翻譯區(qū)Untranslated regions; : 外顯子Exons; —: 內(nèi)含子Introns. Vr: 綠豆Vigna radiata (Linn.) R. Wilczek; At: 擬南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.； Gm: 大豆Glycine max (Linn.) Merr.

Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.， andGlycinemax(Linn.) Merr.

對綠豆、大豆和擬南芥的ADHs氨基酸序列中保守motif的比較結(jié)果(圖2)表明：3個種類的ADHs共包含10個motif，且多數(shù)ADHs含有相似的motif。在綠豆的ADHs氨基酸序列中，VrADH2至VrADH9和VrADH11至VrADH15均含有10個motif，而VrADH1不包含motif5和motif7，VrADH10僅含有motif3。

染色體定位結(jié)果表明：在綠豆的15個VrADHs基因中，VrADH2和VrADH5無法定位到任何染色體上，其他13個VrADHs基因定位于8條染色體上。其中，VrADH3、VrADH4和VrADH14定位于6號染色體上，VrADH7、VrADH8和VrADH11定位于8號染色體上，VrADH10和VrADH12定位于9號染色體上，VrADH13、VrADH9、VrADH6、VrADH1和VrADH15分別定位于1、2、3、7和10號染色體上。

不同彩色框表示不同motif Different colored boxes indicate the different motifs. Vr: 綠豆Vigna radiata (Linn.) R. Wilczek; At: 擬南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.; Gm: 大豆Glycine max (Linn.) Merr.

2.1.2 綠豆VrADHs蛋白的理化性質(zhì) 結(jié)果(表1)顯示：綠豆VrADHs蛋白的理化性質(zhì)存在一定的差異。在15個VrADHs中，VrADH2的氨基酸序列最長(包含444個氨基酸殘基)，相對分子質(zhì)量最大(48 390)；VrADH10的氨基酸序列最短(包含78個氨基酸殘基)，相對分子質(zhì)量最小(8 840)。從氨基酸序列長度看，僅VrADH10屬于短鏈脫氫酶，VrADH1、VrADH2、VrADH7、VrADH11、VrADH12和VrADH15屬于長鏈脫氫酶，其余VrADHs均屬于中鏈脫氫酶。15個VrADHs的氨基酸序列等電點為pI 4.83～pI 8.22，其中，僅VrADH1的等電點大于pI 7，為堿性蛋白；其他VrADHs的等電點均小于pI 7，為酸性蛋白。VrADH1、VrADH3、VrADH4、VrADH10、VrADH11和VrADH12的親水性系數(shù)小于0，說明這6個VrADHs均為親水性蛋白；其他9個VrADHs均為疏水性蛋白。

表1 綠豆VrADHs蛋白的理化性質(zhì)

2.1.3 ADHs蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析 綠豆VrADHs蛋白與模式植物擬南芥和同科植物大豆ADHs蛋白的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

由圖3可見：除GmADH28外，54個ADHs分為3個分支，分支Ⅰ包含VrADH1、GmADH21、GmADH22、GmADH23、GmADH29和GmADH31；分支 Ⅱ 包含VrADH6和GmADH1；分支Ⅲ包含其余的46個ADHs。分支Ⅲ可進一步分為3個亞組，每個亞組均包含3種植物的ADHs。其中，亞組Ⅲ1包含VrADH14、VrADH15、AtADH4、AtADH6、AtADH7、AtADH8以及9個GmADHs；亞組Ⅲ2包含VrADH10、VrADH11、VrADH12、AtADH2、AtADH3以及6個GmADHs；亞組Ⅲ3包含VrADH2、VrADH3、VrADH4、VrADH5、VrADH7、VrADH8、VrADH9、VrADH13、AtADH1、AtADH5以及10個GmADHs?？傮w而言，綠豆與大豆的ADHs間具有更近的親緣關(guān)系。

●: 綠豆Vigna radiata (Linn.) R. Wilczek; ▲: 擬南芥Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh; ■: 大豆Glycine max (Linn.) Merr. 分支上的數(shù)值表示自展支持率The values on the branches represent the bootstrap support rates.

