石青青，孫珊珊，李麗琴，宋秀梅，于海超，程雪嬌，王 建

（天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司，天津 300380）

粒細胞集落刺激因子 （granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）是一種多效細胞因子，主要通過與效應細胞表面的特異性受體結(jié)合發(fā)揮作用［1］。 G-CSF 參與粒系細胞的增殖和分化［2］，通過刺激生長因子的釋放促進血管的形成［3］。G-CSF還能增強中性粒細胞的趨化、 吞噬和殺傷作用，在機體抗應激等方面發(fā)揮重要作用。 研究表明，G-CSF 具有抗炎、抗細胞凋亡、刺激神經(jīng)元生成的作用［4-5］。

重組人粒細胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhGCSF）是運用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的與G-CSF 具有相似生物學活性的一種重組蛋白［6-7］。 目前，rhGCSF 在臨床上已被廣泛應用。 rhG-CSF 是常見的干細胞動員劑［8］，在免疫調(diào)節(jié)［9］、骨髓移植、肝腎移植、骨髓抑制化療［10］中表現(xiàn)出積極作用，對缺血性腦梗死［11］、急性髓性白血?。?2］、慢性中性粒細 胞 減 少［13］、急 性 口 腔黏膜 炎［14］、急 性 輻 射綜 合征［15］等具有一定的療效。 此外，rhG-CSF 還可與抗生素聯(lián)合使用防治感染。 聚乙二醇化重組人粒細胞刺激因子（pegylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，PEG-rhG-CSF）是rhG-CSF 與聚乙二醇交聯(lián)得到的，與rhG-CSF相比，半衰期更長，作用更加持久，并且生物穩(wěn)定性更強，可以減少臨床使用中反復注射帶來的不便［16-19］。

重組牛粒細胞集落刺激因子（recombinant bovine granulocyte colony stimulating factor，rbGCSF）是由rbG-CSF 重組大腸桿菌發(fā)酵純化而來，目前在養(yǎng)殖業(yè)中未被使用。 初步評價其可能具有與rhG-CSF 相似的作用。 該研究對rbG-CSF 進行了發(fā)酵、純化、鑒定，評價了其對小鼠的安全性，觀察其對小鼠的毒性作用， 旨在為rbG-CSF 進一步的臨床試驗研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物

4 周齡左右體重18～22 g 的健康昆明系小鼠，272 只，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物有限公司。 小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，溫度18～25 ℃，濕度40%～60%，定期飼喂標準鼠料，自由飲水。

1.1.2 菌株與試劑

rbG-CSF 重組大腸桿菌： 宿主菌為大腸桿菌BL21，表達載體pET-30a；保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏號：CCTCC M 2017014；拉丁文分類名Escherichia coli BL21BG-CSF。

葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、Na2HPO4·12H2O，購自天津渤化化學試劑有限公司；（NH4）2SO4，購自維科特（天津）化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；NH4Cl，購自天津基準化學試劑有限公司；MgSO4·7H2O、消泡劑、微量元素（MnSO4·5H2O、ZnCl2、CoCl·6H2O、Na2MO4·2H2O、CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、H3BO3、CaCl2·2H2O）、NaCl、Tween-80、NaAc、丙烯酰胺、bis丙烯酰胺、Tris，購自北京索萊寶科技有限公司；甘氨酸、SDS、甘油、溴酚藍、巰基乙醇、乙醇、考馬斯亮藍R250， 購自國藥集團化學試劑有限公司；尿素、K2HPO4、EDTA、冰乙酸，購自天津市鑫鉑特化工有限公司；Triton X-100，購自Sigma-Aldrich 公司；BCA 法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 儀器設備

10 L 發(fā)酵罐及控制柜BLBIO-10SJ、 冷水機BLBIO-LD600，上海百侖生物科技有限公司產(chǎn)品；臥式恒溫振蕩器IS-RDH2， 天津普瑞維亞科技有限公司產(chǎn)品；凈化工作臺SW-CJ-2F，浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品； 靜音無油空氣壓縮機AT80/38，江蘇岱洛醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品；蒸發(fā)器TY9-0.7-D， 上海棠億鍋爐有限公司產(chǎn)品；Thermo 高速離心機LYNX4000， 賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品；超聲波破碎儀JY98-Ⅲdn，寧波新芝生物科技產(chǎn)品； 蛋白電泳系統(tǒng)Powerpac HC，BIO-RAD 產(chǎn)品； 凝膠成像分析系統(tǒng)SmartGel 600，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計UV-1900i，格澤爾機電設備貿(mào)易（天津）有限公司產(chǎn)品；往復式脫色搖床SH100，天津普瑞維亞科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 rbG-CSF 工程菌發(fā)酵、純化及鑒定

