楊海琦，陳季旺，3，4*，徐 言，田宏偉，廖 鄂，3，4，王海濱，3，4

（1 武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 武漢 430023 2 湖北周黑鴨食品工業(yè)園有限公司 武漢 430000 3 湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢 430023 4 國(guó)家小龍蝦加工技術(shù)研發(fā)分中心（潛江） 湖北 潛江 433100）

據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局聯(lián)合全國(guó)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站、中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)發(fā)布的《2020 中國(guó)小龍蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告》[1]測(cè)算，2019年，我國(guó)養(yǎng)殖小龍蝦達(dá)208.96 萬(wàn)t，養(yǎng)殖總面積達(dá)128.5 萬(wàn)hm2，養(yǎng)殖小龍蝦的省份有23 個(gè)，然而產(chǎn)量分布不均。我國(guó)小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)高度集中在長(zhǎng)江中、下游地區(qū)，說(shuō)明小龍蝦養(yǎng)殖存在地域性。同時(shí)，小龍蝦養(yǎng)殖也有季節(jié)性。一年中，夏季是小龍蝦大量上市時(shí)期，滋味鮮甜，產(chǎn)量較高；從秋季至第2年春季，小龍蝦的產(chǎn)量明顯下降，且個(gè)頭較小，肉質(zhì)較差。解決地域性和季節(jié)性問(wèn)題，是小龍蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要課題。在長(zhǎng)期的凍藏過(guò)程中，小龍蝦肉蛋白會(huì)發(fā)生變性和氧化、聚集及降解，使蛋白質(zhì)的功能特性降低。例如，表面疏水性的上升和溶解性的下降，導(dǎo)致品質(zhì)劣變[2-4]。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于蛋白質(zhì)冷凍變性機(jī)制的假設(shè)，可以歸納為“水和水合水的相互作用學(xué)說(shuō)”“細(xì)胞液的濃縮學(xué)說(shuō)”以及“結(jié)合水的分離學(xué)說(shuō)”，然而尚未有定論[5]。Cheng 等[6]比較了分別經(jīng)壓力輔助冷凍、變壓冷凍和浸漬冷凍的天然肌動(dòng)球蛋白的構(gòu)象和功能變化，探究高壓冷凍影響對(duì)蝦中提取的天然肌動(dòng)球蛋白變性的機(jī)理。結(jié)果顯示，變壓冷凍能顯著降低天然肌動(dòng)球蛋白的變性程度，在變壓冷凍過(guò)程中，冰晶的形成對(duì)天然肌動(dòng)球蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)影響顯著。Liu 等[7]為了探究浸漬冷凍溫度對(duì)斑魚(yú)肉中冰晶形成和蛋白質(zhì)特性的影響，將魚(yú)肉分別在-20，-30，-40 ℃共3 個(gè)溫度下浸漬凍結(jié)和-20 ℃下空氣凍結(jié)，測(cè)定魚(yú)肉中的冰晶大小及蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，較低浸漬冷凍溫度可以更好地保持蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并提供更高的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性。Shi 等[8]為了探究?jī)鼋Y(jié)溫度 （-18，-30，-80 ℃） 和時(shí)間（1，4，12，24周）對(duì)小龍蝦品質(zhì)的影響，測(cè)定了凍藏小龍蝦的三磷酸腺苷酶（ATPase）活性、肌原纖維蛋白含量、鹽溶性蛋白質(zhì)含量、總巰基含量、質(zhì)構(gòu)、持水性和水分含量，結(jié)果顯示，ATPase 活性和肌原纖維蛋白含量顯著降低，持水率顯著上升，凍結(jié)溫度顯著影響小龍蝦的品質(zhì)。目前已知凍結(jié)速度、凍藏溫度和添加劑等冷凍加工方式顯著影響冷凍過(guò)程中蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，且不同種類(lèi)水產(chǎn)品的品質(zhì)受冷凍加工條件影響的差異明顯[9-10]。

