薛蘇桐， 王先流， 易兵成， 郭煦然， 唐 寒， 沈炎冰， 張彥中

（東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

在全球范圍內(nèi)，每年有成千上萬的患者因創(chuàng)傷、疾病、衰老等原因造成骨缺損，這在很大程度上影響了患者的健康和生活質(zhì)量。骨組織工程（BTE）技術(shù)可為解決臨床上傳統(tǒng)骨缺損治療方法中存在的各種不足提供最有潛力的解決方案。BTE的基本方法是將生物材料支架作為細胞和信號因子的載體來誘導(dǎo)成骨，或植入后從周圍骨組織募集細胞并使其原位生長和分化，最終形成新骨。由于骨組織是承力組織，力學(xué)刺激對細胞的成骨誘導(dǎo)分化起著重要作用[1]，因此，在BTE生物材料支架的設(shè)計中，如果能使其具有合理施加力學(xué)刺激的功能，將為加速骨缺損修復(fù)和增強再生功效提供新的思路。

熱響應(yīng)類形狀記憶聚合物（SMPs）可通過形狀改變有效調(diào)節(jié)自身力學(xué)性能并實現(xiàn)微創(chuàng)植入，為發(fā)展力學(xué)活性BTE支架提供了新的材料選擇[2]?；赟MPs的BTE支架在回復(fù)過程中若與周圍骨組織接觸，就會對骨細胞施加力學(xué)刺激并通過力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)機制調(diào)控細胞的成骨行為[3]，但SMPs通常存在生物活性不佳、力學(xué)性能不足等問題[4]，因此需要通過不同的方式（如采用無機納米填料[5]）對其進行有效增強改性。

氧化石墨烯（GO）作為一種二維納米光熱轉(zhuǎn)換材料[6]，不僅楊氏模量高、易于表面功能化，而且可促進細胞黏附和增殖[7]。近年來，已有研究將GO用于增強聚合物的力學(xué)性能[8]、形狀記憶性能[9]和生物功能[10]。如Liu等[11]證明乳酸-己內(nèi)酯共聚物（PLCL）形狀記憶纖維在負載0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的GO后，可使拉伸楊氏模量提高28.4%，形狀回復(fù)應(yīng)力提高28.3%；將骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）接種在GO/PLCL纖維支架上培養(yǎng)14 d后，其成骨標(biāo)志物的分泌量也明顯提高。Huang等[12]將GO與四臂聚乙二醇-聚己內(nèi)酯嵌段共聚物（4A-PEG-PCL）纖維支架進行光交聯(lián)后，不僅改善了支架的力學(xué)性能和形狀記憶性能，還促進了小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（MC3T3-E1）成骨相關(guān)基因的表達。這些研究表明在SMPs中引入GO能有效增強其力學(xué)性能及成骨誘導(dǎo)性能，但GO納米片層尺寸對力學(xué)增強效果、形狀記憶性能和成骨誘導(dǎo)性能的影響尚鮮見報道。

本課題組前期已證明左旋聚乳酸（PLLA）/聚（3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯）（PHBV）（PLLA/PHBV）復(fù)合纖維膜具有良好的形狀記憶性能和生物相容性[13]。在此工作基礎(chǔ)上，本文首先對不同片層大小GO的化學(xué)結(jié)構(gòu)和片層尺寸進行表征，然后通過電紡方法將不同片層尺寸的GO負載到PLLA/PHBV超細纖維中形成GO@PLLA/PHBV復(fù)合纖維膜，并對所制備的復(fù)合纖維膜的形貌、組成、熱性能、力學(xué)性能及形狀記憶性能進行系統(tǒng)的表征，最后通過體外細胞實驗評估細胞相容性和成骨誘導(dǎo)性能。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

GO：上海理工大學(xué)提供，依據(jù)其片層尺寸的小、中、大依次命名為sGO、mGO和1GO；PLLA：Mw=1.0×105，濟南岱罡生物材料有限公司；PHBV：Mw=5.2×105，寧波天安生物材料有限公司；六氟異丙醇（HFIP）：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 GO的表征

