韓秀娥，秦蘭霞，邵 紅，任浩威

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院 哈爾濱 150030）

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（Transglutaminase.EC2.3.2.13，TGase），又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，廣泛存在于哺乳動物、魚類、植物、細菌、真菌和綠藻等生物中[1-9]，具有催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，蛋白質(zhì)和氨基酸間連接，以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺酰胺基的水解功能。通過TGase 催化反應能提高蛋白質(zhì)的彈性、發(fā)泡性、溶解性、乳化性、持水性和熱穩(wěn)定性，從而改善蛋白質(zhì)功能特性，在食品工業(yè)中具有很好的應用前景[9-19]。

國內(nèi)使用的產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶菌株的產(chǎn)酶量低，酶活低。為解決目前谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的生產(chǎn)成本過高，產(chǎn)量不能滿足市場需求等問題，需要獲得一株高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的菌株。隨著基因工程的飛速發(fā)展，利用基因工程手段生產(chǎn)酶制劑和生物制藥得到廣泛應用[20-25]。采用基因工程的方法獲得具有自主知識產(chǎn)權的產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶菌株，是解決目前問題的一個重要手段。

畢赤酵母是一種單細胞的真核生物，在小量培養(yǎng)基和大規(guī)模生物反應器中都能快速生長。同其它表達系統(tǒng)一樣，在實際應用和生產(chǎn)中，畢赤酵母高效生產(chǎn)外源蛋白受許多因素的影響[26-30]。本課題的主要目的是將前期構建的重組表達質(zhì)粒pPIC9K-TGZ，經(jīng)Sac I 線性化處理，電轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母GS115，優(yōu)選出最佳表達條件，為下游蛋白提純及酶的生物功能特性研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

巴斯德畢赤酵母 （Pichia pastoris）GS115、質(zhì)粒酵母表達載體pPIC9K-TGZ，東北農(nóng)業(yè)大學乳品重點實驗室。各種限制性內(nèi)切酶，TaKaRa 公司；酵母基因組DNA 提取試劑盒，TIANGEN。

異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），上海華舜生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，OXOID 公司；丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、Tris-Base、四甲基已二銨（TEMED）、過硫酸銨（APS）、甘氨酸、酵母氮源培養(yǎng)基（YNB），GIBCO 公司；蛋白分子量標準，F(xiàn)ermentas；TritonX-100、EB （溴化乙錠），美國Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化及篩選 畢赤酵母轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)化法。重組質(zhì)粒pPIC9K-TGZ 經(jīng)Sac I 線性化處理電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞畢赤酵母GS115。以空質(zhì)粒pPIC9K 作為陰性對照。電轉(zhuǎn)化參數(shù)為：電壓2 000 V，脈沖5 ms，溫度0 ℃。電擊結束后，立即加入1 mL 預冷的1 mol/L 山梨醇。將混合物轉(zhuǎn)移到滅菌離心管中，30 ℃靜置培養(yǎng)1.5 h，取轉(zhuǎn)化物均勻涂布于含100 μg/mL 博來霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖選擇平板上。

1.2.2 酵母重組子的聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）鑒定 以重組酵母菌GS115/pPIC9K-TGZ DNA 作為模板，以α-因子引物：5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′；3′AOX1 基因家族：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′作 為引物進行PCR 鑒定。挑取一個空白表達載體pPIC9K 轉(zhuǎn)化的重組菌GS115/pPIC9K 作為對照，進行相同處理。PCR 反應程序為：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。