2.1.4 ADHs蛋白結(jié)構(gòu)域分析 綠豆、擬南芥和大豆的ADHs蛋白結(jié)構(gòu)域見圖4。由圖4可見：ADHs蛋白具有3種結(jié)構(gòu)域，分別為ADH_N、ADH_zinc_N和ADH_zinc_N_2，綠豆、擬南芥和大豆的ADHs蛋白的結(jié)構(gòu)域存在差異，多數(shù)ADHs蛋白僅含ADH_N和ADH_zinc_N結(jié)構(gòu)域，而含有3個結(jié)構(gòu)域的ADHs僅占10.9%。

在綠豆的15個VrADHs蛋白中，僅VrADH10含有1個結(jié)構(gòu)域(ADH_N結(jié)構(gòu)域)，其他14個VrADHs均含有ADH_N和ADH_zinc_N結(jié)構(gòu)域，且VrADH1還含有ADH_zinc_N_2結(jié)構(gòu)域。在大豆的32個GmADHs蛋白中，GmADH28不包含結(jié)構(gòu)域，GmADH15和GmADH24僅含有ADH_N結(jié)構(gòu)域，其他GmADHs均含有ADH_N和ADH_zinc_N結(jié)構(gòu)域，且GmADH21、GmADH22、GmADH23、GmADH29和GmADH31還含有ADH_zinc_N_2結(jié)構(gòu)域。而在擬南芥的8個AtADHs蛋白中，除AtADH5和AtADH5各自僅包含ADH_N和ADH_zinc_N 1個結(jié)構(gòu)域外，其他6個AtADHs均含有ADH_N和ADH_zinc_N結(jié)構(gòu)域，但AtADHs均不包含ADH_zinc_N_2結(jié)構(gòu)域。

: ADH_N結(jié)構(gòu)域ADH_N domain; : ADH_zinc_N結(jié)構(gòu)域ADH_zinc_N domain; : ADH_zinc_N_2結(jié)構(gòu)域ADH_zinc_N_2 domain. Vr: 綠豆Vigna radiata (Linn.) R. Wilczek; At: 擬南芥 Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.; Gm: 大豆 Glycine max (Linn.) Merr.

2.2 Cd脅迫條件下綠豆幼苗VrADHs基因的表達量及ADH酶活性變化

2.2.1 正常條件下綠豆幼苗不同部位ADHs基因的表達譜 依據(jù)log2TPM繪制15個VrADHs基因在綠豆幼苗根、莖和葉片中的表達譜(圖5)，結(jié)果表明：在15個VrADHs基因中，VrADH7、VrADH8和VrADH10在幼苗的根、莖和葉片中均未表達，而其他12個VrADHs基因均有不同水平的表達，且相對表達量因生長時間不同而異，并表現(xiàn)出不同的變化趨勢。

在幼苗根中，表達量最高的基因為VrADH1，其相對表達量(TPM值)在培養(yǎng)1、5和9 d分別達到282.95、164.21和161.47。在幼苗莖中，表達量最高的基因為VrADH3，其TPM值在培養(yǎng)1、5和9 d分別為4 523.37、229.39和148.28；VrADH6基因的相對表達量在培養(yǎng)9 d也達到較高水平，TPM值為199.25。在幼苗葉片中，相對表達量最高的基因為VrADH14，其TPM值在培養(yǎng)1、5和9 d分別為141.29、118.86和88.93?？傮w上，在15個VrADHs基因中，僅VrADH6基因在根、莖和葉片中表達量均較高，且在幼苗的不同生長時間該基因的相對表達量均維持在較高水平。

R1, R5, R9: 分別為培養(yǎng)1、5和9 d的幼苗根Seedling roots cultured for 1, 5 and 9 d, respectively; S1, S5, S9: 分別為培養(yǎng)1、5和9 d的幼苗莖Seedling stems cultured for 1, 5 and 9 d, respectively; L1, L5, L9: 分別為培養(yǎng)1、5和9 d的幼苗葉片Seedling leaves cultured for 1, 5 and 9 d, respectively.

