劉麗敏，唐宇宏，劉鋮珺，方 婷，2，李長城，2*

（1 福建農林大學食品科學學院 福州 350002 2 閩臺特色海洋食品加工及營養(yǎng)健康教育部工程研究中心 福州 350002）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種能夠引起人畜共患疾病的食源性致病菌，因其能在低溫環(huán)境（0～4 ℃）下生長，故對冷藏即食食品安全構成嚴重威脅，被稱為“冰箱殺手”[1-4]。嬰幼兒、老年人、孕婦及免疫缺陷人群都是單增李斯特菌的易感人群[5]。據(jù)美國疾病控制和預防中心報道，在美國每年至少確診1 600 例李斯特菌病[6]。2017年，歐洲疾病預防和控制中心報告了2 502例確診病例[7]。在中國，單增李斯特菌在食品中也屢見不鮮。2016年，遼寧省食品風險監(jiān)測隨機抽取市售水產品及其制品共87 份樣品，檢出單增李斯特菌7 株，檢出率8.1%[8]；梁文革等[9]對寶雞市13 類食品進行分離和鑒定，共檢出200 株單增李斯特菌，檢出率8.49%。生鮮三文魚因肉質鮮嫩，口感極佳而深受人們的喜愛。生鮮三文魚加工只包括清洗、去皮去骨、切割等過程，不涉及任何加熱烹飪處理，在極大限度地保證口感和營養(yǎng)的同時，也增加了感染單增李斯特菌的風險[10-12]。研究三文魚中單增李斯特菌的生長行為規(guī)律具有重要意義。

預測微生物學以計算機為基礎，描述一定環(huán)境下微生物的生長、失活行為，為食品安全風險評估提供重要支撐[13-16]。針對是否同步構建初級模型、二級模型，可分為一步法和兩步法[17-19]。周晏等[4]將單增李斯特菌分別接種到三文魚片、金槍魚片、鯛魚片中，在恒溫條件下考察生食魚片中單增李斯特菌的生長規(guī)律，通過兩步法分別構建初級模型、二級模型；Jia 等[20]基于一步法，在恒溫條件下研究溫度對三文魚中單增李斯特菌的影響，并根據(jù)背景菌群是否存在，分別構建非競爭生長模型和競爭生長模型。上述研究主要基于恒溫條件下構建預測模型，在實際生產過程中，溫度處于隨機波動狀態(tài)；然而，關于波動溫度下三文魚中單增李斯特菌的生長未見報道。

本研究旨在使用一步法構建并驗證數(shù)學模型，以預測三文魚中單增李斯特菌在波動溫度情況下的生長行為，為食品安全決策和風險評估提供依據(jù)。此外，通過模擬暴露于連續(xù)波動溫度條件下三文魚中單增李斯特菌的生長，評估該模型的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三文魚，福州山姆會員商店，真空包裝后于福建康普頓輻照技術有限公司進行輻照處理（輻射源為Co60，劑量為15 kGy），并于-80 ℃凍藏。單增李斯特菌 （Listeria monocytogenes） 依國標GB 4789.30-2016《食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》[21]分離于三文魚樣品。

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、腦-心浸出液肉湯（BHI），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；利福平（Rifampicin/Rif），北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨粉，杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LRH-250 生化培養(yǎng)箱，上海恒一科學儀器有限公司；FRIOCELL 變溫培養(yǎng)箱 （ECO），德國MMM 公司；Bag Mixer-400 均質拍打器，法國Interscience 公司；ST-16R 高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher 公司；BSC-1000 生物安全柜，新加坡ESCO 公司；Whirl-Pak-207 mL 無菌均質袋，美國Nasco 公司；GI80TW 立式高壓滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司。

1.3 細菌培養(yǎng)及接種菌液的制備

3 株單增李斯特菌均分離自三文魚樣品，保存在-80 ℃、含30%甘油的BHI 凍藏管中。使用菌株時，分別從凍藏管中挑取單環(huán)菌液接種至10 mL BHI 溶液中培養(yǎng)18～20 h，連續(xù)活化3 代獲得活性穩(wěn)定的菌株[22]。參照Fang 等[23]的方法對3 株活化菌株進行誘導，產生抗性，經(jīng)平板（TSA/Rifampicin，TSA/Rif）劃線并于4 ℃培養(yǎng)箱保存。

