焦 雪，余 庭，方結(jié)紅，唐 標(biāo)，汪 雯，蔣 晗*

（1 中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310018 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310021）

抗生素因可治療細(xì)菌性疾病，并可在低劑量下促生長(zhǎng)，故被廣泛應(yīng)用乃至濫用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，由此引發(fā)了嚴(yán)重的水產(chǎn)源微生物耐藥性問(wèn)題[1]。研究表明，耐藥微生物不僅能在水產(chǎn)品體內(nèi)、養(yǎng)殖環(huán)境和供應(yīng)鏈等環(huán)節(jié)中殘留，還可通過(guò)食物鏈等多種途徑進(jìn)一步傳遞到人體中，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重危害[2]。

整合子因在水產(chǎn)源細(xì)菌耐藥基因快速傳播中發(fā)揮至關(guān)重要的作用而備受關(guān)注[3-4]。它是一種可以定位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或染色體上的遺傳元件，通常由5’保守末端、3’保守末端和兩者之間嵌有耐藥基因盒的可變區(qū)組成[5]。整合子既可通過(guò)位點(diǎn)特異性基因重組來(lái)捕獲、整合或剪切基因盒，使耐藥基因在細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移，也可借助接合型質(zhì)粒等可移動(dòng)元件進(jìn)行整體橫向傳播，從而增強(qiáng)細(xì)菌在抗生素等壓力下的生存適應(yīng)性[6]。然而，當(dāng)外界抗生素壓力解除時(shí)，整合子會(huì)成為細(xì)菌的額外負(fù)擔(dān)，其適應(yīng)環(huán)境的能力可能會(huì)小于野生型菌株，這一現(xiàn)象被稱為適應(yīng)性代價(jià)[7]。如果適應(yīng)性代價(jià)很大，當(dāng)無(wú)抗生素壓力時(shí)，耐藥細(xì)菌就無(wú)法和野生型菌株競(jìng)爭(zhēng)，容易被淘汰。反之，如果適應(yīng)性代價(jià)小，整合子既可以在無(wú)抗生素壓力時(shí)得到保留，又可以使其宿主菌很快適應(yīng)外界環(huán)境中的抗生素壓力并介導(dǎo)耐藥基因的水平傳播[8-9]。較低的適應(yīng)性代價(jià)是整合子介導(dǎo)耐藥基因廣泛傳播與流行的重要生物學(xué)基礎(chǔ)[10]。

依據(jù)氨基酸序列的不同，整合子可分為5 種類型，日常食用的水產(chǎn)品中已監(jiān)測(cè)到攜帶I 型和II 型整合子的細(xì)菌，尤以大腸桿菌居多[11-12]。其中II 型整合子發(fā)現(xiàn)時(shí)間相對(duì)較晚，因其有別于I 型整合子的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和仍未清晰的傳播機(jī)制，近年來(lái)日益受到關(guān)注[13]。然而，II 型整合子在相關(guān)宿主菌中的適應(yīng)性代價(jià)尚未闡明，嚴(yán)重制約了對(duì)其在水產(chǎn)品中傳播機(jī)制的深入理解。鑒于此，本研究采集浙江省市售南美白對(duì)蝦、牡蠣和大黃魚(yú)樣品，分離鑒定大腸桿菌，分析其II 型整合子攜帶情況和結(jié)構(gòu)特征，比較攜帶II 型整合子的大腸桿菌在無(wú)抗環(huán)境和抗生素亞抑制濃度下適應(yīng)性代價(jià)的差異，為進(jìn)一步揭示II 型整合子介導(dǎo)的耐藥基因在水產(chǎn)源耐藥微生物中的傳播機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為打造有效的食源性致病菌耐藥防控鏈提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：2019年3月至2021年3月，從浙江省杭州市各大型超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買南美白對(duì)蝦、牡蠣和大黃魚(yú)樣品各200 份。

試劑：伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、LB 瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；抗生素藥敏片，杭州微生物試劑有限公司；克隆菌株大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α 和質(zhì)控菌株大腸桿菌（E.coli）ATCC25922，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；PlatinumTMTaq 高保真DNA 聚合酶，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Ex Taq DNA 聚合酶、瓊脂糖、DNA marker、切膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組DNA 試劑提取盒、質(zhì)粒DNA 提取試劑盒等，寶生物工程（大連）有限公司；pEASY-T1 載體，北京全式金生物技術(shù)有限公司；所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

