高若珊，楊春華，王 冰，石彥國(guó)，呂銘守

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院 黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150028）

豆腐制作過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物——黃漿水，是一種富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、鹽類等物質(zhì)的天然培養(yǎng)基[1-3]。我國(guó)傳統(tǒng)的酸漿豆腐是由黃漿水自然發(fā)酵形成的酸漿經(jīng)點(diǎn)制而成，而傳統(tǒng)的酸漿大多由地方小作坊自然發(fā)酵制成，地域性強(qiáng)，難以大規(guī)模生產(chǎn)[4-5]。酸漿的酸度容易受外界因素影響，環(huán)境不穩(wěn)定，酸漿品質(zhì)也不穩(wěn)定，導(dǎo)致制作的酸漿豆腐品質(zhì)不穩(wěn)定?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)酸漿在自然發(fā)酵過(guò)程中的主要產(chǎn)酸菌為乳酸菌[6-9]，所產(chǎn)多種有機(jī)酸豐富了酸漿豆腐的風(fēng)味，同時(shí)可作為酸漿豆腐的蛋白凝聚劑。此外，酸漿在自然發(fā)酵過(guò)程中除有益菌以外，還產(chǎn)生許多雜菌，容易導(dǎo)致所生產(chǎn)的酸漿豆腐品質(zhì)不好，貨架期短。若將酸漿改為純種發(fā)酵[10-11]，則可有效解決以上問(wèn)題。

本研究以豆腐生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物——黃漿水為培養(yǎng)基，對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期誘變選育的耐高溫乳酸菌（鼠李糖乳桿菌）進(jìn)行純種發(fā)酵制作酸漿。以產(chǎn)酸量、pH 值為考察指標(biāo)，研究發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、乳酸菌接種量及預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌純種發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量和pH 值的影響，采用正交試驗(yàn)對(duì)乳酸菌純種發(fā)酵黃漿水制作酸漿的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定酸漿中有機(jī)酸的種類、含量，對(duì)乳酸菌誘變前、后的產(chǎn)酸條件及代謝通路進(jìn)行對(duì)比分析[12-15]，以期提高豆腐酸漿的產(chǎn)酸量，提高酸漿豆腐的品質(zhì)，為豐富酸漿豆腐風(fēng)味提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵酸漿用菌株為本實(shí)驗(yàn)室前期保存及誘變選育的鼠李糖乳桿菌 （Lactobacillus rhamnosus），分別編號(hào)為：HCUL 1.1801-1912 （哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院糧油學(xué)科實(shí)驗(yàn)室保藏）、HCUL 1.1901-1912（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院糧油學(xué)科實(shí)驗(yàn)室保藏，CGMCC 保藏登記入冊(cè)編號(hào)：19309）。文中涉及菌株均以編號(hào)代替。

黃漿水：哈爾濱商業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。

無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、酚酞均為分析純級(jí)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；氯化鎂（食品級(jí)），天津碩?；び邢薰?；琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品、草酸標(biāo)準(zhǔn)品、富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品、α-酮戊二酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品、丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品均為分析純級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FDM-Z100 自分離大豆磨漿機(jī)，鎮(zhèn)江新區(qū)大港晶晶食品機(jī)械廠；DHP-9052 培養(yǎng)箱，上海合恒儀器設(shè)備有限公司；HWS 水浴鍋，紹興萬(wàn)力儀器有限公司；PHS-3C pH 計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；HPLC I-Class 超高效液相色譜、LC-MS/MS XEVO TQ-XS 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜、ACQUITY UPLC BEH C8 反向色譜柱，美國(guó)Waters 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)技術(shù)路線 豆腐黃漿水→過(guò)濾滅菌→接菌發(fā)酵→單因素實(shí)驗(yàn)→正交優(yōu)化→有機(jī)酸檢測(cè)→代謝通路分析