目前，工業(yè)化生產(chǎn)中常采用液氮凍結(jié)或者鼓風(fēng)凍結(jié)小龍蝦原料及其制品，而凍結(jié)溫度通常依靠經(jīng)驗(yàn)確定，有關(guān)凍結(jié)溫度、凍藏溫度對(duì)凍藏小龍蝦品質(zhì)及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，凍結(jié)及凍藏溫度顯著影響小龍蝦凍藏過(guò)程中的品質(zhì)。較低的凍結(jié)溫度對(duì)肌纖維的破壞程度較輕；較低凍藏溫度的小龍蝦肉中結(jié)合水和不易流動(dòng)水的比例較高，小龍蝦肉的汁液流失率、剪切力、pH 值、TVB-N 值較低，持水率較高。本研究探究經(jīng)不同凍結(jié)溫度處理和凍藏溫度貯藏的小龍蝦肉的肌原纖維蛋白含量、表面疏水性、內(nèi)源熒光強(qiáng)度、巰基和二硫鍵含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)合冰晶的顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果，探討凍結(jié)、凍藏溫度對(duì)小龍蝦肉蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的影響，為小龍蝦加工原料的周年供應(yīng)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活小龍蝦（20～30 g/只），湖北周黑鴨食品工業(yè)園有限公司；氯化鉀（分析純）、氯化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、2，4-二硝基苯肼（DNPH）、尿素（分析純）等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS，0.2 mol/L）、四甲基乙二胺 （TEMED）、1-苯胺基-8 奈基磺酸鹽（ANS）等，德國(guó)Biofroxx 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DW-60W388 超低溫冰柜，青島海爾生物醫(yī)療有限公司；SSN-61 熱電偶溫度采集儀，深圳宇問(wèn)溫度系統(tǒng)傳感有限公司；冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；XHF-DY 高速分散器，寧波新芝生物科技有限公司；7200 型可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；GL-20-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；NEXUS670 傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)尼高力儀器公司；F-4600 熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 凍藏小龍蝦的制備 將挑選好的鮮活小龍蝦用自來(lái)水刷洗，超聲波清洗20 min（水的添加量以覆蓋蝦體為準(zhǔn)），放入沸水中熱燙1 min，裝盒（每盒1 kg 小龍蝦），盒中灌入清水（水的添加量以覆蓋蝦體為準(zhǔn)），將盒抽真空。盒裝小龍蝦分別置于-20，-40，-55 ℃的冰柜中凍結(jié)至中心溫度達(dá)到-15 ℃。將裝盒蝦隨機(jī)分為2 組，分別置于-20℃和-40 ℃冰柜中凍藏，凍藏周期為24 周，每隔6周取樣用于檢測(cè)。每次隨機(jī)取約1 kg 小龍蝦，使用流動(dòng)水解凍。取蝦肉時(shí)去除頭、殼和腸線，冷凍干燥后粉碎備用。

1.3.2 肌原纖維蛋白含量的測(cè)定 參考Pazos 等[11]的方法。準(zhǔn)確稱(chēng)取3 g 小龍蝦肉粉于50 mL 離心管中，加入30 mL（10 倍體積）Tris-HCl 緩沖液（10 mmol/L，pH 7.5），用高速分散器勻漿，溶液經(jīng)冷凍離心（4 ℃，10 000 r/min）20 min 后，取沉淀，加 入30 mL Tris-HCl 緩沖液（10 mmol/L，pH 7.0），勻漿后離心（4 ℃，10 000 r/min）20 min 后取上清液，即為肌原纖維蛋白溶液。

用0.6 mol/L KCl 溶液將肌原纖維蛋白溶液稀釋10 倍，取1 mL 上清液，用雙縮脲法測(cè)定其濃度。

1.3.3 肌原纖維蛋白表面疏水性的測(cè)定 參照Haskard 等[12]的方法，使用熒光探針ANS 確定表面疏水性。取已知濃度的肌原纖維蛋白溶液，采用Tris-HCl 緩沖溶液 （0.6 mol KCl-20 mmol Tris-HCl，pH 7.0） 稀釋至質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.3，0.5 mg/mL 的溶液。分別取上述稀釋液2 mL 置于5 mL PCR 離心管，加入10 μL ANS 溶液（8 mmol/L，溶解在0.1 mol/L pH 7.0 PBS 溶液中），渦旋混勻。采用熒光光譜儀測(cè)定，操作條件為：激發(fā)波長(zhǎng)385 nm，掃描范圍400～700 nm，掃描速度1 200 nm/min，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為2.5 nm，響應(yīng)時(shí)間0.1 s，記錄470 nm 波長(zhǎng)處的熒光發(fā)射強(qiáng)度，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，熒光發(fā)射強(qiáng)度為縱坐標(biāo)做圖，曲線初始段的斜率（通過(guò)線性回歸分析計(jì)算）即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)（H0）。