依照孫珊珊等［20］的發(fā)明專利“一種重組牛粒細胞集落刺激因子工程菌的高密度發(fā)酵的方法”，對rbG-CSF 工程菌進行發(fā)酵，獲得發(fā)酵菌液。隨后參照宋爽等［21］報道的新一代重組人粒細胞集落刺激因子純化工藝對發(fā)酵所得的發(fā)酵液進行rbGCSF 的復性與純化。純化后的rbG-CSF 通過SDSPAGE 電泳方法對其純化程度進行初步鑒定，判斷與目標蛋白的匹配程度。 使用BCA 法蛋白濃度測定試劑盒對純化的rbG-CSF 進行濃度測定，具體方法參考BCA 法蛋白濃度測定試劑盒說明書。

1.2.2 對小鼠的安全性評價

1.2.2.1 急性毒性試驗

選取昆明系小白鼠112 只，雌雄各半，分為F組和J 組。 F 組為腹腔注射組，分為F1、F2、F3、D1組，每組14 只；J 組為肌肉注射組，分為J1、J2、J3、D2 組，每組14 只；D1、D2 組為空白對照組。 F1 組與J1 組小鼠注射300 μg/mL 的rbG-CSF 0.5 mL（150 μg/只），F(xiàn)2 組與J2 組小鼠注射150 μg/mL 的rbG-CSF 0.5 mL （75 μg/只），F(xiàn)3 組與J3 組小鼠注射75 μg/mL 的rbG-CSF 0.5 mL （37.5 μg/只），D1組和D2 組小鼠注射生理鹽水0.5 mL。最大劑量相當于重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子用量的500 倍。

給藥后持續(xù)觀察14 d，在此期間，每天觀察小鼠的死亡情況和精神狀態(tài)，每隔4 d 對小鼠稱重1次。 給藥后14 d 對各組小鼠進行剖檢， 采集肝、脾、腎經(jīng)HE 染色后進行病理組織學檢查。

1.2.2.2 慢性毒性試驗

選取昆明系小白鼠160 只，雌雄各半，分為T組和H 組。 T 組為腹腔注射組， 含T1、T2、T3、K1組， 每組20 只；H 組為肌肉注射組， 含H1、H2、H3、K2 組， 每組20 只，K1、K2 組為空白對照組。T1、H1 組小鼠注射150 μg/mL 的rbG-CSF 0.1 mL（15 μg/只），T2、H2 組 小 鼠 注 射100 μg/mL 的rbG-CSF 0.1 mL（10 μg/只），T3、H3 組每只小鼠注射50 μg/mL 的rbG-CSF 0.1 mL（5 μg/只），K1、K2組每只小鼠注射生理鹽水0.1 mL，每周給藥1 次，持續(xù)12 周。

每周注射后的第6 天對各組小鼠進行稱重，觀察各組小鼠死亡情況和精神狀態(tài)，第12 周給藥后7 d 對小鼠進行剖檢，將肝臟、脾臟、腎臟、睪丸和卵巢稱重，計算臟器指數(shù)。 臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/體重（g）×100%。 采集肝、脾、腎經(jīng)HE 染色后進行病理組織學檢查。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件對小鼠體重、臟器系數(shù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 rbG-CSF 純化與鑒定

2.1.1 SDS-PAGE 電泳結(jié)果

對純化后的rbG-CSF 進行SDS-PAGE 鑒定。如圖1 所示， 樣品鑒定結(jié)果與預期的21.5 kDa 相符，說明純化成功。

圖1 rbG-CSF 蛋白純化樣品的SDS-PAGE 鑒定

2.1.2 rbG-CSF 濃度測定

依照BCA 試劑盒說明書提供的方法建立標準曲線y=2 339.1x-191.36，R2=0.999 3， 具體情況見圖2。擬合度良好，在630 nm 下測得樣品OD 的平均值為0.211，代入計算得到rbG-CSF 的濃度為302.19 μg/mL。

圖2 rbG-CSF 濃度測定標準曲線

2.2 安全性評價

2.2.1 死亡情況

急性毒性試驗中，rbG-CSF 腹腔注射組、rbGCSF 肌肉注射組、對照組均未出現(xiàn)死亡。 慢性毒性試驗中，rbG-CSF 腹腔注射組T1 組在第1 周注射藥物后1 d 死亡2 只；T3 組第1 周注射藥物后1 d死亡1 只；T1、T2 組在第7 周注射藥物后1 d 分別死亡1 只；T3 組在第10 周注射藥物后1 d 死亡2只，試驗期間共死亡7 只，肌肉注射組未見死亡，對照組K1 組在第6 周注射藥物后1 d 死亡1 只。對死亡小鼠進行剖檢，心臟、肝臟、脾臟、肺臟等內(nèi)臟器官未見明顯的病變。