1.3.2 菌株活化擴(kuò)培 采用MRS 肉湯培養(yǎng)基對(duì)乳酸菌HCUL 1.1901-1912 進(jìn)行活化，將前期保存的乳酸菌接種于10 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，再用接菌環(huán)將其接種于另一個(gè)裝有10 mL MRS 液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，經(jīng)過(guò)2～4 次活化后，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定其活菌數(shù)，直至培養(yǎng)基內(nèi)活菌數(shù)大于106CFU/mL，待用。

將預(yù)先活化好的乳酸菌以5%的接菌量接種于100 mL 滅菌的MRS 液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h 后，備用。

1.3.3 酸漿中產(chǎn)酸量及pH 值的測(cè)定 將5 mL待測(cè)液放入250 mL 的錐形瓶中，用排CO2后的蒸餾水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，滴3 滴指示液（0.1%）并搖勻，用0.1 mol/L NaOH 的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)試液進(jìn)行滴定，滴定終點(diǎn)為微紅色且30 s 不褪色，記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液的體積并計(jì)算其總產(chǎn)酸量[16-17]。

式中，C2——產(chǎn)酸量，g/L；C1——標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液濃度，mol/L；F——試液稀釋倍數(shù)；V1——滴定發(fā)酵液所消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2——滴定空白對(duì)照組所消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V3——待測(cè)發(fā)酵液體積，mL。

采用雷磁PHS-3C pH 計(jì)測(cè)定pH 值。

1.3.4 乳酸菌純種發(fā)酵黃漿水的產(chǎn)酸條件優(yōu)化

1.3.4.1 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酸量及pH 值的影響 將活化好的菌株HCUL 1.1901-1912 以12 h 的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，按5%的乳酸菌接種量接種于500 mL 滅菌的黃漿水中，分別置于32，35，37，39，42 ℃的培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵培養(yǎng)24 h，在無(wú)菌操作下取出少量發(fā)酵液，測(cè)其發(fā)酵液的總酸和pH 值，以產(chǎn)酸量和pH 值為指標(biāo)，考察發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵黃漿水的影響。

1.3.4.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸量及pH 值的影響 將活化好的菌株HCUL 1.1901-1912 以12 h 的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，按5%的乳酸菌接種量接種于500 mL 滅菌的黃漿水中，置于37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別發(fā)酵培養(yǎng)8，12，16，20，24 h，在無(wú)菌操作下取出少量發(fā)酵液，測(cè)其發(fā)酵液的總酸和pH 值，以產(chǎn)酸量和pH 值為指標(biāo)，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵黃漿水的影響。

1.3.4.3 乳酸菌接種量對(duì)產(chǎn)酸量及pH 值的影響 將活化好的菌株HCUL 1.1901-1912 以12 h 的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，分別按3%，4%，5%，6%，7%的乳酸菌接種量接種于500 mL 滅菌的黃漿水中，置于37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵培養(yǎng)24 h，在無(wú)菌操作下取出少量發(fā)酵液，測(cè)其發(fā)酵液的總酸和pH 值，以產(chǎn)酸量和pH 值為指標(biāo)，考察接種量對(duì)乳酸菌發(fā)酵黃漿水的影響。

1.3.4.4 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸量及pH 值的影響 將活化好的菌株HCUL 1.1901-1912 分別預(yù)培養(yǎng)8，10，12，14，16 h，按5%的接種量接種于500 mL滅菌的黃漿水中，置于37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵培養(yǎng)24 h，在無(wú)菌操作下取出少量發(fā)酵液，測(cè)其發(fā)酵液的總酸和pH 值，以產(chǎn)酸量和pH 值為指標(biāo)，考察預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵黃漿水的影響。

1.3.5 乳酸菌純種發(fā)酵黃漿水條件優(yōu)化試驗(yàn) 由于在不同的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、乳酸菌接種量及預(yù)培養(yǎng)時(shí)間下產(chǎn)酸量相差較大，為了得到更佳的工藝參數(shù)，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.6 酸漿中有機(jī)酸HPLC 分析法

1.3.6.1 樣品處理 自制酸漿（HCUL 1801-1912純種發(fā)酵酸漿、HCUL 1901-1912 純種發(fā)酵酸漿）經(jīng)4 000 r/min 離心20 min 后取上清液，經(jīng)0.45 μm 水系濾膜過(guò)濾，若有機(jī)酸濃度過(guò)高可以適當(dāng)稀釋，經(jīng)超聲脫氣后供分析使用。