1.3.4 肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的測(cè)定 參考Cao 等[13]的方法。用0.6 mol/L KCl 溶液將肌原纖維蛋白溶液稀釋至濃度為0.05 mol/L，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，設(shè)定參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，狹縫寬度2.5 nm，波長(zhǎng)掃描范圍280～400 nm，掃描速度12 000 nm/min。

1.3.5 肌原纖維蛋白總巰基和二硫鍵含量的測(cè)定 參照Beveridge 等[14]、Oliver 等[15]的方法，稍作修改。

1）總巰基含量 總巰基A 液：分別稱(chēng)取尿素480.48 g、EDTA 2.9224 g、SDS 20 g、Tris 24.23 g溶于400 mL 水中，用6 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至7.0，定容至1 L。

總巰基B 液：分別稱(chēng)取DTNB 1.0 g、Tris 24.23 g 溶于800 mL 水中，用6 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至8.0，定容至1 L。

測(cè)量：取1 mL 肌原纖維蛋白提取液，采用Tris-HCl 緩沖溶液 （0.6 mol KCl-20 mmol Tris-HCl，pH 7.0）稀釋至質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，加入9 mL 的總巰基A 液，渦旋混勻后在室溫下放置30 min，取4 mL 混合液，加入0.4 mL 總巰基B 液；在40 ℃水浴反應(yīng)25 min 后，測(cè)定波長(zhǎng)412 nm 處的吸光值，以0.2 mol/L PBS 為空白對(duì)照。

2）二硫鍵含量 二硫鍵A 液：分別稱(chēng)取480.48 g 尿素、2.9224 g EDTA、20 g SDS、15.826 g K2SO3溶于400 mL 水中，用6 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.0，定容至1 L。

二硫鍵B 液：分別稱(chēng)取1 g DTNB、15.826 g K2SO3溶于800 mL 水中，用6 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH值至9.5，定容至1 L。

測(cè)量：取1 mL 肌原纖維蛋白提取液，采用Tris-HCl 緩沖溶液 （0.6 mol KCl-20 mmol Tris-HCl，pH 7.0）稀釋至質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，加入9 mL 的二硫鍵A 液，渦旋混勻后，在室溫下放置30 min。取4 mL 混合液，加入0.4 mL 二硫鍵B 液，在40 ℃反應(yīng)25 min 后，測(cè)定波長(zhǎng)412 nm 處的吸光值，以0.2 mol/L PBS 為空白對(duì)照。

1.3.6 肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 參照Sun等[16]的方法，稍作修改。小龍蝦肉粉過(guò)100 目篩后，取1 g 裝于10 mL PCR 離心管中備用。將蝦肉粉與無(wú)水溴化鉀按質(zhì)量比1∶100 混合壓片，做全波段掃描測(cè)定，空白對(duì)照為溴化鉀。分辨率為4 cm-1，掃描累加32 次，光譜觀察范圍為400～4 000 cm-1。利用Peakfit 軟件進(jìn)行分析，首先進(jìn)行基線校正，然后用Deconvolve Gaussian 曲線去卷積，進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)擬合，直至擬合相關(guān)系數(shù)穩(wěn)定不小于0.99 為止。確定各子峰與各二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，計(jì)算各子峰面積的相對(duì)百分含量。

