薛鶴　曾陽　李錦萍　左文明　劉力寬

摘要：【目的】?jī)?yōu)化金露梅中黃酮的超聲提取工藝條件，檢測(cè)黃酮化合物的種類及含量，并分析其抗氧化和降血糖活性，為金露梅的綜合利用提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳钥傸S酮提取率為指標(biāo)，采用單因素和響應(yīng)面分析法對(duì)超聲提取金露梅黃酮的主要工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化分析，利用多重層析柱對(duì)黃酮化合物進(jìn)行分離純化，并比較各組分的抗氧化和降血糖活性?！窘Y(jié)果】4個(gè)因素對(duì)金露梅總黃酮提取率影響的顯著性順序?yàn)橐毫媳?超聲時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲功率，建立的回歸方程為Y=37.84+14.48A+14.93B+3.02C+9.38D-0.03AB-0.66AC-0.01AD-0.01BD-0.01CD-14.71A²-11.25B²-16.96C²-12.89D²（Y表示總黃酮提取率，A、B、C、D分別表示液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和超聲時(shí)間）;超聲提取金露梅黃酮的最佳工藝條件為：液料比39.78∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)65.47%、超聲功率390.98 W、超聲時(shí)間49.55 min，在此條件下金露梅總黃酮提取率為47.59 mg/g。金露梅黃酮化合物中發(fā)現(xiàn)含有8種化合物，其中含量最高的為槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸（10.90 mg/g）。柚皮素對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率最低，僅為5.0%，其余7種化合物對(duì)DPPH自由基的清除率均達(dá)50.0%以上，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。金露梅黃酮化合物對(duì)葡萄糖消耗率均高于二甲基亞砜（DMSO），其中（+）-兒茶素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸和3-阿拉伯葡萄糖基槲皮素對(duì)葡萄糖的消耗率達(dá)19.5%以上，表現(xiàn)出良好的降血糖活性?！窘Y(jié)論】經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化的金露梅黃酮超聲提取工藝切實(shí)可行，建立的回歸方程具有較高的準(zhǔn)確性;多重層析柱法可實(shí)現(xiàn)金露梅中黃酮化合物的分離純化，各組分除柚皮素外，均具有明顯的抗氧化活性，且各組分化合物均有一定的降血糖活性。金露梅可作為一種天然抗氧化劑和降血糖劑來源在食品、醫(yī)藥等方面進(jìn)行開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞： 金露梅;黃酮;響應(yīng)面分析;超聲提取;抗氧性活性;降血糖活性

中圖分類號(hào)： S567.239;TS201.2? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）02-0505-11

Optimization for extraction process of flavonoids from Potentilla fruticosa L. by response surface method and the analysis of its antioxidant and hypoglycemic activities

XUE He ZENG Yang LI Jin-ping ZUO Wen-ming LIU Li-kuan

（1College of Life Science， Qinghai Normal University， Xining? 810008， China; 2Academy of Plateau Science and Sustainable Development， Xining? 810008， China）