1.3.6.2 有機(jī)酸HPLC 分析方法 色譜條件參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品有機(jī)酸的測(cè)定（GB 5009.157-2016）[17]，色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6 mm×250 mm，5 μm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：UV 210 nm；流動(dòng)相：用0.1%磷酸溶液+甲醇=97.5%+2.5%（體積分?jǐn)?shù)）流動(dòng)相等度洗脫10 min，然后用1 min 讓甲醇相達(dá)到100%并平衡5 min，再將流動(dòng)相調(diào)整為0.1%磷酸溶液+甲醇=97.5%+2.5%（體積分?jǐn)?shù)），平衡5 min。8 種有機(jī)酸在此條件下可以達(dá)到基線分離。

1.4 數(shù)據(jù)處理

有機(jī)酸數(shù)據(jù)使用TargetLynx 數(shù)據(jù)分析軟件。采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)曲法，以濃度對(duì)應(yīng)化合物峰面積與同位素峰面積的比值做線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)。使用此標(biāo)曲定量樣本。

本試驗(yàn)每組數(shù)據(jù)平行測(cè)定3 次，結(jié)果取平均值，并使用Spss16.0 統(tǒng)計(jì)軟件、Origin Pro 2018 軟件及Excel 軟件，對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及處理，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差并繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸條件優(yōu)化結(jié)果分析

不同發(fā)酵溫度對(duì)黃漿水的產(chǎn)酸量及pH 值的影響如圖1所示。不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃漿水的產(chǎn)酸量及pH 值的影響如圖2所示。不同接種量對(duì)黃漿水的產(chǎn)酸量及pH 值的影響如圖3所示。不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黃漿水的產(chǎn)酸量及pH 值的影響如圖4所示。

由圖1可知，隨著發(fā)酵溫度的不斷升高，產(chǎn)酸量先上升后下降，pH 值先下降后上升。當(dāng)發(fā)酵溫度從32 ℃升至37 ℃時(shí)，產(chǎn)酸量也在不斷上升，pH值不斷下降；當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到最高49.00 g/L，pH 值則達(dá)到最低3.6，說(shuō)明這株乳酸菌在此溫度下能夠很好的生長(zhǎng)繁殖，其代謝產(chǎn)生的酸也最多；發(fā)酵溫度在37 ℃之后繼續(xù)升高，產(chǎn)酸量開(kāi)始下降，pH 值開(kāi)始上升。這表明發(fā)酵溫度在一定范圍內(nèi)能夠促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，超過(guò)這一范圍則會(huì)限制其生長(zhǎng)，因此這株乳酸菌在黃漿水中的最適生長(zhǎng)繁殖溫度為37 ℃。

圖1 不同發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量及pH 值的影響Fig.1 Changes of acid production and pH values of the tofu whey during fermentation under different fermentation temperatures

由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)酸量也逐漸升高。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間由8 h 升至16 h 時(shí)，pH 值顯著下降，產(chǎn)酸量逐漸增加，說(shuō)明適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間會(huì)促進(jìn)菌株生長(zhǎng)，從而提高產(chǎn)酸量。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間由16 h 升至24 h 時(shí)，pH 值和產(chǎn)酸量變化趨于平穩(wěn)。隨著發(fā)酵時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，pH 值并沒(méi)有顯著降低，這說(shuō)明并非發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)越好，因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，乳酸菌產(chǎn)酸量過(guò)多，使發(fā)酵液內(nèi)的環(huán)境不適合乳酸菌的生長(zhǎng)，從而抑制乳酸菌發(fā)酵黃漿水的后發(fā)酵品質(zhì)，易污染雜菌。綜合發(fā)酵周期、產(chǎn)酸量等方面的因素，發(fā)酵時(shí)間在16 h 時(shí)發(fā)酵液的pH 值和產(chǎn)酸量均較好，此時(shí)發(fā)酵液pH 值為4.11，產(chǎn)酸量為66.01 g/L。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量及pH 值的影響Fig.2 Changes of acid production and pH values of the tofu whey during fermentation under different fermentation time