此外，一些VrADHs基因的表達也表現(xiàn)出組織特異性。其中，VrADH12基因在根中低水平表達，VrADH2基因在根和葉片中低水平表達，VrADH4基因在根和莖中低水平表達。聚類分析結(jié)果表明：依據(jù)相對表達量可將15個基因分為2組，其中VrADH2、VrADH4、VrADH7、VrADH8、VrADH9、VrADH10和VrADH12基因聚為一組，這些基因在綠豆的根、莖和葉片中不表達或表達水平較低；其他8個基因聚為另一組，這些基因在綠豆的根、莖和葉片中均有不同水平的表達。

2.2.2 Cd脅迫條件下綠豆幼苗VrADHs基因的表達量變化 在100 μmol·L-1Cd脅迫下綠豆幼苗根、莖和葉片中VrADHs基因相對表達量的變化分別見表2、表3和表4。結(jié)果表明：在Cd脅迫和對照條件下，在15個VrADHs基因中，VrADH7、VrADH8和VrADH10基因在幼苗的根、莖和葉片中均未表達；Cd脅迫處理可明顯影響綠豆幼苗根、莖和葉片中VrADHs基因的表達水平，且相對表達量因幼苗生長時間的不同而異；與對照相比，Cd脅迫條件下多數(shù)VrADHs基因在綠豆幼苗根、莖和葉片中的表達量上調(diào)。

由表2可見：Cd處理1 d，除VrADH1、VrADH9和VrADH12基因外，幼苗根中其他基因的表達水平均較對照上調(diào)；其中，VrADH2、VrADH4、VrADH5和VrADH13基因的相對表達量分別較對照提高了52.82、90.39、1.46和1.05倍，而VrADH1和VrADH12基因的相對表達量則分別較對照降低了55.44%和87.84%，差異均達顯著(P<0.05)水平。Cd處理5 d，VrADH3、VrADH5、VrADH6、VrADH12和VrADH13基因的表達水平均較對照下調(diào)，而其他7個基因的表達水平均較對照上調(diào)；其中，VrADH4、VrADH14和VrADH15基因的相對表達量分別較對照提高了4.54、454.22和43.18倍，VrADH6和VrADH12基因的相對表達量分別較對照降低了29.39%和81.40%，差異均達顯著水平。Cd處理9 d，VrADH1、VrADH2、VrADH3、VrADH6和VrADH12基因的表達水平均較對照下調(diào)，而其他7個基因的表達水平均較對照上調(diào)，其中，VrADH9、VrADH14和VrADH15基因的相對表達量分別較對照提高了4.45、16.68和2.70倍，VrADH12基因的相對表達量較對照降低了89.78%，差異均達顯著水平。

由表3可見：Cd處理1 d，除VrADH1、VrADH11和VrADH15基因外，幼苗莖中其他基因的表達水平均較對照上調(diào)；其中，VrADH2、VrADH4、VrADH6和VrADH14基因的相對表達量分別較對照提高了0.88、1.15、0.31和0.42倍，差異均達顯著水平；其他基因的相對表達量高于或低于對照，但均無顯著差異。Cd處理5 d，僅VrADH11基因的表達水平較對照下調(diào)，其他基因的表達水平均較對照上調(diào)；其中，VrADH1、VrADH3、VrADH4、VrADH12、VrADH13和VrADH14基因的相對表達量分別較對照提高了1.01、2.91、7.32、19.00、0.39和6.65倍，差異均達顯著水平。Cd處理9 d，僅VrADH6、VrADH13和VrADH15基因的表達水平較對照下調(diào)，其他基因的表達水平均較對照上調(diào)；其中，VrADH1、VrADH2、VrADH3、VrADH5、VrADH12和VrADH14基因的相對表達量分別較對照提高了1.21、3.63、1.00、1.94、23.00和12.04倍，差異均達顯著水平。