1.2.3 玉米TGase 基因在酵母中的表達 Mut+型胞內(nèi)或分泌表達（空載體作對照）：（1）接種一單菌落到25 mL 的BMGY 培養(yǎng)基中，28～30 ℃培養(yǎng)（250～300 r/min），使OD600nm=2～6（約16～18 h），細胞處于對數(shù)生長期；（2）1 500×g 室溫離心5 min，收集細胞，移入100 mL BMMY 培養(yǎng)基中，用3～4層滅菌紗布封口，置于28 ℃遙床培養(yǎng)；（3）每24 h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇，使其添加量為0.5%（體積分數(shù)），維持誘導；（4）按下面時間間隔每隔一定時間取樣1 mL 來分析表達水平，以確定最佳誘導時間。以最大轉(zhuǎn)速在室溫條件下離心2～3 min 收集菌體；（5） 取樣時間點為（h）：0，24，48，72，96；（6）對分泌型表達來說，應將上清轉(zhuǎn)移至單獨的管中，并將其與細胞沉淀同時貯于-80 ℃直至檢測?？煽焖賰鲇谝旱蚋杀?。對胞內(nèi)表達而言，棄上清，僅需將細胞沉淀貯于-80 ℃直至檢測。沉淀中加入100 μL ddH2O，渦旋振蕩混勻后加入25 μL 5×SDS 凝膠加樣緩沖液，繼續(xù)混合20 s。樣品經(jīng)沸水浴處理5 min 后進行SDS-PAGE 電泳分析。

1.2.4 重組TGase 表達條件的優(yōu)化

1）最佳誘導表達時間的確定 接種一酵母工程菌GS115/pPIC9k-TGZ 單菌落到25 mL 的BMGY 培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)（250～300 r/min），使OD600nm=2～6（約16～18 h），細胞處于對數(shù)生長期，1 500×g 室溫離心5 min 收集細胞，移入100 mL BMMY 培養(yǎng)基中，用3～4 層滅菌紗布封口，置于28 ℃搖床培養(yǎng)，每24 h 加入培養(yǎng)基體積0.5%的甲醇，維持誘導；按0，24，48，72，96，120，144，168 h 的時間間隔取樣，以12 000×g 離心2～3 min 收集上清，測酶活，確定誘導表達的最佳時間。

2）菌體起始誘導密度對目的蛋白表達的影響 按（1）的方法誘導表達，當菌體生長24 h 后，離心收集細胞，按不同光密度值的菌種量轉(zhuǎn)入表達培養(yǎng)基BMMY（pH 6.0）中培養(yǎng)96 h，每隔24 h加入培養(yǎng)基體積0.5%的甲醇，以12 000×g，離心2～3 min 收集上清，測酶活，確定菌體起始誘導密度對目的蛋白表達的影響。

3）起始pH 值對目的蛋白表達水平的影響按（1）的方法培養(yǎng)細胞、誘導表達，接種的表達培養(yǎng)基pH 值分別為5.0，5.25，5.5，5.75，6.0，6.25，6.5，6.75，7.0，確定不同起始pH 值對目的蛋白表達水平的影響。

4）不同氮源對目的蛋白表達水平的影響 按（1）的方法培養(yǎng)細胞、誘導表達，分別接入BMMY、BMM、BMM＋AA （分別添加20 種氨基酸，20 mg/種）表達培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測不同氮源對目的蛋白表達水平的影響。

5）甲醇濃度對目的蛋白表達的影響 按（1）的方法培養(yǎng)細胞、誘導表達，每隔24 h 加入甲醇使其占培養(yǎng)基體積分別為：0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%。以12 000×g，離心2～3 min 收集上清，測酶活，確定不同甲醇濃度對目的蛋白表達的影響。

6）誘導溫度對目的蛋白表達量的影響 按（1）的方法培養(yǎng)細胞、誘導表達，誘導溫度分別從15～30 ℃，確定表達量。

7）甲醇流加方式對目的蛋白表達量的影響按（1）的方法培養(yǎng)細胞、誘導表達，分別設定每隔8，12，16，20，24 h 流加甲醇，至其占培養(yǎng)基體積的0.6%，24 ℃誘導，確定添加甲醇的最佳時間。