2.2.2 體重變化

急性毒性試驗觀察期內(nèi)小鼠體重變化情況見圖3。 由圖3 可知，腹腔注射組、肌肉注射組與相應的對照組相比， 小鼠體重增長趨勢與對照組相比未見明顯異常波動， 同時間段各組體重相差最大不超過2 g。 經(jīng)統(tǒng)計學分析各組之間均無顯著（P>0.05）差異。 慢性毒性試驗觀察期內(nèi)，各時間段腹腔注射組、肌肉注射組與相應的對照組相比，無顯著（P>0.05）差異。 由圖4 可知，各組小鼠體重均平穩(wěn)增長，未出現(xiàn)大的波動，最大變化幅度不超過4 g。

圖3 急性毒性試驗小鼠體重變化

圖4 慢性毒性試驗小鼠體重變化

2.2.3 臟器系數(shù)

慢性毒性試驗12 周后測得的各組小鼠臟器系數(shù)見表1。 由表1 可知，腹腔注射和肌肉注射2種方式下，各劑量組雌、雄小鼠的肝、脾、腎和生殖器官的臟器系數(shù)均無顯著（P>0.05）差異。

表1 慢性毒性試驗小鼠臟器系數(shù)測定 單位：%

2.2.4 病理組織學檢查

急性毒性試驗14 d 與慢性毒性試驗12 周后，分別對各組小鼠進行了解剖，取肝、脾、腎進行病理切片檢查。 與對照組相比，毒性測試組（包括肌肉注射和腹腔注射的急性與慢性小組） 病理切片鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細胞結(jié)構(gòu)完整，均未見明顯的病理變化。圖5 為腹腔注射最高劑量組與對照組肝、脾、腎的病理切片。

圖5 毒性試驗腹腔注射小鼠病理組織學觀察（HE 染色，100×）

3 討論

該研究純化鑒定了一種重組牛粒細胞集落刺激因子， 驗證了重組人粒細胞集落刺激因子工業(yè)化發(fā)酵、 復性以及純化方法在rbG-CSF 上進行生產(chǎn)的可行性， 為將來rbG-CSF 規(guī)?；a(chǎn)提供了技術(shù)參考。 采用BCA 試劑盒法測得蛋白濃度為302.19 μg/mL，滿足了臨床使用的需求，也為臨床效果的評定提供了一定的支持。

目前，重組人粒細胞集落刺激因子的研究已經(jīng)相當成熟，據(jù)報道，短效rhG-CSF 在機體內(nèi)半衰期短并且穩(wěn)定性差，容易引起免疫排斥等不良反應［22-23］。有關(guān)rhG-CSF 的臨床評價顯示，rhG-CSF 可能會影響肌肉骨骼系統(tǒng)，導致骨痛、肌肉疼痛；影響消化系統(tǒng)，導致嘔吐、肝臟ALT 及AST 的升高；還可能引起眼炎癥反應、體溫升高、皮疹等［24］。

該研究對rbG-CSF 的安全性進行了初步的評價。體重作為非特異性觀察指標［25-26］，能夠綜合反映機體的中毒狀況，常被用作動物毒理研究的指標。 在對小鼠進行短期和長期注射rbG-CSF后，小鼠的體重變化在正常范圍之內(nèi)，試驗組與對照組小鼠體重的增長并未出現(xiàn)較大的差距，說明該劑量水平上的rbG-CSF 對小鼠機體的毒性影響較小。

臟器系數(shù)可以反映受試藥物對臟器毒性的綜合情況， 是尋找受試物毒性作用靶器官的重要線索。 在研究中，排除體重變化對臟器系數(shù)的影響，可以用臟器系數(shù)旁證病理組織學的改變［27］。 該研究結(jié)果顯示，持續(xù)注射rbG-CSF 12 周后，各試驗組中的小鼠臟器系數(shù)與對照組相比均無顯著差異，結(jié)合病理組織學檢查，各試驗組與對照組相比均未出現(xiàn)明顯的病理變化，這說明，在該試驗條件下，該劑量的rbG-CSF 可能并不能使小鼠肝、脾、腎及生殖器官發(fā)生器質(zhì)性病理改變。

目前對于rbG-CSF 的研究尚不充分， 該研究對rbG-CSF 的臨床評價起到一定的參考作用。 有關(guān)試驗表明PEG-rhG-CSF 具有比rhG-CSF 更強的免疫細胞調(diào)節(jié)功能，并且長效，具有更易為臨床使用者接受的特性［28］。研發(fā)PEG-rbG-CSF 也將是rbG-CSF 研究的一個重要方向。