1.3.7 冰晶的顯微結(jié)構(gòu)觀察 參照Yang 等[17]的方法，分別用冷卻至-20 ℃和-40 ℃的刀片，將-20℃和-40 ℃的凍藏小龍蝦肉切成1 mm×1 mm×1 mm 左右的正方體（沿肌肉纖維紋理切割以便觀察）。將-20 ℃和-40 ℃凍藏小龍蝦肉置于由30 mL 60%無(wú)水乙醇、30%三氯甲烷和10%冰醋酸組成的混合溶液中 （混合溶液已分別降溫至-20 ℃和-40 ℃），分別在-20，-40 ℃的冰柜中貯藏18 h后，從冰柜中取出，自然升溫至25 ℃，用無(wú)水乙醇脫水2 h，然后在正丁醇溶液中脫水2 次，每次2 h，最后浸泡在正丁醇溶液中8 h。洗脫的蝦肉塊再用甲苯?jīng)_洗3 次，每次30 min，然后浸入57 ℃液體石蠟中3 次，每次1 h，最后用模具將每個(gè)蝦肉塊包埋在石蠟中，并用切片機(jī)沿肌肉纖維紋理切割成10 μm 厚的切片。將切片和水一起放置在玻片上，置于56 ℃溫板上熔化石蠟。將切片浸入甲苯中2 次去除石蠟，每次10 min，然后浸入無(wú)水乙醇中2 次，每次10 min，將蝦肉片密封在玻片上。用光學(xué)顯微鏡放大100 倍觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）”表示。應(yīng)用SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用ANOVA 進(jìn)行方差分析、Duncan 多重極差檢驗(yàn)比較平均值在顯著性水平上的差異，P＞0.05 判定為差異不顯著，P＜0.05 判定為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小龍蝦凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白含量的變化

由表1可以看出，凍藏溫度相同時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，6 組小龍蝦肉的肌原纖維蛋白含量均呈現(xiàn)先顯著減小（P＜0.05）后穩(wěn)定的趨勢(shì)，這與Li等[18]的研究結(jié)果類(lèi)似。在凍藏過(guò)程中，冰晶不斷增大，肌肉組織中細(xì)胞液不斷被濃縮，使離子濃度上升、pH 值發(fā)生顯著變化（P＜0.05），導(dǎo)致肌原纖維蛋白變性；在凍藏過(guò)程中，脂質(zhì)自動(dòng)氧化等化學(xué)反應(yīng)中可能會(huì)產(chǎn)生氧自由基，氧自由基易攻擊肌肉細(xì)胞和膜蛋白，使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)而變性，部分變性后的蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，更容易被酶水解[19-20]。同時(shí)，蛋白質(zhì)可能受到微生物的作用被分解[21]。

表1 小龍蝦凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白含量的變化（mg/mL）Table 1 Change in myofibrillar protein content of red swamp crayfish during freezing storage （mg/mL）

凍藏溫度相同時(shí)，在整個(gè)凍藏周期內(nèi)，-20 ℃凍結(jié)的小龍蝦肉肌原纖維蛋白的含量顯著低于-40 ℃和-55 ℃凍結(jié)的小龍蝦（P＜0.05），而-40℃和-55 ℃無(wú)顯著差異（P＞0.05）。這是由于-20 ℃凍結(jié)的速度較慢（見(jiàn)圖1），使更多水分被凍結(jié)，更多與蛋白質(zhì)結(jié)合的水分被迫遷移，導(dǎo)致蛋白質(zhì)脫水程度更深（水分狀態(tài)的結(jié)果驗(yàn)證了這一點(diǎn)，見(jiàn)圖2），同時(shí)，更多水分被凍結(jié)使得蛋白質(zhì)周?chē)h(huán)境的溶質(zhì)被濃縮，使得pH 值和離子濃度變化更大，加快了蛋白質(zhì)的變性[22]。

圖1 小龍蝦凍結(jié)過(guò)程中心溫度的變化Fig.1 Change in central temperature of red swamp crawfish during frozen

圖2 小龍蝦凍藏過(guò)程中水分狀態(tài)的變化Fig.3 Change in moisture state of red swamp crawfish during freezing storage

凍結(jié)溫度相同時(shí)，在整個(gè)凍藏周期內(nèi)，-20 ℃凍藏的小龍蝦肉的肌原纖維蛋白含量顯著低于-40 ℃凍藏的小龍蝦（P＜0.05）。這是由兩方面原因造成：一是-20 ℃凍藏的小龍蝦的脂質(zhì)自動(dòng)氧化程度較重，產(chǎn)生更多的氧自由基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氧化變性更明顯（脂質(zhì)氧化的試驗(yàn)可驗(yàn)證，結(jié)果未顯示）；二是-20 ℃凍藏條件下抑制微生物生長(zhǎng)繁殖能力較弱，導(dǎo)致微生物分解了更多的蛋白質(zhì)[21]。