由圖3可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵24 h內(nèi)，酸漿的產(chǎn)酸量先增加后降低，pH 值先降低后升高，當(dāng)接種量為5%時(shí)，酸漿的pH 值下降最快，同時(shí)產(chǎn)酸量也增加最多，當(dāng)接種量超過(guò)5%時(shí)酸漿的pH 值開(kāi)始上升，產(chǎn)酸量逐漸下降，接種量為5%時(shí)酸漿的pH 值為3.6，產(chǎn)酸量為47.03 g/L。當(dāng)接種量過(guò)低，乳酸菌的生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致產(chǎn)酸速率較慢；當(dāng)接種量過(guò)大時(shí)，乳酸菌生長(zhǎng)過(guò)快，會(huì)造成發(fā)酵液內(nèi)菌體密度過(guò)高，抑制乳酸菌后期生長(zhǎng)，從而抑制其產(chǎn)酸。綜上所述，本研究選擇5%的乳酸菌接種量進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 不同接種量對(duì)發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量及pH 值的影響Fig.3 Changes of acid production and pH values of the tofu whey during fermentation under different inoculum amounts

由圖4可知，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間由8 h 升至12 h時(shí)，產(chǎn)酸量緩慢升高，pH 值顯著上升。當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間由12 h 升至16 h 時(shí)，產(chǎn)酸量迅速降低，pH 值緩慢降低后趨于平穩(wěn)。隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，pH 值并沒(méi)有顯著降低，這說(shuō)明并非預(yù)培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)越好。由于乳酸菌在8 h 時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期，綜合乳酸菌生長(zhǎng)周期、產(chǎn)酸量等方面的因素，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為8 h 時(shí)發(fā)酵液pH 值最好，產(chǎn)酸量較好，此時(shí)發(fā)酵液的pH 值為3.4，產(chǎn)酸量為46.04 g/L。

圖4 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量及pH 值的影響Fig.4 Changes of acid production and pH values of the tofu whey during fermentation under different preculture time

在乳酸菌發(fā)酵黃漿水單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、乳酸菌接種量、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為影響乳酸菌發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量的因素，其正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)L9（34）結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of the orthogonal experiment L9（34）

（續(xù)表2）

通過(guò)表2的正交試驗(yàn)結(jié)果可知，根據(jù)r 值確定影響乳酸菌發(fā)酵黃漿水產(chǎn)酸量的因素由主到次依次為：A（發(fā)酵時(shí)間）＞D（預(yù)培養(yǎng)時(shí)間）＞C（接種量）＞B（發(fā)酵溫度）；影響乳酸菌發(fā)酵黃漿水pH 值的因素由大到小依次為：D（預(yù)培養(yǎng)時(shí)間）＞B（發(fā)酵溫度）＞A（發(fā)酵時(shí)間）＞C（接種量）。由極差分析得出各因素的最優(yōu)組合，以產(chǎn)酸量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，得出最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件是A1D2C2B2；而以pH 值為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件為D3B2A2C2。最終選擇A2D2C2B2為最優(yōu)組合，即：發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間16 h，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間12 h，接種量5%。對(duì)比課題組前期優(yōu)化的誘變前菌株HCUL 1.1801-1912 純種發(fā)酵酸漿條件，即：發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間24 h，接種量5%，產(chǎn)酸量為39.3 g/L?？梢园l(fā)現(xiàn)HCUL 1.1901-1912 純種發(fā)酵酸漿所需的發(fā)酵時(shí)間及預(yù)培養(yǎng)時(shí)間都較HCUL 1.1801-1912 純種發(fā)酵酸漿所需發(fā)酵時(shí)間及預(yù)培養(yǎng)時(shí)間大大縮短。且HCUL 1.1901-1912 純種發(fā)酵酸漿的發(fā)酵終點(diǎn)產(chǎn)酸為43.11 g/L，比誘變前產(chǎn)酸量高了9.7%。因此，得出HCUL 1.1801-1912 純種發(fā)酵酸漿優(yōu)化后的條件不僅可以保證酸漿發(fā)酵效果，而且可以提高生產(chǎn)效率，對(duì)于酸漿發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)化及酸漿豆腐生產(chǎn)制作工業(yè)化提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