由表4可見：在對照組中，葉片中VrADH12基因在處理1和5 d均不表達；在Cd處理組中，該基因在處理1 d也不表達，但在處理5和9 d低水平表達。Cd處理1 d，除VrADH2、VrADH11、VrADH14和VrADH15基因外，幼苗葉片中其他基因的表達水平均較對照上調(diào)；其中，VrADH2、VrADH14和VrADH15基因的相對表達量分別較對照降低了80.28%、30.95%和30.12%，差異均達顯著水平。Cd處理5 d，VrADH2、VrADH6、VrADH9和VrADH15基因的表達水平均較對照下調(diào)，而其他基因的表達水平均較對照上調(diào)；其中，VrADH1、VrADH3和VrADH13基因的相對表達量分別較對照提高了1.18、39.16和0.50倍，VrADH2基因的相對表達量較對照降低了82.00%，差異均達顯著水平。Cd處理9 d，VrADH2、VrADH4、VrADH6、VrADH9和VrADH14基因的表達水平均較對照下調(diào)，其他基因的表達水平均較對照上調(diào)；其中，VrADH1、VrADH3和VrADH11基因的相對表達量分別較對照提高了1.42、75.93和0.92倍，VrADH2基因的相對表達量較對照降低了79.41%，差異均達顯著水平。

表2 Cd脅迫下綠豆幼苗根中VrADHs基因相對表達量的變化

表3 Cd脅迫下綠豆幼苗莖中VrADHs基因相對表達量的變化

表4 Cd脅迫下綠豆幼苗葉片中VrADHs基因相對表達量的變化

2.2.3 Cd脅迫條件下綠豆幼苗ADH酶活性變化經(jīng)100 μmol·L-1Cd處理1～9 d綠豆幼苗根、莖和葉片中ADH酶活性的變化見圖6。結(jié)果表明：在對照和Cd脅迫條件下，綠豆幼苗根和莖中的ADH酶活性隨處理時間的延長總體呈下降趨勢，且在對照條件下葉片中的ADH酶活性也隨處理時間的延長總體呈下降趨勢；但在Cd脅迫條件下，葉片的ADH酶活性則波動變化，且在處理3～9 d均高于處理1 d。

幼苗根中ADH酶活性在Cd處理1、3、5和7 d均較對照不同程度升高，但在Cd處理9 d接近對照水平；其中，Cd處理3和9 d ADH酶活性分別較對照升高了27.68%和89.50%，差異均達顯著水平。

幼苗莖中ADH酶活性在Cd處理1 d略低于對照，但在Cd處理3、5、7和9 d則不同程度高于對照；其中，Cd處理3、5和9 d ADH酶活性分別較對照升高了48.60%、47.05%和65.30%，且在Cd處理5和9 d與對照差異顯著。

幼苗葉片中ADH酶活性在Cd處理1 d顯著低于對照，而在Cd處理3、5、7和9 d均不同程度高于對照；其中，Cd處理3和9 d ADH酶活性較對照分別升高了54.20%和75.90%，差異達顯著水平。

3 討論和結(jié)論

對比綠豆、擬南芥和大豆的ADHs基因，3種植物的ADHs基因結(jié)構(gòu)相似度較高，且大部分基因編碼的氨基酸序列具有相似的motif，如綠豆的VrADH1基因與大豆的GmADH21、GmADH22、GmADH23、GmADH29和GmADH31基因編碼的氨基酸序列均包含8個相同的motif，且均缺少motif5和motif7。這一結(jié)果部分佐證了綠豆VrADHs基因與同科植物大豆的GmADHs基因具有相近的結(jié)構(gòu)。不同植物的ADHs基因也存在一定差異，例如：綠豆的VrADH10基因編碼的氨基酸序列僅包含motif3，大豆的GmADH28基因編碼的氨基酸序列僅含motif1，GmADH26基因編碼的氨基酸序列包含motif1、motif9、motif3和motif5，GmADH15和GmADH24基因編碼的氨基酸序列則包含motif1和motif9。植物ADHs基因家族祖先的標準內(nèi)含子數(shù)量為9個，分布在染色體上大致相同的位置[24]，植物ADHs基因在進化過程中通過基因重復(fù)獲得新的底物特異性[25]，且其內(nèi)含子的長度、數(shù)量和分布通常為該基因的進化奠定了基礎(chǔ)。綠豆的VrADHs基因含有7～9個內(nèi)含子，其內(nèi)含子數(shù)量差異性可能與基因的串聯(lián)排列和相互作用有關(guān)[26]。