2.2 小龍蝦凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白表面疏水性的變化

由表2可以看出，隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，6 組小龍蝦肉的肌原纖維蛋白的表面疏水性均呈先顯著增大（P＜0.05）后穩(wěn)定的趨勢(shì)。因?yàn)?，新鮮的小蝦肉疏水基團(tuán)多埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，表面疏水性較低；凍藏開(kāi)始后，肌原纖維蛋白分子逐漸展開(kāi)，空間構(gòu)象發(fā)生改變（內(nèi)源熒光強(qiáng)度的結(jié)果驗(yàn)證了這一點(diǎn)），使得疏水基團(tuán)暴露，表面疏水性上升；外露的疏水基團(tuán)越來(lái)越多，疏水相互作用力增大，部分蛋白質(zhì)可能發(fā)生聚集，導(dǎo)致疏水性輕微下降（P＞0.05），最后趨于平穩(wěn)[23]。

表2 小龍蝦凍藏過(guò)程中表面疏水性指數(shù)（H0）的變化Table 2 Change in surface hydrophobicity index of red swamp crayfish during freezing storage （H0）

凍藏溫度相同時(shí)，凍結(jié)溫度對(duì)小龍蝦肉肌原纖維蛋白的表面疏水性影響不顯著（P＞0.05）。凍結(jié)溫度相同時(shí)，凍藏溫度顯著影響了小龍蝦肌原纖維蛋白的表面疏水性（P＜0.05）：-20 ℃凍藏的小龍蝦表面疏水性在第12 周升至最高，然后趨于穩(wěn)定；而-40 ℃凍藏的小龍蝦肌原纖維蛋白的表面疏水性在第18 周才達(dá)到最高值，然后趨于穩(wěn)定。因?yàn)?，較低的凍藏溫度抑制了蝦肉中水分的重結(jié)晶，減少了結(jié)合水向自由水遷移的比例（水分狀態(tài)的結(jié)果證明了這一點(diǎn)，見(jiàn)圖2），從而降低了蛋白質(zhì)周?chē)鷓H 值和離子強(qiáng)度的變化程度，使蛋白質(zhì)空間構(gòu)象更穩(wěn)定。

2.3 小龍蝦凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的變化

由圖3可以看出，凍藏溫度相同時(shí)，6 組小龍蝦肉在凍藏第6～12 周時(shí)，熒光強(qiáng)度逐漸增大，在凍藏第12～24 周時(shí)，熒光強(qiáng)度逐漸減小。這表明在凍藏期間，色氨酸的微環(huán)境在不斷變化。因?yàn)樵趦霾卦缙?，冰晶增大，損傷肌纖維結(jié)構(gòu)，使得肌原纖維蛋白的天然排列方式被破壞，肌原纖維蛋白展開(kāi)使得埋在內(nèi)部的色氨酸殘基暴露，熒光強(qiáng)度增大；凍藏中后期，隨著冰晶的增大，在加重了對(duì)肌纖維機(jī)械損傷的同時(shí)，也使得離子濃度和pH 值上升，越來(lái)越多的疏水基團(tuán)和巰基氧化形成的二硫鍵暴露，使得分子間作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)發(fā)生再聚集，導(dǎo)致色氨酸殘基重新被包裹在內(nèi)部，使得熒光強(qiáng)度下降[21]。這也驗(yàn)證了表面疏水性的結(jié)果。

圖3 小龍蝦凍藏過(guò)程中內(nèi)源熒光強(qiáng)度的變化Fig.3 Change in intrinsic fluorescence intensity of red swamp crayfish during freezing storage

凍藏溫度相同時(shí)，3 種溫度凍結(jié)的小龍蝦肉的內(nèi)源熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差別（P＞0.05）；凍結(jié)溫度相同時(shí)，-20 ℃凍藏溫度下小龍蝦的熒光強(qiáng)度在整個(gè)凍藏過(guò)程中的變化大于-40 ℃，這與Ren 等[24]的研究結(jié)果類(lèi)似。內(nèi)源熒光強(qiáng)度的變化與表面疏水性一致，可能的原因類(lèi)似。

2.4 小龍蝦凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白總巰基和二硫鍵含量的變化

由圖4、圖5可以看出，隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，6 組小龍蝦肉肌原纖維蛋白的總巰基含量均呈先顯著下降（P＜0.05）后逐漸穩(wěn)定的趨勢(shì)，而二硫鍵含量呈先顯著增大（P＜0.05）后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，二硫鍵含量的變化趨勢(shì)與總巰基含量基本相反，跟李志鵬等[25]的研究結(jié)果類(lèi)似。這可能是冰晶產(chǎn)生的機(jī)械損傷作用，使肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)被破壞，內(nèi)部巰基暴露出來(lái)，進(jìn)一步被氧化形成二硫鍵。