儀器：BD AccuriC6 流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD Biosciences 公司；Arktik PCR 儀，賽默飛世爾科技（中國(guó)） 有限公司；Allegra X-30R 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman 公司；電泳及凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 每份樣品用獨(dú)立無(wú)菌均質(zhì)袋封裝后，置于4 ℃保溫箱，2 h 內(nèi)低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品前處理。無(wú)菌條件下，將樣品切碎，按1 g/mL 加入無(wú)菌生理鹽水，均質(zhì)2 min，取均質(zhì)液50 μL，接種入5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.2 大腸桿菌的分離與分子鑒定 將過(guò)夜培養(yǎng)的均質(zhì)液劃線接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取平板上具黑色中心有綠色金屬光澤的典型菌落進(jìn)行PCR 分子鑒定（每份樣品挑取1 株大腸桿菌作為代表）。靶標(biāo)基因?yàn)榇竽c桿菌特異基因uidA （Genbank ID：S69414），PCR 引物序列見(jiàn)表1。取過(guò)夜培養(yǎng)的待測(cè)菌液1 μL，加入30 μL Tri-HCl 緩沖液，金屬浴煮沸5 min，4 ℃冷卻2 min，12 000×g 離心2 min，取上清液用作PCR 反應(yīng)DNA 模板。PCR 反應(yīng)體系為：0.25 μL Ex Taq，5 μL 10×Ex Taq buffer，4 μL dNTPs，2 μL 上游引物（10 μmol/L），2 μL 下游引物（10 μmol/L），1 μL DNA 模板，35.75 μL 滅菌去離子水；反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35 次后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 II 型整合子的分離鑒定及結(jié)構(gòu)分析 通過(guò)PCR 方法檢測(cè)II 型整合酶基因intI2，分析大腸桿菌分離株攜帶II 型整合子情況。PCR 引物序列見(jiàn)表1，反應(yīng)體系同1.2.2 節(jié)，反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性30 s，55 ℃梯度退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

進(jìn)一步分析intI2 基因陽(yáng)性的大腸桿菌分離株的II 型整合子完整結(jié)構(gòu)。根據(jù)II 型整合子5'-CS 和3'-CS 序列設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物P1，P2，引物序列見(jiàn)表1。利用Platinum 高保真混合DNA 聚合酶對(duì)II 型整合子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系：45 μL Platinum PCR SuperMix，1 μL 引 物P1（10 μmol/L），1 μL 引物P2（10 μmol/L），2 μL DNA 模板，1 μL 滅菌去離子水；PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸4 min，32 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定和切膠回收。利用GeneArt Seamless Cloning & Assembly 克隆試劑盒，將切膠回收的II 型整合子與pEASY-T1 克隆載體進(jìn)行連接。連接 反應(yīng)體系為：5 μL GeneArt 2×Enzyme Mix，2 μL 切膠回收產(chǎn)物，1 μL pEasy-T1 （Xho I/Bam HI），1 μL 滅菌去離子水；反應(yīng)條件：室溫放置20 min 后，冰上放置2～3 min。連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，挑選陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 進(jìn)行比對(duì)分析，獲得II 型整合子結(jié)構(gòu)。

表1 引物信息表Table 1 Primer sequences information

1.2.4 II 型整合子陽(yáng)性大腸桿菌的藥敏分析 根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推薦的Kirby-Bauer 紙片擴(kuò)散法測(cè)定28 株II 型整合子陽(yáng)性大腸桿菌分離株對(duì)9 大類18 種抗生素的藥敏性，質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922。按照CLSI（2019）推薦的標(biāo)準(zhǔn)判定分離株對(duì)該抗生素敏感（Susceptible，S）、中介（Intermediate，I）或耐藥（Resistance，R）[16]。18 種抗生素的藥敏片濃度及耐藥折點(diǎn)如表2所示。對(duì)3 類或以上抗生素耐藥的大腸桿菌記為多重耐藥菌。

表2 抗生素種類、藥敏片含量和耐藥折點(diǎn)Table 2 The category，concentration and breakpoint of the antibiotics used for Kirby-Bauer susceptibility test