綠豆不同ADHs蛋白的相對分子質(zhì)量、等電點、親水性系數(shù)等理化特征具有一定差異性，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹可將綠豆、大豆和擬南芥的ADHs分為3個分支，綠豆的VrADH1和大豆的5個GmADHs聚為分支Ⅰ，綠豆的VrADH6和大豆的GmADH1聚為分支Ⅱ，綠豆和大豆的其余25個ADHs與擬南芥的所有ADHs聚為分支Ⅲ，這一方面表明非同源基因重復(fù)事件的發(fā)生[27]，另一方面佐證了綠豆和大豆ADHs具有更近的親緣關(guān)系。另外，前人通過聚類分析分別將小麥(TriticumaestivumLinn.)[28]和甜瓜[29]的ADHs聚為長鏈、中鏈和短鏈3類，與本研究結(jié)果有一定差異，可能與基因鑒定和篩選的方法不同有關(guān)。從綠豆VrADHs的氨基酸序列長度看，僅VrADH10屬于短鏈脫氫酶，VrADH1、VrADH2、VrADH7、VrADH11、VrADH12和VrADH15屬于長鏈脫氫酶，其余VrADHs屬于中鏈脫氫酶；短鏈ADHs的輔酶結(jié)合區(qū)缺乏鋅和半胱氨酸殘基，且僅有少數(shù)短鏈ADHs的功能已知[30]，因此，綠豆VrADH10的具體功能有待進一步研究。此外，綠豆的所有VrADHs都包含ADH_N結(jié)構(gòu)域，且除VrADH10外，其他VrADHs還包含ADH_zinc_N結(jié)構(gòu)域，說明多數(shù)ADHs具有基本相同的結(jié)構(gòu)域，這一現(xiàn)象在其他植物的ADHs研究中得到證實[31]。此外，擬南芥的AtADHs中不存在ADH_zinc_N_2結(jié)構(gòu)域，但綠豆的VrADH1和大豆的5個GmADHs中卻存在此結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)果與“綠豆和大豆的ADHs具有更近的親緣關(guān)系”相印證。

在綠豆的15個VrADHs基因中，12個基因在根、莖和葉片中有不同水平表達，且VrADH1、VrADH3、VrADH5、VrADH6和VrADH14基因在根、莖和葉片中的表達水平均較高，VrADH9、VrADH15、VrADH11和VrADH13基因表達水平較低，而VrADH7、VrADH8和VrADH10基因在正常和Cd脅迫條件下均不表達。VrADH7和VrADH8基因的表達產(chǎn)物是VrADH6基因的轉(zhuǎn)錄變體(transcript variant)，主要存在于哺乳動物中[32]；VrADH10基因與乙醇代謝調(diào)控和乙醛合成有關(guān)，且參與的代謝途徑主要發(fā)生在酵母中，在高等植物中僅在水淹脅迫條件下表達[33,34]。這可能是3個基因在綠豆不同部位中不表達的主要原因。

ADHs參與植物的基本代謝過程[35]，不同基因在植物的不同發(fā)育階段和不同組織中具有各自的功能[29]。從表達水平看，Cd脅迫后綠豆根中VrADH2、VrADH4和VrADH14基因的表達水平較高，莖中VrADH3基因的表達水平較高，葉片中VrADH1、VrADH3和VrADH5基因的表達水平較高，表明Cd脅迫后VrADHs基因的表達具有組織特異性。Cd脅迫可導(dǎo)致綠豆根、莖和葉片中部分VrADHs基因的表達水平大幅升高。例如：Cd處理1 d，與對照相比，根中VrADH2、VrADH4、VrADH5和VrADH13基因以及莖中VrADH2、VrADH4、VrADH6和VrADH14基因的相對表達量顯著升高，但葉片中ADHs基因的相對表達量無顯著升高；Cd處理5 d，與對照相比，根中VrADH4、VrADH14和VrADH15基因以及葉片中VrADH1、VrADH3、VrADH5和VrADH13基因的相對表達量顯著升高，莖中VrADH1、VrADH3、VrADH4、VrADH12、VrADH13和VrADH14基因的相對表達量也顯著升高；Cd處理9 d，與對照相比，根中VrADH9、VrADH14和VrADH15基因以及葉片中VrADH1、VrADH3、VrADH5和VrADH11基因的相對表達量顯著升高，莖中VrADH1、VrADH2、VrADH3、VrADH4、VrADH5、VrADH12和VrADH14基因的相對表達量也顯著升高。此外，Cd脅迫也導(dǎo)致綠豆根、莖和葉片中部分VrADHs基因的表達水平降低。例如：Cd處理1、5和9 d，根中VrADH12基因和葉片中VrADH2基因的相對表達量均較對照顯著降低。這些數(shù)據(jù)均說明在綠豆幼苗的不同器官及不同處理時間，各VrADHs基因?qū)d脅迫的響應(yīng)程度不同，說明ADHs基因的表達具有功能冗余性和表達多樣性。