采用拉曼光譜儀（Raman，美國Thermo Fisher Scientific公司DXR2xi型）對GO的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行表征，選擇He-Ne激光發(fā)射器，發(fā)射功率為17 mW、波長為633 nm。

采用場發(fā)射掃描電鏡（FESEM，日本日立公司S-4800型）對分散于HFIP中、經(jīng)1 h超聲處理的不同片層尺寸的GO進行形貌觀察和拍照，操作電壓為5 kV，倍數(shù)為4 000倍。通過ImageJ軟件測量FESEM圖片中的GO片層面積。

1.3 GO@PLLA/PHBV復(fù)合纖維膜的制備與結(jié)構(gòu)表征

常溫下，首先將不同片層尺寸GO加入HFIP中超聲（冰?。? h；接著在70 °C下加入PHBV，攪拌約15 min使其分散，再加入PLLA 攪拌過夜形成 GO@PLLA/PHBV 紡絲液（m（PLLA）/m（PHBV）=7∶3，m（GO）/m（PLLA/PHBV）=1%，m（GO@PLLA/PHBV）/V（HFIP）=0.08 g/mL）；然后通過電紡絲方法將紡絲液制備成復(fù)合纖維膜，紡絲參數(shù)如下：電壓為13 kV，接收距離為15 cm，注射速率為0.8 mL/h，濕度為50%～70%，室溫；最后將所制備的復(fù)合纖維膜放入真空干燥箱中干燥72 h以上備用。

采用FESEM和透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會社JEM-2100型）觀察復(fù)合纖維膜的形貌，并用ImageJ軟件測量纖維直徑；用拉曼光譜儀對復(fù)合纖維膜進行結(jié)構(gòu)表征；用熱重（TG）分析儀（德國NETZSCH公司TG209 F1型）對復(fù)合纖維膜進行GO含量分析，氮氣保護，升溫速率為10 °C/min；用X射線衍射（XRD）儀（日本理學(xué)株式會社SAXSessmc2型）對復(fù)合纖維膜進行結(jié)晶度分析，管電壓為40 kV，管電流為200 mA，掃描速率為 3（°）/min，掃描范圍為 5°～60°，Cu 靶；用差示掃描量熱（DSC）儀（德國 NETZSCH 公司 DSC-822 型）確定復(fù)合纖維膜的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg），氮氣保護，氣流速率設(shè)定為20 mL/min，升溫速率設(shè)定為10 °C/min，溫度范圍為 0 ～ 120 °C。

1.4 GO@PLLA/PHBV復(fù)合纖維膜的力學(xué)性能和形狀記憶性能

通過動態(tài)熱機械分析（DMA）儀（美國TA儀器公司Q800型）在26 °C下測試復(fù)合纖維膜的拉伸性能與形狀記憶性能。首先將纖維膜在47 °C熱平衡2 min；接著以0.2 MPa/min的拉伸速率將應(yīng)力從0提高到2.0 MPa（變形階段）；然后以 5 °C/min 的降溫速率冷卻至 0 °C，將應(yīng)力卸載至 0（固定階段）；最后以 5 °C/min 的升溫速率將溫度升至47 °C誘發(fā)形狀回復(fù)（回復(fù)階段）。重復(fù)上述過程3次并記錄數(shù)據(jù)。形狀回復(fù)率（Rr）和形狀固定率（Rf）分別按公式（1）和公式（2）確定：

其中，εDeform是變形和冷卻過程中的最大應(yīng)變，εFinal是加熱后的回復(fù)應(yīng)變，εBegin是初始應(yīng)變，εFix是0 °C下的固定應(yīng)變。