圖4 小龍蝦凍藏過(guò)程中總巰基含量的變化Fig.4 Change in total sulfhydryl content of red swamp crayfish during freezing storage

圖5 小龍蝦凍藏過(guò)程中二硫鍵含量的變化Fig.5 Change in disulfide bond content of red swamp crayfish during freezing storage

凍藏溫度相同時(shí)，在第0～12 周，-20 ℃凍結(jié)的小龍蝦的巰基含量顯著低于-40，-55 ℃凍結(jié)，而二硫鍵含量顯著高于-40，-55 ℃凍結(jié)（P＜0.05）；在第12～24 周，小龍蝦的巰基和二硫鍵含量變化不顯著（P＞0.05）。因?yàn)?，在凍藏中前期?20 ℃凍結(jié)的小龍蝦形成了更大的冰晶，對(duì)肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)破壞更嚴(yán)重，導(dǎo)致更多的巰基暴露，與氧接觸而被氧化；而在凍藏后期，越來(lái)越多巰基氧化形成二硫鍵，增強(qiáng)了分子間作用，使得蛋白質(zhì)發(fā)生再聚集，減輕了巰基被進(jìn)一步氧化的程度，導(dǎo)致巰基和二硫鍵含量變化不顯著。

凍結(jié)溫度相同時(shí)，凍藏溫度顯著影響了小龍蝦的巰基和二硫鍵含量（P＜0.05）：-20 ℃凍藏巰基含量顯著低于-40 ℃凍藏，二硫鍵含量顯著高于-40 ℃凍藏（P＜0.05）。這是由于-40 ℃抑制了水的重結(jié)晶，降低了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)被破壞程度，減少了巰基的暴露。同時(shí)，-40 ℃凍藏的小龍蝦肉脂質(zhì)的自動(dòng)氧化速度較低，產(chǎn)生的氧自由基較少，減輕了肌原纖維蛋白被氧自由基氧化的程度[26-27]。

2.5 小龍蝦凍藏過(guò)程中的肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

由表3可以看出，隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，6 組肌原纖維蛋白的α-螺旋的相對(duì)含量逐漸下降（P＜0.05），β-轉(zhuǎn)角的相對(duì)含量逐漸上升（P＜0.05）；β-折疊的相對(duì)含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，無(wú)規(guī)則卷曲的相對(duì)含量呈先下降后上升的趨勢(shì)。天然肌原纖維蛋白分子的α-螺旋多位于多肽鏈內(nèi)部，是一種緊密且無(wú)空腔的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；β-折疊是比α-螺旋更穩(wěn)定的伸展結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的緊密程度和構(gòu)象穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于α-螺旋[28-29]。肌原纖維蛋白的α-螺旋相對(duì)含量下降主要是由肌球蛋白尾部結(jié)構(gòu)變化所致[30]。天然肌球蛋白的桿狀尾部主要二級(jí)結(jié)構(gòu)是α-螺旋，當(dāng)其逐漸解旋而部分轉(zhuǎn)化成β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲時(shí)，肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的緊密程度和構(gòu)象穩(wěn)定性大幅度降低，包埋于分子內(nèi)部的疏水性殘基暴露出來(lái)，增強(qiáng)了分子間的疏水相互作用力，使肌原纖維蛋白聚合（這也驗(yàn)證了表面疏水性的變化）[31]。

表3 凍結(jié)小龍蝦凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化（%）Table 3 Change in secondary structure of myofibrillar protein from red swamp crayfish frozenduring freezing storage （%）

在凍藏溫度相同時(shí)，-20 ℃凍結(jié)的小龍蝦肉肌原纖維蛋白的α-螺旋的相對(duì)含量低于-40 ℃和-55 ℃，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的相對(duì)含量無(wú)明顯差別。這是因?yàn)?20 ℃凍結(jié)使小龍蝦肉中形成的冰晶更大，對(duì)肌原纖維蛋白造成的機(jī)械損傷更嚴(yán)重。在凍結(jié)溫度相同時(shí)，-40 ℃凍藏的小龍蝦肉肌原纖維蛋白的α-螺旋的相對(duì)含量明顯高于-20 ℃，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的相對(duì)含量無(wú)明顯差異，可能是-40 ℃抑制了重結(jié)晶和微生物的生長(zhǎng)，減輕了肌纖維被破壞的程度，使-40 ℃凍藏的小龍蝦肉的肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有更好的穩(wěn)定性[21]。