1.2.5 II 型整合子適應(yīng)性代價(jià)研究用大腸桿菌基因工程菌構(gòu)建 適應(yīng)性代價(jià)研究用質(zhì)粒pAKM 和大腸桿菌基因工程菌大腸桿菌MG1656 λatt∶∶gfp為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。質(zhì)粒pAKM 含p15a 低拷貝復(fù)制子、卡那霉素抗性基因和多克隆位點(diǎn)。菌株大腸桿菌MG1656 λatt∶∶gfp 在不引入適應(yīng)性代價(jià)的λatt 位點(diǎn)插入組成型表達(dá)的gfp 基因，可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白GFP。將質(zhì)粒pAKM 轉(zhuǎn)化至菌株大腸桿菌MG1656 λatt∶∶gfp，獲得適應(yīng)性代價(jià)研究對(duì)照菌株LC。將II 型整合子與質(zhì)粒pAKM 連接，構(gòu)建含典型II 型整合子基因盒的質(zhì)粒pAKMintI2*-3GC 和含非典型II 型整合子基因盒的質(zhì)粒pAKM-intI2*-4GC，將2 個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至菌株大腸桿菌MG1656 λatt∶∶gfp，獲得試驗(yàn)菌株LA1和LA2。

1.2.6 大腸桿菌基因工程菌最小抑菌濃度測(cè)定參照CLSI 推薦的微量營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋法測(cè)定鏈霉素對(duì)照菌株LC 的最小抑菌濃度 （Minimal inhibitory concentration，MIC）[16]。

1.2.7 II 型整合子適應(yīng)性代價(jià)分析 參照文獻(xiàn)[17]的方法，利用競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)法分析II 型整合子的適應(yīng)性代價(jià)。將試驗(yàn)菌株LA1、LA2 與對(duì)照菌株LC 在LB 液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)后，按1∶1（體積比）混合，每培養(yǎng)24 h 后以1∶100（體積比）接種至新鮮LB 液體培養(yǎng)基，連續(xù)轉(zhuǎn)接4 次，共培養(yǎng)5 d。競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)混合液每轉(zhuǎn)接前取100 μL 樣品，通過(guò)BD AccuriC6 流式細(xì)胞儀測(cè)定混合液中含GFP 蛋白細(xì)胞數(shù)量和總細(xì)胞數(shù)量，從而獲得試驗(yàn)菌株LA1 或LA2 相對(duì)于對(duì)照菌株LC 的相對(duì)頻數(shù)F（Fnon-GFP/FGFP）。

以競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中獲得的相對(duì)頻數(shù)自然對(duì)數(shù)lnF為因變量y，以時(shí)間（d）為自變量x，擬合線性回歸方程y=kx+b。試驗(yàn)菌株相對(duì)于對(duì)照菌株的適應(yīng)性代價(jià)選擇系數(shù)S=k/ln（1/t），t——稀釋倍數(shù)（1∶100）。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)做3 個(gè)重復(fù)。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和最小顯著差異法（Least significant difference）比較不同數(shù)據(jù)組間的差異。采用SPSS（Version 20.0）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用GraphPad Prism 8 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水產(chǎn)源大腸桿菌的分離鑒定

本研究采集了浙江省市售南美白對(duì)蝦、牡蠣和大黃魚(yú)樣品各200 份，預(yù)處理并培養(yǎng)后挑取具黑色中心有綠色金屬光澤的大腸桿菌疑似菌落（圖1a），以大腸桿菌特異基因uidA 為靶標(biāo)進(jìn)行PCR 鑒定（圖1b），共分離到278 株大腸桿菌，其中93 株來(lái)自南美白對(duì)蝦樣品，102 株來(lái)自牡蠣樣品，83 株來(lái)自大黃魚(yú)樣品，大腸桿菌總分離率為46.3%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大腸桿菌因在水產(chǎn)品中宿主廣泛、易通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因，常成為耐藥基因的蓄積庫(kù)和傳播媒介，故大腸桿菌也被用作監(jiān)測(cè)環(huán)境中耐藥基因或元件的指示菌[18-19]。

圖1 大腸桿菌的選擇性分離與PCR 分子鑒定Fig.1 Selective isolation and PCR molecular identification of Escherichia coli

2.2 II 型整合子的分離鑒定及結(jié)構(gòu)分析

278 株水產(chǎn)源大腸桿菌中，有28 株（10.1%）II型整合酶基因intI2 陽(yáng)性（圖2a），其中27 個(gè)II 型整合子全長(zhǎng)約3 200 bp （圖2b），1 個(gè)II 型整合子全長(zhǎng)約4 000 bp（圖2c）。