每次試驗前，用接種環(huán)從平板上分別挑取一環(huán)單增李斯特菌，轉移至含有0.5 mL 利福平、10 mL BHI 溶液的離心管中，在37 ℃搖床 （130 r/min） 中培養(yǎng)18～20 h，使菌株濃度達到109.0～109.5CFU/mL。然后放入高速冷凍離心機（轉速5 000 r/min），在4 ℃條件下離心15 min，加入無菌蛋白胨水（0.1%）清洗菌體2 次。將上述3 株單增李斯特菌菌液混合，經(jīng)無菌蛋白胨水（0.1%）梯度稀釋至103.5～104.5CFU/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品準備及接種

在無菌環(huán)境下將輻照處理的三文魚切分成（5±0.2）g，置于無菌均質袋中。取50 μL 上述梯度稀釋的懸浮液接種至三文魚樣品，并通過揉捏使菌液與樣品充分接觸。

1.5 動態(tài)生長試驗及微生物計數(shù)

設置3 組波動溫度程序（DT1：2～35 ℃連續(xù)波動174 h；DT2：1～34 ℃連續(xù)波動370 h；DT3：2～35℃連續(xù)波動255 h），將上述樣品分別置于預設的波動溫度程序下培養(yǎng)，并根據(jù)不同波動溫度試驗預設取樣頻率，每組至少獨立重復2 次，用于模型的構建。另設6 組波動溫度程序（DT4：2～35 ℃連續(xù)波動175 h；DT5：4～36.8 ℃連續(xù)波動165 h；DT6：4～37.3 ℃連續(xù)波動225 h；DT7：3～37 ℃連續(xù)波動250 h；DT8：4～30 ℃連續(xù)波動270 h；DT9：4～30 ℃連續(xù)波動168 h），將樣品放入上述程序中培養(yǎng)，用于模型驗證。取樣時，向均質袋中加入20 mL 無菌蛋白胨水（0.1%），正、反面均質拍打各2 min。均質液經(jīng)無菌蛋白胨水稀釋后涂布于TSA/Rif 平板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h 后計數(shù)，單位為lg（CFU/g）或ln（CFU/g）。

1.6 數(shù)學建模和數(shù)值分析

1.6.1 初級模型和二級模型 本研究選取Huang模型[24]、Baranyi 模型[25]和Two-compartment 模型[26]作為初級模型來擬合三文魚樣品中單增李斯特菌的生長行為。

Huang 模型微分方程表達形式如式（1）所示：

式中，Y、Ymax——細菌在t 時刻的濃度和最大生長濃度，ln（CFU/g）；μmax——最大比生長速率，h-1；λ——遲滯期，h；A 和m 均為回歸系數(shù)。

Baranyi 模型的微分方程表達形式如式（2）所示：

式中，Y、Ymax和μmax的含義與式 （1） 中的相同；Q——細菌所處的生理狀態(tài)，初值為Q0。

Two-compartment 模型的微分方程表達形式如式（3）所示：

式中，μmax的含義與式（1）中的相同；N——細菌總量，CFU/g；NL、ND——休眠期和分裂期的細菌數(shù)量，CFU/g；Nmax——最大生長濃度，即系統(tǒng)的承載能力，CFU/g；α——決定休眠細胞離開休眠狀態(tài)速率，其值介于0～1 之間。