2.6 小龍蝦凍藏過(guò)程中冰晶結(jié)構(gòu)的變化

由圖6可以看出，未經(jīng)冷凍的小龍蝦肉組織排列有規(guī)則且緊密，組織邊緣光滑，組織間形成有規(guī)律且清晰的間隙。冷凍后的小龍蝦肉組織變化非常明顯，6 組小龍蝦肉組織均出現(xiàn)冰晶孔隙，對(duì)組織造成不同程度的損傷。隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，冰晶孔隙不斷擴(kuò)大。在第12 周和24 周，冰晶孔隙變化最明顯，甚至形成拉長(zhǎng)的針形冰晶孔隙。

圖6 小龍蝦凍藏過(guò)程中冰晶微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig.6 Changes in the ice crystal microstructure of red swamp crawfish during the freezing storage

在凍藏溫度相同時(shí)，-20 ℃和-40，-55 ℃凍結(jié)的小龍蝦肉的冰晶孔隙差異明顯，-40，-55 ℃之間差異相對(duì)較小。在剛結(jié)束凍結(jié)后，-40 ℃和-55 ℃凍結(jié)的蝦肉的冰晶孔隙分布均勻、細(xì)小、圓潤(rùn)且數(shù)量較多，-20 ℃凍結(jié)的數(shù)量較少而孔徑較大且不均勻。這可能是由于-20 ℃凍結(jié)的降溫速度較慢，通過(guò)冰晶生成區(qū)（-1～5 ℃）的時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致形成較大的冰晶。在整個(gè)凍藏周期中，-20 ℃凍結(jié)較其它兩種凍結(jié)溫度的冰晶孔隙增大更明顯，這與向迎春等[32]的研究結(jié)果類(lèi)似，可能是-20 ℃凍結(jié)形成的冰晶較大，對(duì)肌纖維的破壞更嚴(yán)重，使得細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)滲透進(jìn)細(xì)胞膜，引起細(xì)胞膜收縮，增大了胞外空間，導(dǎo)致凍藏過(guò)程中，冰晶更容易相互結(jié)合而增大。

在凍結(jié)溫度相同時(shí)，-40 ℃和-20 ℃凍藏的小龍蝦肉的冰晶孔隙差異明顯。-20 ℃凍藏的冰晶孔隙相對(duì)較大，凍藏至12 周時(shí)有針形冰晶的形成，導(dǎo)致組織間隔不均。這可能是在-20 ℃凍藏時(shí)，整個(gè)體系處于橡膠態(tài)，蝦肉內(nèi)的黏度較低，使得水分子移動(dòng)能力增強(qiáng)，冰晶容易在凍藏過(guò)程中結(jié)合，產(chǎn)生重結(jié)晶現(xiàn)象，而-40 ℃的凍藏溫度更接近玻璃態(tài)，水分子移動(dòng)能力較弱，故而冰晶較小。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了凍結(jié)及凍藏溫度對(duì)小龍蝦肉肌原纖維蛋白的表面疏水性、內(nèi)源熒光強(qiáng)度、二級(jí)結(jié)構(gòu)等的影響。

3 結(jié)論

-40 ℃和-55 ℃凍結(jié)的小龍蝦肉中形成的冰晶更小，使小龍蝦肉的離子濃度更低，pH 值更穩(wěn)定，減輕了小龍蝦肉蛋白的變性；-40 ℃凍藏更好的抑制了重結(jié)晶，減輕了肌纖維被破壞的程度。同時(shí)，-40 ℃凍藏降低了脂質(zhì)自動(dòng)氧化的速度，減輕了蛋白質(zhì)被自由基氧化的程度，使小龍蝦肉蛋白的空間構(gòu)象更穩(wěn)定。這表明采用較低的溫度凍結(jié)及凍藏小龍蝦，可以更好的保持凍藏小龍蝦的品質(zhì)。該試驗(yàn)可為小龍蝦的冷凍保鮮及加工原料的周年供應(yīng)提供理論指導(dǎo)。