圖2 II 型整合子的分離鑒定Fig.2 Isolation and identification of class II integrons

對(duì)28 個(gè)II 型整合子全長(zhǎng)擴(kuò)增片段進(jìn)行回收測(cè)序和BLAST 比對(duì)分析，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道繪制出基本結(jié)構(gòu)[5-6，20-21]。28 個(gè)II 型整合子的基本結(jié)構(gòu)如圖3所示：（1）II 型整合酶基因intI2，編碼II 型整合酶；本研究分離到的28 個(gè)II 型整合子均含缺陷型整合酶，即intI2 在第178 位氨基酸后出現(xiàn)終止密碼子TAA，致使其無(wú)法表達(dá)出完整的具有催化活性的整合酶蛋白，故標(biāo)為intI2*。（2）attI 重組位點(diǎn)，可特異性組合attC 重組位點(diǎn)，用以整合和捕獲基因盒。（3）Pc 啟動(dòng)子，負(fù)責(zé)可變區(qū)內(nèi)基因盒轉(zhuǎn)錄表達(dá)；II 型整合子的Pc 啟動(dòng)子有Pc2A，Pc2B，Pc2C 和Pc2D，共4 個(gè)。（4）Pint2啟動(dòng)子負(fù)責(zé)整合酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)，方向與Pc 的方向相反。（5）嵌有耐藥基因盒的可變區(qū)：27 個(gè)片段的耐藥基因盒陣列為dfrA1-sat2-aadA1，1 個(gè)片段的耐藥基因盒陣列為dfrA1-catB2-sat2-aadA1（分別為介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)甲氧芐氨嘧啶耐藥的二氫葉酸還原酶基因dfrA1，介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)鏈霉素耐藥的鏈絲菌素轉(zhuǎn)乙酰酶基因sat2，介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)鏈霉素和大觀霉素耐藥的氨基糖苷類腺苷轉(zhuǎn)移酶基因aadA1 和介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)氯霉素耐藥的乙?；D(zhuǎn)移酶基因catB2）。（6）3’CS 保守序列。

研究表明，流行最廣的典型II 型整合子包含缺陷型整合酶基因intI2* 與耐藥基因盒陣列dfrA1-sat2-aadA1（圖3A），該類II 型整合子雖有attI 和attC 重組位點(diǎn)，但因?yàn)檎厦傅娜毕?，?dǎo)致其理論上僅能表達(dá)耐藥基因，不具備捕獲和剪切的功能[22]，因此，耐藥基因盒的陣列也相對(duì)固定。近年來(lái)，越來(lái)越多的新型II 型整合子基因盒陣列被發(fā)現(xiàn)，如本研究獲得的dfrA1-catB2-sat2-aadA1也曾在變形桿菌屬 （Proteus）、嗜水氣單胞菌屬（Aeromonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和希瓦氏菌屬（Shewanella）等菌中分離到的II 型整合子中發(fā)現(xiàn)過(guò)[23]，說(shuō)明II型整合子仍然具有剪切捕獲耐藥基因和在不同細(xì)菌間傳播的功能，只是不依賴或不完全依賴II 型整合酶的作用[23]。此外，II 型整合子在自然界中沒(méi)有I 型整合子流行廣泛和耐藥基因盒多樣，然而仍具備重要的傳播耐藥基因的能力，其整合酶的特殊結(jié)構(gòu)可能是為了維持功能進(jìn)化與適應(yīng)性代價(jià)間的平衡[13]。

圖3 II 型整合子結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Structure chart of class II integrons

2.3 II 型整合子陽(yáng)性大腸桿菌的藥敏分析

對(duì)28 株II 型整合子陽(yáng)性大腸桿菌分離株進(jìn)行耐藥分析，發(fā)現(xiàn)均為多重耐藥菌，且共有17 種耐藥表型組合，耐藥模式多樣化（表3）。其中所有菌株都對(duì)甲氧芐氨嘧啶、鏈霉素和大觀霉素耐藥，可能與II 型整合子耐藥基因盒發(fā)揮相關(guān)作用有關(guān)。

表3 28 株II 型整合子陽(yáng)性大腸桿菌分離株的耐藥譜Table 3 Drug resistance spectra of 28 class II integron positive Escherichia coli isolates