為檢測形狀回復(fù)應(yīng)力，首先將尺寸為50 mm × 10 mm × 0.07 mm的纖維膜樣品（樣品數(shù)n≥ 3）置于47 °C的水浴中拉伸100%后迅速轉(zhuǎn)移至0 °C冰浴中進行塑形固定，然后將塑形后的纖維膜樣品夾持在自制的形狀回復(fù)應(yīng)力測試裝置上，在47 °C的水浴中檢測纖維膜的形狀回復(fù)應(yīng)力[14]。

為了解各復(fù)合纖維膜中引入GO后帶來的熱響應(yīng)敏感性，用808 nm激光器在1.3 W/cm2的光強下照射纖維膜樣品（50 mm × 20 mm × 0.07 mm，n≥ 3）55 s，通過紅外熱像儀測溫并繪制溫度-時間關(guān)系曲線，獲得升溫速率。

1.5 GO@PLLA/PHBV復(fù)合纖維膜的成骨誘導(dǎo)性能

按每孔1 × 104個的細胞密度將BMSCs分別種植在各復(fù)合纖維膜上；在特定時間點（1、3、6 d）吸去培養(yǎng)基后，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次；避光條件下加入300 μL含CCK-8試劑(Cell Counting Kit-8 細胞計數(shù)試劑)的培養(yǎng)基，在細胞培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司HF90型）中培養(yǎng)3 h；每孔取100 μL加入到96孔板中，用酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司MK3型）檢測450 nm處的吸光度（OD）。

通過細胞骨架和細胞核染色了解細胞的鋪展情況，步驟為：將細胞按每孔3 × 104個的細胞密度分別種植在各復(fù)合纖維膜上，培養(yǎng)3 d后吸去培養(yǎng)基，加入PBS清洗3次；每孔加入200 μL多聚甲醛固定液固定20～30 min，用PBS清洗3次；每孔加入400 μL聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）通透10 min后吸除，PBS清洗3 次；避光將羅丹明-鬼筆環(huán)肽（5 μg/mL）按每孔 400 μL 加入，30 min 后吸除，PBS 清洗 3 次；然后將 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1 μg/mL）按每孔 400 μL 加入，15 min后吸除，PBS 清洗 3 次；最后用熒光顯微鏡（日本Nikon公司Nikon 80i型）觀察并拍照。

成骨分化：將細胞按每孔3 × 104個的細胞密度分別種植在各復(fù)合纖維膜上，培養(yǎng)14 d后進行堿性磷酸酶（ALP）染色和定量檢測。ALP染色步驟為：吸去多余培養(yǎng)基后用PBS清洗3次；每孔加入200 μL多聚甲醛固定液固定20 ～ 30 min，之后用PBS清洗3次；參照ALP顯色試劑盒配制染色工作液，每孔加入200 μL工作液并在室溫下避光孵育20 min后用去離子水清洗3次；將染色后的纖維膜置于載玻片上在倒置熒光顯微鏡上觀察染色結(jié)果并拍照。ALP定量步驟為：吸去培養(yǎng)基，用Triton X-100裂解液將細胞裂解30 min，之后在1 000 r/min下將裂解液離心5 min；取30 μL上清液加入96孔板中，參照ALP測定試劑盒的說明，每孔加入50 μL反應(yīng)液后，在37 °C水浴中溫?zé)崽幚?5 min；最后加入150 μL顯色劑，用酶標(biāo)儀檢測520 nm處的OD值。

鈣沉積：將BMSCs按每孔3 × 104個的細胞密度分別種植在各復(fù)合纖維膜上，培養(yǎng)14 d后進行茜素紅（ARS）染色和定量檢測，從而對BMSCs的鈣沉積進行分析。ARS染色步驟為：吸去多余培養(yǎng)基后用PBS清洗3次，加入異丙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)為60%）將細胞固定2 min后，用PBS清洗3次；加入200 μL ARS染色液染色20 min直至孔板內(nèi)出現(xiàn)橘紅色，之后用去離子水清洗至無色后在倒置熒光顯微鏡上觀察鈣沉積情況。ARS定量步驟為：在每孔中加入500 μL氯化十六烷基吡啶溶液（體積分?jǐn)?shù)為10%）孵育30 min后將染料洗脫，取200 μL洗脫液轉(zhuǎn)移至96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測570 nm處的OD值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Origin 8.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，以評價樣品之間是否存在顯著性差異（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。