由ADHs酶活性分析結(jié)果可見：Cd脅迫導(dǎo)致綠豆根、莖和葉片中ADH酶活性升高或降低，在某些處理時間表現(xiàn)極顯著。Cd處理1 d，根和莖中ADH酶活均無顯著變化，而葉片中ADH酶活性則顯著降低，可能與葉片中VrADH2、VrADH14和VrADH15基因的表達量降低有關(guān)；Cd處理3 d，根、莖和葉片中ADH酶活性升高，可能與VrADH2、VrADH4和VrADH5基因的表達量升高有關(guān)；Cd處理5和9 d，根、莖和葉片中均有2個以上VrADHs基因的表達量顯著升高，根、莖和葉片中ADH酶活性也不同程度升高。顯然，Cd脅迫導(dǎo)致綠豆幼苗根、莖和葉片中VrADHs基因表達水平的升高或降低，而不同器官中以及不同處理時間ADH酶活性也有升有降，這一現(xiàn)象進一步佐證了ADHs基因參與綠豆幼苗對Cd脅迫的響應(yīng)。在Cd脅迫初期，綠豆幼苗進行有氧呼吸，體內(nèi)尚未積累大量的乳酸和乙醇等代謝物質(zhì)[35]；但隨脅迫時間的延長，為了維持機體基本的代謝活動，幼苗開始進行無氧呼吸，此時丙酮酸沒有被完全氧化，并在產(chǎn)生乳酸和乙醇的同時釋放少量能量，故綠豆幼苗的根、莖和葉片中相應(yīng)的VrADHs基因高水平表達，進而使ADH酶活性升高，提升糖酵解途徑的代謝活性，以減輕這些代謝產(chǎn)物對植物細胞的毒害作用[36,37]。

在綠豆幼苗的生長過程中以及在不同器官中，綠豆的15個VrADHs基因的表達特性均可呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，特別是經(jīng)過Cd脅迫處理后，不同VrADHs基因的表達水平上調(diào)或下調(diào)，那么，在應(yīng)對Cd脅迫的過程中，有哪些VrADHs基因起到關(guān)鍵作用，有哪些VrADHs基因?qū)G豆的ADH酶活性有顯著調(diào)控作用，其規(guī)律性和響應(yīng)機制如何，這些問題仍有待進一步研究。此外，本研究中有少部分VrADHs基因的相對表達量數(shù)據(jù)離散程度很大，對方差分析結(jié)果可能有一定的影響，導(dǎo)致部分數(shù)據(jù)的顯著性檢驗結(jié)果不準確，但這部分數(shù)據(jù)并不影響本文的整體結(jié)果。

綜合分析結(jié)果表明：綠豆基因組含有15個VrADHs基因，具備ADH家族基因的基本特征，其基因結(jié)構(gòu)與擬南芥和大豆的ADHs基因結(jié)構(gòu)相似；與擬南芥AtADHs的氨基酸序列相比，綠豆VrADHs與大豆GmADHs的氨基酸序列具有更近的親緣關(guān)系。在綠豆的15個VrADHs基因中，有12個VrADHs基因可在根、莖和葉片中不同程度表達，但表達水平因生長時間而異；在Cd脅迫條件下，綠豆幼苗根、莖和葉片中12個VrADHs基因的表達水平上調(diào)或下調(diào)，但多數(shù)基因的表達水平較對照上調(diào)，且在不同處理時間幼苗根、莖和葉片中的ADH酶活性總體上也均高于對照，顯示綠豆ADH酶活性的升高與某些VrADHs基因的表達水平上調(diào)有關(guān)，表明綠豆的某些VrADHs基因參與了綠豆對Cd脅迫的響應(yīng)過程。