本研究選取Huang Square-Root（HSR）模型作為二級模型，其表達式如式（4）所示：

式中，T、Tmin——細菌所處的環(huán)境溫度和最低生長溫度，℃；μmax的含義與式（1）中的相同；a——回歸系數(shù)。

1.6.2 數(shù)值分析和非線性回歸 本研究將3 組波動溫度條件下的2 次獨立重復試驗數(shù)據(jù)合并，構成三文魚中單增李斯特菌的生長數(shù)據(jù)集{Y}，采用一步法對{Y}進行擬合分析，構建包含初級模型和二級模型的組合模型。數(shù)值分析過程中，通過四階龍格-庫塔法聯(lián)合最小二乘法求解動力學參數(shù)，其中，Huang-HSR 模型的參數(shù)為{a，Tmin，A，m，Ymax}，Baranyi-HSR 模型的參數(shù)為{a，Tmin，Ymax，Q0}，Twocompartment-HSR （TC-HSR） 模型的參數(shù){a，Tmin，Ymax，α}。上述數(shù)值分析方法均通過Matlab2018 軟件編程實現(xiàn)。

1.7 模型評價與驗證

通過計算模型的均方根誤差（RMSE）【式（5）】及AIC 值【式（6）】，評價3 種組合模型的準確度及擬合優(yōu)良性。此外，運用另設的6 組波動溫度生長試驗數(shù)據(jù)和文獻報道的恒溫試驗數(shù)據(jù)，分別對模型及其參數(shù)估計值進行波溫驗證和恒溫驗證，計算其RMSE，以進一步評估模型的準確性；并考察試驗實測值{Y}與模型預測值{Y^}的差異，通過Matlab2018 軟件編程實現(xiàn)對誤差的分布擬合。

式中，N——觀測值數(shù)量；q——參數(shù)數(shù)量；i——第i 個取樣點。

1.8 波動溫度條件下的模型應用與模擬

三文魚加工及貯藏過程中，溫度波動往往不可避免，因此，可運用上述構建的模型預測暴露于連續(xù)波動溫度條件下三文魚中單增李斯特菌的生長。本研究設置2～4 ℃，2～6 ℃，2～8 ℃，2～10 ℃共4組正弦波動溫度變化程序，分別代表正常冷藏溫度及失控溫度場景，模擬150 h 內單增李斯特菌的生長行為，以顯示模型的實用性和靈活性，其中，單增李斯特菌的初始濃度設為2.0 lg（CFU/g）。

2 結果與分析

2.1 數(shù)值分析及模型構建

本研究中，三文魚樣品的初始接種濃度為102.2～102.8CFU/g。圖1a～1c 為3 組波動溫度（DT1，DT2，DT3）條件下單增李斯特菌的生長曲線。3 組波動溫度曲線的溫度變化處于1～35 ℃，覆蓋了三文魚在運輸、銷售、貯藏等過程中可能經(jīng)歷的變化范圍。

圖1 波動溫度條件下三文魚中單增李斯特菌生長曲線一步法擬合分析Fig.1 One-step curve fitting of growth curves of Listeria monocytogenes in salmon under dynamic temperature condition

運用一步法對上述3 組波動溫度生長數(shù)據(jù)（共計118 個數(shù)據(jù)點）進行數(shù)值分析，構建初級模型與二級模型的組合模型，求解模型動力學參數(shù)，統(tǒng)計分析和估計結果如表1、表2所示。由表1可知，Huang-HSR 模型、Baranyi-HSR 模型、Twocompartment-HSR 模型的均方根誤差 （RMSE）分別為0.261，0.271，0.274 lg（CFU/g），P 值均遠小于0.05，說明這3 種組合模型均能較準確描述波動溫度條件下三文魚中單增李斯特菌的生長；且三者的AIC 值分別為-309.39，-301.57，-299.42，相對差值在3.5%以內，可以認為3 種組合模型具有同等的擬合精度。如表2所示，由3 種模型估計的動力學參數(shù)均達到顯著水平 （P＜0.05）；其中，由Huang-HSR 模型、Baranyi-HSR 模型、Two-compartment-HSR 模型的最低生長溫度分別為0.51，1.21，1.20 ℃，這與Jia 等[20]報道的三文魚中單增李斯特菌的最低生長溫度相接近；由3 種模型估計的最大生長濃度分別為21.66，21.54，21.57 ln（CFU/g）【9.41，9.35，9.36 lg（CFU/g）】，差值介于0.03～0.12 ln（CFU/g）【0.01～0.06 lg（CFU/g）】，差異不顯著。雖然上述3 種組合模型預估的單增李斯特菌的動力學參數(shù)均不存在顯著差異，但其初級模型Huang 模型、Baranyi 模型及Two-compartment 模型對于細菌遲滯期的定義存在顯著差別。Huang 模型通過式（1）中的方程以顯函數(shù)的方式定義了細菌遲滯期，描述了遲滯期（λ）與最大比生長速率（μmax）的關系，由表2可知A、m 的值分別為1.094 和0.999；Baranyi 模型引入虛擬變量Q，以隱函數(shù)的方式定義遲滯期，通過求解式（2）獲得其初值Q0（Q0=-1.637）；Two-compartment模型將細菌劃分為休眠期和分裂期2 個狀態(tài)，以常數(shù)α（α=0.222）代表休眠細胞轉化為分裂細胞的狀態(tài)。