2 結(jié)果與討論

2.1 GO的片層尺寸表征

用拉曼光譜儀對GO的化學(xué)結(jié)構(gòu)（圖1（a））進行表征，拉曼光譜如圖1（b）所示。從圖1（b）可以看出，在1 349 cm?1和1 598 cm?1處分別出現(xiàn)石墨烯類二維納米片結(jié)構(gòu)典型的特征D峰和G峰[15]，且這些特征峰的譜帶強度也表現(xiàn)出對GO片層尺寸的依賴性，但sGO、mGO和lGO的拉曼圖譜中，D峰與G峰的強度比值（ID/IG）較接近，分別為0.64、0.70和0.69，表明不同片層尺寸GO的氧化程度相似[16]。

通過FESEM對超聲前后不同片層尺寸GO進行形貌觀察（圖1（c））。超聲分散處理可使不同尺寸GO獲得較好分散，但各GO的片層尺寸均有顯著減小，sGO、mGO、lGO的片層尺寸分別由超聲處理前的（3.3 ±3.8）μm2、（6.7 ± 3.9）μm2、（29.1 ± 25.0）μm2減小至（1.9 ± 2.1）μm2、（5.4 ± 3.6）μm2、（21.3 ± 16.5）μm2。值得注意的是，雖然超聲作用可使sGO、mGO及l(fā)GO的橫向尺寸減小，但各GO在超聲處理后依舊保持小、中、大3種尺寸的差異性。

圖1 GO 的（a）化學(xué)結(jié)構(gòu)，（b）Raman 光譜圖及（c）FESEM 形貌圖Fig.1 （a） Chemical structure,（b） Raman spectra and （c） FESEM images of GO

2.2 GO@PLLA/PHBV復(fù)合纖維膜的形貌與結(jié)構(gòu)

復(fù)合纖維膜的FESEM形貌觀察如圖2（a）所示，各組纖維取向隨機、表面光滑、無明顯串珠等缺陷，PLLA/PHBV、sGO@PLLA/PHBV、mGO@PLLA/PHBV及 lGO@PLLA/PHBV的直徑分別為（1.25 ± 0.31）μm、（0.92 ± 0.26）μm、（1.29 ± 0.31）μm 及（1.05 ± 0.21）μm。有少量的 sGO 和 mGO“鑲嵌”在纖維膜表面或內(nèi)部，而 lGO因片層尺寸較大將纖維“包裹”起來，這些結(jié)果與通過TEM觀察到的GO在纖維膜上的形式一致（圖2（b））。

圖2 復(fù)合纖維膜的（a）FESEM和（b）TEM形貌圖（白色箭頭所指為GO）Fig.2 （a） FESEM and （b） TEM images of fibrous composite membranes （The white arrows point to GO）

從復(fù)合纖維膜的拉曼光譜分析結(jié)果（圖3（a））可知，PLLA/PHBV在2 937 cm?1和3 000 cm?1處的特征峰比較明顯[16]，而負載GO后，從mGO@PLLA/PHBV和lGO@PLLA/PHBV的拉曼譜圖上可觀察到GO的sp3雜化相對應(yīng)的D峰（1 349 cm?1處）和sp2碳原子平面振動相對應(yīng)的G峰（1 584 cm?1處）[15]，但由于拉曼光譜強度對GO片層尺寸的依賴性，GO的D峰和G峰在sGO@PLLA/PHBV復(fù)合纖維膜的拉曼譜圖中不易觀察到（放大后可見）。熱重分析結(jié)果顯示，不同纖維膜中所負載GO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約1%（圖3（b））。