2.2 純種發(fā)酵酸漿有機(jī)酸組成及代謝通路分析

2.2.1 純種發(fā)酵酸漿有機(jī)酸組成分析 用HPLC法檢測(cè)純種發(fā)酵酸漿中的有機(jī)酸組成成分及含量，將誘變前、后菌株發(fā)酵的酸漿作為對(duì)比，其有機(jī)酸組成成分及含量如圖5、圖6所示。

圖5 菌株HCUL 1.1801-1912 及HCUL 1.1901-1912分別純種發(fā)酵2 種有機(jī)酸含量對(duì)比圖Fig.5 Two major organic acids concentrations fermented by HCUL 1.1801-1912 and HCUL 1.1901-1912

圖6 菌株HCUL 1.1801-1912 及HCUL 1.901-1912分別純種發(fā)酵6 種有機(jī)酸含量對(duì)比圖Fig.6 Six organic acids concentrations fermented by HCUL 1.1801-1912 and HCUL 1.1901-1912

由圖5、圖6有機(jī)酸HPLC 分析結(jié)果可知，HCUL 1.1801-1912 純種發(fā)酵的酸漿中8 種有機(jī)酸的含量從大到小分別為：乳酸2 374.78 μg/mL、檸檬酸977.46 μg/mL、琥珀酸35.21 μg/mL、草酸19.57 μg/mL、丙酮酸15.75 μg/mL、α-酮戊二酸9.56 μg/mL、蘋果酸4.16 μg/mL、富馬酸0.10 μg/mL，8 種有機(jī)酸總含量為3 436.61 μg/mL。由此可知，菌株HCUL 1.1801-1912 發(fā)酵黃漿水的過(guò)程中主要產(chǎn)乳酸，符合制作酸漿豆腐凝固劑的要求，適合用來(lái)點(diǎn)制酸漿豆腐。

HCUL 1.1901-1912 純種發(fā)酵的酸漿中8 種有機(jī)酸的含量從大到小分別為：乳酸2 904.16 μg/mL、檸檬酸1 106.87 μg/mL、琥珀酸110.67 μg/mL、丙酮酸28.91 μg/mL、草酸19.64 μg/mL、蘋果酸18.58 μg/mL、α-酮戊二酸11.24 μg/mL、富馬酸4.90 μg/mL，8 種有機(jī)酸總含量為4 204.99 μg/mL，其中乳酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、富馬酸分別較誘變前純種發(fā)酵的酸漿提高了1.22，1.13，3.14，1.84，0.01，4.47，1.18，49.00 倍，由此可知，菌株HCUL 1.1901-1912 發(fā)酵黃漿水的過(guò)程中主要產(chǎn)乳酸，其次是檸檬酸，其它有機(jī)酸含量較低。

2.2.2 純種發(fā)酵酸漿的有機(jī)酸代謝通路分析 根據(jù)對(duì)乳酸菌代謝通路的研究，結(jié)合酸漿中有機(jī)酸含量變化，繪制圖7為乳酸菌發(fā)酵黃漿水的代謝通路圖。

圖7 乳酸菌發(fā)酵黃漿水的代謝通路圖（μg/mL）Fig.7 Organic acid metabolic pathway of fermented tofu whey cultured by lactic acid bacteria （μg/mL）