8）誘導后階段添加適量甘油對表達的影響按（1）的方法培養(yǎng)細胞誘導表達，在誘導的48 h開始每24 h 添加甘油，甘油的添加量分別為0，0.5，1，2，3，4，5 g/L，確定甘油的最佳添加量。

9）酵母工程菌表達條件的正交優(yōu)化 將甲醇添加量、誘導時間、菌體起始密度及起始pH 值按照4 因素5 水平L25（54）設計正交試驗，因素水平設計見表1。

表1 畢赤酵母基因工程菌表達條件正交設計Table 1 The orthogonal design of expression condition of Pichi yeast

2 結果與分析

2.1 重組酵母菌株的PCR 鑒定

由圖1可以看出，利用TGase 特異性引物，從GS115/pPIC9K-TGase 轉(zhuǎn)化酵母菌的基因組中PCR 得到目的片段，而從pPIC9K 空載體轉(zhuǎn)化酵母菌基因組中，并沒有擴增到相應的目的帶，說明目的基因已很好的整合到酵母染色體中。

圖1 重組菌株的PCR 鑒定Fig.1 Identification of GS115/pPIC9k-TGZ by PCR

2.2 重組蛋白的表達

挑取pPIC9K-TGZ 酵母單菌落，用1%甲醇誘導表達，以轉(zhuǎn)化pPIC9K 空質(zhì)粒的菌株同樣條件培養(yǎng)作對照，誘導96 h 后取上清進行SDS-PAGE 電泳，與對照組比較，重組菌誘導表達上清液在分子質(zhì)量約60 ku 處有明顯特異性條帶出現(xiàn)（圖2箭頭所示），與預期的TGase 分子質(zhì)量大小相符，表明TGase 蛋白在酵母中得到了表達。通過對培養(yǎng)基中總蛋白濃度的測定以及對SDS-PAGE 電泳薄層掃描，可知表達蛋白的量占培養(yǎng)基上清液中可溶性蛋白的2%，培養(yǎng)基中的目的蛋白的濃度為85 mg/L，酶活為6.5 U/mL。

圖2 酵母轉(zhuǎn)化子表達上清SDS-PAGE 及Western blotting 檢測Fig.2 SDS-PAGE of TGase expression supernatant and Western blotting

2.3 重組蛋白表達條件的優(yōu)化

2.3.1 最佳誘導表達時間的確定 從圖3可見，TGase 酵母工程菌經(jīng)甲醇誘導表達后，表達上清的酶活逐漸上升至96 h 達到最高，在培養(yǎng)96 h后，目的蛋白的含量略有上升，而幅度很小。確定96 h 為最佳誘導表達時間。

圖3 表達時間對產(chǎn)酶的影響Fig.3 The effect of enzyme amount at different time

2.3.2 菌體起始誘導密度對目的蛋白表達的影響 由圖4可見，從表達開始至發(fā)酵結束時，細胞光密度OD600nm值隨著接種量的增加而呈上升趨勢。當OD600nm值在2～4 范圍內(nèi)，隨著誘導起始菌體濃度的增加，目的蛋白表達量逐漸增加，而OD600nm值超過4 后，蛋白表達量開始下降。

圖4 誘導初始菌體濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.4 The effect of enzyme with different primary yeast concentration

2.3.3 不同起始pH 值對目的蛋白表達水平的影響 選擇一個合適的pH 值，使目的蛋白的表達量最高。由圖5可見，pH 值為6.0 時，酶活最高，表明蛋白表達量最高。

圖5 初始pH 值對產(chǎn)酶的影響Fig.5 The effect of enzyme with different primary pH value

2.3.4 不同氮源對目的蛋白表達水平的影響 由圖6可見，選擇的3 種氮源，其中BMM+AA 對基因工程菌表達TGase 表達量最大。而三者差異很小，為節(jié)約成本，選用BMMY 培養(yǎng)基。

圖6 不同氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.6 The effect of enzyme with different nitrogen sources