圖3 復(fù)合纖維膜的（a）拉曼光譜圖、（b）熱失重曲線、（c）XRD 圖譜和（d）DSC 圖譜Fig.3 （a） Raman spectra, （b） TG curves, （c） XRD patterns and （d） DSC curves of the fibrous composite membranes

從復(fù)合纖維膜的 XRD圖譜（圖3（c））可知，GO的摻入可使 PLLA/PHBV的結(jié)晶度顯著降低，sGO@PLLA/PHBV、mGO@PLLA/PHBV、lGO@PLLA/PHBV的結(jié)晶度從最初的57.24%分別降低至15.61%、16.59%及20.41%，尤以sGO對PLLA/PHBV結(jié)晶性的影響最為明顯。這可能是由于在聚合物凝聚態(tài)下，均勻分散的GO導(dǎo)致分子鏈運動速率降低[17]，阻礙結(jié)晶作用增強。雖然摻入GO使聚合物結(jié)晶的活化能降低會有利于聚合物的結(jié)晶，但鄰近的GO會阻礙聚合物微晶的生長，導(dǎo)致結(jié)晶度降低[9]。

從復(fù)合纖維膜的DSC圖譜（圖3（d））可知，在PLLA/PHBV中摻入不同尺寸的GO后，Tg略有降低，以引入sGO的復(fù)合纖維膜下降最大。這是因為相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，尺寸越小的GO越易于分散和導(dǎo)熱，在較低的溫度下就能實現(xiàn)相轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致PLLA/PHBV的Tg降低[9]。較低的Tg可以降低SMPs支架因回復(fù)溫度過高帶來的細胞損傷風(fēng)險[18]。

2.3 GO@PLLA/PHBV復(fù)合纖維膜的力學(xué)性能和形狀記憶性能

復(fù)合纖維膜的拉伸楊氏模量結(jié)果（圖4（a））顯示，相比于 PLLA/PHBV 的楊氏模量（24.0 ± 0.3）MPa，當(dāng)摻入 sGO、mGO 和 lGO 后，對應(yīng)纖維膜的楊氏模量分別提高至（53.8 ± 5.9）MPa、（41.9 ± 6.4）MPa和（30.6 ± 4.2）MPa。這是因為GO尺寸越小，范德華相互作用和π-π共軛越弱，更容易在基體中均勻分散，有利于纖維力學(xué)性能的提高[19]。

復(fù)合纖維膜的形狀固定率和形狀回復(fù)率結(jié)果（圖4（b））表明，PLLA/PHBV的Rf為96%左右，而當(dāng)摻雜sGO后Rf顯著提高至98%以上，這可能是因為摻雜sGO的復(fù)合纖維膜具有更高的儲能模量，即更多的可被“凍結(jié)”的軟鏈，因此具有更高的Rf[20]。從Rr結(jié)果看，PLLA/PHBV復(fù)合纖維膜與摻雜有mGO、lGO的復(fù)合纖維膜的Rr均為50% ～ 80%，而當(dāng)摻雜sGO后Rr可提高至100%左右，這與GO尺寸較小易于在基體中分散有關(guān)[19]，分散性良好的GO可提高聚合物的導(dǎo)熱性能和儲能模量，有助于提高形狀回復(fù)率[9,21]。

圖4 復(fù)合纖維膜的（a）拉伸楊氏模量、（b）形狀固定率和形狀回復(fù)率、（c）最大回復(fù)應(yīng)力和（d）升溫速率Fig.4 （a）Tensile Young＇s modulus,（b） shape fixation rate and shape recovery rate,（c） ultimate recovery stress and （d）the heating rates of fibrous composite membranes

從復(fù)合纖維膜形狀回復(fù)應(yīng)力的測試結(jié)果（圖4（c））可以看出，摻入GO后，可使復(fù)合纖維膜的最大回復(fù)應(yīng)力升高，且摻入GO的尺寸越小，對分子鏈的限制越強，儲能模量增加，聚合物的形狀回復(fù)應(yīng)力越高[22]。