表1 一步法分析結果Table 1 Results of one-step approach analysis

表2 3 種模型的動力學參數(shù)估計結果Table 2 Estimates of kinetic parameters of three models

溫度對三文魚中單增李斯特菌生長速率的影響如圖2所示，隨著溫度的升高，生長速率增大，且由Huang-HSR 模型、Baranyi-HSR 模型、Twocompartment-HSR 模型估計的單增李斯特菌的生長速率相接近。同時，圖2將本研究的結果與文獻報道的結果進行對比。周晏等[4]研究了4，8，15，25，35 ℃條件下三文魚生魚片中單增李斯特菌的生長規(guī)律，通過傳統(tǒng)的兩步法分別構建了初級模型和二級模型，其報道的單增李斯特菌的生長速率顯著低于本研究中單增李斯特菌的生長速率，這可能是由樣品本身及的菌株差異所致。Jia 等[20]研究了恒溫條件下三文魚中的背景菌群對單增李斯特菌生長的影響，針對無菌三文魚，構建了單增李斯特菌的非競爭生長模型；同時，針對存在背景菌群的生三文魚，構建了單增李斯特菌-背景菌群競爭生長模型；本研究所使用的三文魚樣品經(jīng)過無菌化處理，由3 種組合模型計算的單增李斯特菌的比生長速率與Jia 等[20]報道的在非競爭狀態(tài)的下比生長速率一致，且大于其競爭狀態(tài)下的比生長速率。綜上所述，基于3 種組合模型對遲滯期的定義以及模型表達式的簡潔程度，本研究建議選擇Huang-HSR 模型作為組合模型來描述三文魚中單增李斯特菌的生長。

圖2 溫度對三文魚中單增李斯特菌生長速率的影響Fig.2 Effect of temperature on growth rate （μmax）of Listeria monocytogenes in salmon

2.2 模型驗證

2.2.1 波動溫度模型驗證 6 組波動溫度（DT4，DT5，DT6，DT7，DT8，DT9）生長試驗數(shù)據(jù)用于檢驗模型的準確性。因前述分析建議選擇Huang-HSR模型為組合生長模型，故將6 組波動溫度程度代入Huang-HSR 模型，經(jīng)過正向計算，可獲得各溫度曲線下的單增李斯特菌生長預測曲線。圖3a～3f將模型所得預測值與實測值進行比較，6 組驗證試驗的RMSE 分別為0.29，0.58，0.59，0.32，0.41，0.43 lg（CFU/g），結果表明該模型可以較為準確地預測動態(tài)條件下三文魚中單增李斯特菌的生長。圖4表明波動溫度驗證數(shù)據(jù)的殘差服從正態(tài)分布，其均值為-0.01 lg（CFU/g），標準差為0.40 lg（CFU/g）；其中，大約有79.4%的殘差在-0.5～0.5 lg（CFU/g）之間，屬于正常的試驗誤差范圍，進一步表明模型具有較好的準確性。