2.3.5 甲醇添加量對目的蛋白表達的影響 如果甲醇濃度過低，不足以完全啟動AOX1 的轉(zhuǎn)錄，當甲醇濃度過高，會抑制AOX1 的轉(zhuǎn)錄水平，甲醇主要作為表達階段菌體生長的唯一碳源，濃度過高會造成毒性，抑制細胞生長和外源蛋白的表達，由圖7可見，甲醇添加量為0.6%（體積分數(shù)）時酶活最高。

圖7 不同甲醇添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.7 The effect of enzyme with different methanol content

2.3.6 誘導溫度對目的蛋白表達量的影響 由圖8可見，低溫可以降低目標蛋白的降解，提高表達量，而低溫條件需要消耗更多的能量，進而提高成本，因此確定誘導的最佳溫度為24 ℃。

圖8 不同誘導溫度對產(chǎn)酶蛋白的影響Fig.8 The effect of enzyme with different induced temperature

2.3.7 甲醇流加方式對目的蛋白表達量的影響 由圖9可見，每12 h 添加培養(yǎng)基體積分數(shù)0.6%的甲醇，TGase 的表達量最大。

圖9 不同甲醇添加時間間隔對表達目的蛋白的影響Fig.9 The effect of expression protein with different time adding methanol

2.3.8 在誘導后階段甘油添加量對表達的影響由圖10可見，在誘導48 h 后，每隔24 h 添加甘油，甘油質(zhì)量濃度過高對表達有抑制作用，可知甘油添加量為1 g/L 最佳。

圖10 誘導后階段甘油添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of glycerin addition on enzyme production in post-induction stage

2.3.9 工程菌表達條件的正交優(yōu)化 從表2結果的極差分析可知，對畢赤酵母基因工程菌表達條件的影響因素由強至弱依次為：誘導時間＞初始pH 值＞甲醇添加量＞菌體起始密度。從方差分析結果可知，誘導時間、甲醇添加量均達到顯著差異水平（α=0.1），而菌體起始密度、初始pH 值則為差異不顯著。最終確定畢赤酵母基因工程菌搖瓶最佳條件為A3B4C4D3，即誘導時間96 h，初始pH 6.0，甲醇添加量為0.6%（體積分數(shù)），菌體起始密度OD600nm=4.0。在此最優(yōu)條件下測得酶活為7.51 U/mL。

表2 畢赤酵母基因工程菌表達條件正交優(yōu)化試驗結果Table 2 Experimental results of orthogonal optimization of expression condition of Pichia pastoriss gene engineering strain

3 結論

畢赤酵母表達系統(tǒng)在表達異源蛋白上有諸多優(yōu)點。本試驗對最佳誘導表達時間、菌體起始誘導密度、不同起始pH 值、不同氮源、甲醇添加量、誘導溫度、甲醇流加方式、在誘導后階段甘油添加量表達條件進行優(yōu)化。確定了工程菌最佳表達條件為：表達培養(yǎng)基為BMMY，誘導表達時間96 h，初始表達pH 值6.0，菌體起始誘導OD600nm值達4.0，誘導溫度24 ℃，甲醇添加量為0.6%（體積分數(shù)），甲醇流加12 h/次、誘導48 h 后每24 h 添加1 g/L的甘油。采用優(yōu)化條件后培養(yǎng)基上清的最高酶活可達7.51 U/mL。

由此可見，本研究獲得了玉米谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的最佳表達條件，為下游蛋白提純及酶生物功能特性研究奠定基礎。本研究為新型食品的應用開發(fā)奠定了理論和實踐基礎，也為下一步利用計算機模擬技術找出酶的活性中心，利用蛋白質(zhì)工程技術對酶進行修飾，以提高酶的催化效率，提高酶的穩(wěn)定性，以及酶分子改造奠定基礎，從而建立模型，為酶制品的生產(chǎn)和應用提供思路。