由圖7可知，乳酸菌加入黃漿水后，利用黃漿水本身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵。葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)生糖酵解反應(yīng)生成丙酮酸。丙酮酸在L-乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸，在未破碎細(xì)胞的情況下進(jìn)行有機(jī)酸檢測(cè)，測(cè)得的丙酮酸含量較低，乳酸含量很高。這是由于丙酮酸主要作為代謝中間產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，只有少量丙酮酸在胞外分泌，而乳酸作為初級(jí)代謝產(chǎn)物大部分分泌到胞外環(huán)境。這解釋了丙酮酸與乳酸之間為可逆反應(yīng)，然而檢測(cè)出的結(jié)果顯示乳酸含量遠(yuǎn)大于丙酮酸。丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下生成草酰乙酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)。草酰乙酸作為代謝中間產(chǎn)物，在胞內(nèi)反應(yīng)，因此在胞外的含量極低，以至于無(wú)法檢測(cè)到。草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶的作用下與蘋果酸發(fā)生可逆反應(yīng)，同時(shí)蘋果酸在蘋果酸脫氫酶（醌）的作用下生成草酰乙酸，檢測(cè)出蘋果酸含量卻未檢測(cè)出草酰乙酸含量，是由于大部分草酰乙酸轉(zhuǎn)換為蘋果酸，而少量蘋果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，說(shuō)明蘋果酸脫氫酶（醌）為惰性酶。蘋果酸在富馬酸水合酶的作用下與富馬酸發(fā)生可逆反應(yīng)，檢測(cè)出的蘋果酸含量大于富馬酸含量，富馬酸在琥珀酸脫氫酶作用下與琥珀酸發(fā)生可逆反應(yīng)，檢測(cè)出的琥珀酸含量也遠(yuǎn)大于富馬酸含量。草酰乙酸在乙醛氧化酶作用下生成草酸，草酸在草酸脫酸酶作用下生成富馬酸，檢測(cè)出的草酸含量大于富馬酸含量。產(chǎn)生此結(jié)果是由于富馬酸不斷在胞內(nèi)進(jìn)行三羧酸反應(yīng)，只有少量富馬酸在胞外被檢測(cè)到。富馬酸代謝生成絡(luò)氨酸和精氨酸，是三羧酸循環(huán)中重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。琥珀酸先生成琥珀酰-CoA，琥珀酰-CoA再生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸代謝生成精氨酸、抗壞血酸、醛酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和D-谷氨酸。α-酮戊二酸生成異檸檬酸，異檸檬酸生成烏頭順?biāo)幔瑸躅^順?biāo)嵘蓹幟仕?，這個(gè)過(guò)程中檸檬酸含量大幅提升，說(shuō)明這幾個(gè)過(guò)程的酶都比較活躍，檸檬酸在ATP 檸檬酸合酶的作用下又生成草酰乙酸，實(shí)現(xiàn)三羧酸循環(huán)[18-20]。產(chǎn)酸含量的差異對(duì)酸漿豆腐的風(fēng)味、蛋白凝聚效果等均會(huì)產(chǎn)生影響[21-22]。

3 結(jié)論

本研究對(duì)酸漿發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、乳酸菌接種量及預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從中選擇對(duì)純種乳酸菌發(fā)酵影響最大的4 因素3 水平進(jìn)行正交試驗(yàn)[23-26]。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到黃漿水純種發(fā)酵產(chǎn)酸量最佳的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間16 h，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間12 h，接種量5%，產(chǎn)酸量達(dá)6.57 g/L。將HCUL 1.1901-1912 純種發(fā)酵黃漿水得到的酸漿和HCUL 1.1801-1912 純種發(fā)酵黃漿水得到的酸漿進(jìn)行有機(jī)酸對(duì)比分析，可知誘變后的耐高溫菌HCUL 1.1901-1912 有機(jī)酸種類不變，且各個(gè)有機(jī)酸含量均大幅增長(zhǎng)，特別是乳酸的含量顯著提高[27]。其中乳酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、富馬酸分別較誘變前的乳酸菌HCUL 1.1801-1912 純種發(fā)酵的酸漿提高了1.22，1.13，3.14，1.84，0.01，4.47，1.18，49.00 倍。不同種類的有機(jī)酸含量增長(zhǎng)可在一定程度上豐富酸漿豆腐產(chǎn)品的風(fēng)味及蛋白凝聚性[28]。因此，本研究得到的乳酸菌純種發(fā)酵酸漿優(yōu)化條件，可以為以黃漿水為發(fā)酵基質(zhì)開(kāi)發(fā)的發(fā)酵凝固劑提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。