圖3 波動溫度條件下模型驗證Fig.3 Model validation under dynamic temperature profiles

圖4 波動溫度模型驗證殘差分布Fig.4 The distribution of residual errors of dynamic validation

2.2.2 恒定溫度模型驗證 為了考察該模型在恒定溫度狀態(tài)下的準確性，本研究選取文獻[20]報道的恒溫（4，8，12，16，20，25，30，35 ℃）生長試驗數(shù)據(jù)對模型進行驗證。圖5a～b 顯示了在8 組恒定溫度下三文魚中單增李斯特菌的生長試驗數(shù)據(jù)，以及Huang-HSR 模型預測的生長曲線。各溫度下模型預測的RMSE 分別為0.44，0.64，0.65，0.60，0.28，0.59，0.84，0.85 lg（CFU/g）?？傮w上，由模型計算的預測曲線與文獻實測數(shù)據(jù)較為符合，誤差服從位置參數(shù)為-0.04 lg（CFU/g）和0.43 lg（CFU/g）的拉普拉斯分布，大約有68.8%的殘差處于±0.5 lg（CFU/g）之間，仍處于正常的試驗誤差范圍內。因此，本研究構建的預測模型同樣適用于恒定溫度條件下三文魚中單增李斯特菌的生長預測。

圖5 恒定溫度條件下模型驗證Fig.5 Model validation under isothermal temperature profiles

2.3 波動溫度下的模型應用與生長模擬

因單增李斯特菌在低溫冷藏（0～4 ℃）條件下仍具有增殖能力，消費者從超市等零售終端購得生鮮三文魚后，通常貯藏于冰箱冷藏層（0～4 ℃）。如果三文魚在購買前本身被污染，或在家庭貯藏過程中被冰箱里可能存在的單增李斯特菌污染，經(jīng)過一定時間的存放，消費者在食用時，將面臨被感染的風險。通過構建模擬波動溫度曲線下三文魚中單增李斯特菌的生長模型，可為有效評估三文魚食用風險提供指導。圖7a～7d 模擬了時長為150 h，周期為8 h，不同振蕩范圍（2～4 ℃，2～6 ℃，2～8 ℃，2～10 ℃）的正弦波動溫度條件下，三文魚中單增李斯特菌的生長濃度變化情況。由圖7可知，在2～4 ℃波動條件下單增李斯特菌的增長不明顯；而在2～6 ℃，2～8 ℃，2～10 ℃波動條件下，其增長速度較快，72 h 內單增李斯特菌的濃度分別上升了約0.35，0.71，1.09 lg （CFU/g），150 h 內濃度分別上升了約1.14，1.93，2.78 lg（CFU/g），表明溫度是影響單增李斯特菌生長的重要因素。同時，相同溫度波動條件下，貯存時間越長，單增李斯特菌的濃度越高，這提示消費者在購買三文魚后，應盡快食用，盡量避免溫度在非正常范圍內波動以及長時間貯藏。

圖6 恒定溫度模型驗證殘差分布Fig.6 The distribution of residual errors of isothermal validation

圖7 不同正弦波動溫度條件下三文魚中單增李斯特菌生長數(shù)值模擬Fig.7 Numerical simulation of the growth of Listeria monocytogenes in salmon under different sinusoidal temperature profiles

3 結論

本研究考察了連續(xù)波動溫度（1～35 ℃） 條件下，單增李斯特菌在生鮮三文魚中的生長，通過一步法構建Huang-HSR、Baranyi-HSR 和Two-compartment-HSR 3 種組合模型，求得最低生長溫度分別為0.51，1.21，1.20 ℃，最大生長濃度分別為9.41，9.35，9.36 lg（CFU/g）；3 種組合模型均適合用于描述三文魚中單增李斯特菌的生長，然而基于對遲滯期的定義以及模型表達式的簡潔程度，建議選擇Huang-HSR 模型；波動溫度和恒定溫度條件下，驗證試驗數(shù)據(jù)的RMSE 分別為0.29～0.59 lg（CFU/g）和0.28～0.85 lg（CFU/g），表明構建的數(shù)學模型在波動溫度或恒定溫度條件下均適用；結合設置的4 組正弦波動溫度，開展三文魚中單增李斯特菌的生長數(shù)值模擬，證明了模型的實用性。