2.4 適應(yīng)性代價(jià)分析

根據(jù)選擇系數(shù)S 值可判斷試驗(yàn)菌株的適應(yīng)性代價(jià)，若S＞0，說(shuō)明菌株適應(yīng)性良好；若S＜0，則菌株有適應(yīng)性代價(jià)，且絕對(duì)值越大適應(yīng)性代價(jià)越大[17]。如圖4所示，在無(wú)抗LB 培養(yǎng)條件下，試驗(yàn)菌株LA1 和LA2 相對(duì)于對(duì)照菌株LC 的選擇系數(shù)S依次為-0.068±0.006 和-0.117±0.009，均小于0，表明攜帶II 型整合子的大腸桿菌在不含抗生素的環(huán)境下存在適應(yīng)性代價(jià)。此外，試驗(yàn)菌株LA2 比LA1 多1 個(gè)catB2 耐藥基因盒，生長(zhǎng)速率又下降了4.9%，說(shuō)明基因盒的數(shù)量和種類在一定程度上也影響整合子陽(yáng)性菌株的適應(yīng)性代價(jià)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，I 型整合子陽(yáng)性的大腸桿菌工程菌選擇系數(shù)S在-0.013±0.002 至-0.04±0.003 之間，即大腸桿菌的生長(zhǎng)速率下降在1.3%～4%之間，顯著低于II型整合子（P＜0.05），這可能也是環(huán)境中I 型整合子比II 型整合子數(shù)量多且基因盒類型豐富的主要原因之一。

圖4 II 型整合子陽(yáng)性大腸桿菌基因工程菌在無(wú)抗和抗生素亞抑制濃度下的適應(yīng)性代價(jià)選擇系數(shù)SFig.4 Fitness cost selection coefficient S of class II integron positive Escherichia coli genetically engineered bacteria in the absence of antibiotics and at subinhibitory concentrations of antibiotics

在亞抑制濃度試驗(yàn)中，因本次分離到的II 型整合子基因盒以及試驗(yàn)菌株LA1 和LA2 均含鏈霉素耐藥基因，而對(duì)照菌株LC 不含鏈霉素耐藥基因，故選擇鏈霉素作為亞抑制濃度下競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)的代表抗生素。鏈霉素對(duì)對(duì)照菌株LC 的MIC 值為8 μg/mL，以40%MIC（3.2 μg/mL 鏈霉素）和20%MIC（1.6 μg/mL 鏈霉素）作為亞抑制濃度值。如圖4所示，在抗生素亞抑制濃度 （40%MIC 和20%MIC）下，2 類II 型整合子的選擇系數(shù)S 均大于0，適應(yīng)性良好。在20%MIC 時(shí)，試驗(yàn)菌株LA1 的S值為0.047 ± 0.005，LA2 的S 值為0.107 ± 0.010；在40%MIC 時(shí)，試驗(yàn)菌株LA1 的S 值為0.138 ±0.003，LA2 的S 值為0.144±0.012。40%MIC 下的菌株適應(yīng)性顯著好于20%MIC 下的適應(yīng)性，且亞抑制濃度下菌株適應(yīng)性顯著好于無(wú)抗條件下的菌株適應(yīng)性（P＜0.05）。因此，環(huán)境中低濃度抗生素有利于II 型整合子在宿主菌中的維持和富集，從而促進(jìn)其有效應(yīng)對(duì)外界抗生素壓力以及在細(xì)菌間傳播擴(kuò)散。

3 結(jié)論

采集浙江省市售南美白對(duì)蝦、牡蠣和大黃魚(yú)樣品各200 份，分離到大腸桿菌278 株，其中28株攜帶II 型整合子且均為多重耐藥菌株，耐藥模式多樣。對(duì)II 型整合子進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析可得，整合酶均為缺陷型，其中27 個(gè)含典型耐藥基因盒dfrA1-sat2-aadA1，1 個(gè)含非典型基因盒 dfrA1-catB2-sat2-aadA1。此外，攜帶II 型整合子的大腸桿菌工程菌在抗生素亞抑制濃度下選擇系數(shù)S 均大于0，適應(yīng)性良好，然而在無(wú)抗環(huán)境下均有明顯的適應(yīng)性代價(jià)。綜上，II 型整合子在水產(chǎn)源大腸桿菌中已有一定比例，且低濃度抗生素有利于其維持和富集，從而促進(jìn)其有效應(yīng)對(duì)外界抗生素壓力以及在細(xì)菌間的傳播擴(kuò)散。