從復(fù)合纖維膜的溫度敏感性結(jié)果（圖4（d））可以看出，在同樣的光照條件下，摻雜有sGO的復(fù)合纖維膜具有最快的升溫速率，意味著高的熱響應(yīng)敏感度，這是因為sGO分散性好，可使聚合物基體的受熱更均勻，受熱范圍更廣[23]，這一結(jié)果對外源光熱刺激響應(yīng)的形狀記憶材料的應(yīng)用具有重要意義[24]。

2.4 GO@PLLA/PHBV復(fù)合纖維膜的成骨誘導(dǎo)性能

細胞增殖結(jié)果如圖5（a）所示，在培養(yǎng)3 d和6 d后，mGO@PLLA/PHBV和lGO@PLLA/PHBV上的細胞數(shù)量明顯多于PLLA/PHBV和sGO@PLLA/PHBV的細胞數(shù)量（*p＜ 0.05），說明摻雜較大尺寸GO更有利于細胞增殖。這與mGO、lGO在纖維表面的分布狀態(tài)有關(guān)，更多的黏附位點有利于細胞增殖[16,25]。

通過細胞骨架染色（圖5（b））可揭示與細胞形態(tài)有關(guān)的細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)，相比于PLLA/PHBV和sGO@PLLA/PHBV，BMSCs在mGO@PLLA/PHBV和lGO@PLLA/PHBV上的鋪展面積更大，尤以在lGO摻雜的復(fù)合纖維膜上的鋪展面積最大。這可能是因為曝露在纖維表面的lGO可為細胞提供更多的黏附位點，有利于細胞的鋪展[16]。

ALP檢測結(jié)果（圖5（c））表明，與 PLLA/PHBV相比，BMSCs在 sGO@PLLA/PHBV、mGO@PLLA/PHBV及l(fā)GO@PLLA/PHBV上的ALP分泌量分別提高了36%、57%和92%（圖5（d）），其中以摻雜有l(wèi)GO的復(fù)合纖維膜的促進作用最為明顯。

圖5 BMSCs在復(fù)合纖維膜上（a）培養(yǎng) 1、3、6 d的增殖情況；（b）培養(yǎng) 3 d的骨架染色圖；培養(yǎng) 14 d后（c）ALP 和 ARS的染色圖及（d）定量測定結(jié)果Fig.5 （a） Proliferation assayed at 1, 3, 6 d;（b） Images of cytoskeleton staining at 3 d;（c） ALP and ARS staining and （d） quantitative measurements for 14 d of BMSCs cultured on the fibrous composite membranes

ARS檢測結(jié)果顯示（圖5（c）），與 PLLA/PHBV 相比，BMSCs在 sGO@PLLA/PHBV、mGO@PLLA/PHBV及l(fā)GO@PLLA/PHBV上的鈣沉積分別增加了70%、75%和133%（圖5（d）），同樣，摻雜有l(wèi)GO的復(fù)合纖維膜的促鈣沉積作用最顯著，這一結(jié)果與ALP染色結(jié)果相一致。

以上結(jié)果說明，PLLA/PHBV復(fù)合纖維中引入lGO后可形成的黏附位點更多，從而顯著促進PLLA/PHBV對BMSCs的成骨分化誘導(dǎo)作用[25,26]。

3 結(jié) 論

（1）采用電紡方法制備了摻雜不同片層尺寸GO的PLLA/PHBV復(fù)合纖維膜，各組纖維均形貌良好，尺寸較小的sGO、mGO可“鑲嵌”在纖維表面或內(nèi)部，而lGO則是將纖維“包裹”起來。

（2）摻入sGO有利于提高PLLA/PHBV復(fù)合纖維膜的力學(xué)性能和形狀記憶性能。

（3）摻入lGO更有利于提高PLLA/PHBV復(fù)合纖維膜的細胞相容性及對BMSCs的成骨分化誘導(dǎo)作用。