Abstract：【Objective】The ultrasonic extraction conditions of flavonoids from Potentilla fruticosa L. were optimized，the types and contents of flavonoids were detected，and their antioxidant and hypoglycemic capacities were analyzed，in order to provide technical support for comprehensive utilization of P. fruticosa L. 【Method】The single factor method and the response surface methodology（RSM） were employed to optimize the main parameters of ultrasonic extraction of flavonoids from P. fruticosa L.， with extraction yield as the index. Multiple chromatographic columns were used for the separation and purification of the flavonoid compounds，and the antioxidant capacity and hypoglycemic capacity of these compounds were compared. 【Result】The significant order of the four factors on the extraction yield of flavonoids was as follows：solvent/solid ratio>ultrasonic time>volume fraction of ethanol>ultrasonic power. The regression equation established was as follows：Y=37.84+14.48A+14.93B+3.02C+9.38D-0.03AB-0.66AC-0.01AD-0.01BD-0.01CD-14.71A²-11.25B²-16.96C²-12.89D²（Y represented extraction rate of flavonoids;A，B，C and D represented liquid-solid ratio，ethanol vo-lume fraction，ultrasonic power and ultrasonic time，respectively）. The optimal extraction conditions were as follows：liquid-solid ratio of 39.78∶1（mL/g），ethanol volume fraction of 65.47%，ultrasonic power of 390.98 W and ultrasonic time of 49.55 min. Under these conditions，the extraction yield of flavonoids was 47.59 mg/g. Eight flavonoids were found in the extract of P. fruticosa L.，among which the most abundant was quercetin-7-O-β-D-glucuronide （10.90 mg/g）. Naringenin had the lowest scavenging yield of DPPH free radical， which was only 5.0%，while the scavenging yields of seven other compounds were greater than 50.0%，indicating good antioxidant activities. The glucose consumption yield of flavonoid compounds in P. fruticosa L. were higher than that of DMSO， and the glucose consumption yields of （+）-catechin，quercetin-3-O-β-D-glucuronide and quercetin-3-vicianoside reached more than 19.5%， suggesting their good hypoglycemic activities. 【Conclusion】The optimized ultrasonic extraction process of flavonoids by RSM is feasible and the established regression equation has high accuracy. The multiple chromatographic columns can be used for the separation and purification of the flavonoids in P. fruticosa L. All components except naringenin have obvious antioxidant activity，and all components have a certain hypoglycemic activity. P. fruticosa L. can be developed as a natural source of antioxidants and hypoglycemic agents in food，medicine and other fields.

Key words： Potentilla fruticosa L.; flavonoids; response surface methodology; ultrasonic extraction; antioxidant capacity; hypoglycemic capacity

Foundation items： Qinghai Scientific and Technological Achievement Transformation Project （2018-SF-144）;Qinghai Key Laboratory of Medicinal Plant and Animal Resources（2020-ZJ-Y40）; Qinghai Science and Technology Innovation Team Project（2020-2023）

0 引言

【研究意義】金露梅（Potentilla fruticosa L.）又名金老梅、藥王茶和金臘梅，屬薔薇科萎陵菜屬，是我國(guó)高寒地區(qū)的一種典型性落葉灌叢。其葉和花均可入藥，具有清暑熱、益腦清心、調(diào)經(jīng)、健胃等功效（何佳亮等，2014;李曉雯和王春麗，2020）。金露梅的生物活性源于其含有多種黃酮類、萜類和鞣質(zhì)類化合物，其中黃酮類化合物是金露梅中最典型的物質(zhì)（羅梓文，2015）。黃酮苷原主要包括芹菜素、槲皮素、山奈酚、木犀草素、鼠李素、異鼠李素和楊梅素等，具有降血壓、降血脂、降血糖和抗氧化等作用（王彥兵等，2020;孫美玲等，2021）。目前對(duì)金露梅的開發(fā)利用尚不充分，對(duì)其研究大多停留在種質(zhì)資源分布方面，因此，加強(qiáng)金露梅有效物質(zhì)的提取、純化和功效研究，有助于提高西部地區(qū)對(duì)其綜合開發(fā)利用的程度，具有顯著的潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】一些學(xué)者對(duì)金露梅的生物活性進(jìn)行了研究。孫玉俠等（2016）研究發(fā)現(xiàn)金露梅總黃酮抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用強(qiáng)于阿卡波糖，高、低劑量總黃酮均能提高小鼠的糖耐量，揭示了金露梅總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶和醛糖還原酶具有抑制活性;皮立等（2019）對(duì)青海省不同生態(tài)區(qū)野生金露梅葉生物活性成分進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)金露梅葉的成分含量均存在顯著差異，篩選出總黃酮、兒茶素、維生素C和蛋白質(zhì)4個(gè)指標(biāo)代表金露梅葉的品質(zhì)，認(rèn)為金露梅葉的生物活性成分含量較高，值得進(jìn)一步深入研究和開發(fā);李成慧（2020）采用層析柱、高效液相色譜和BUCHI快速純化系統(tǒng)等方法富集制備金露梅中3種具有降糖活性的化合物，并測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性;李彩明等（2021）研究發(fā)現(xiàn)金露梅花茶、綠茶和紅茶均具有調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血脂及其腸道菌群譜的作用，推測(cè)金露梅茶可能經(jīng)腸道菌群干預(yù)脂質(zhì)代謝途徑發(fā)揮降血脂的功效。在有效物質(zhì)提取方面，超聲提取法是一種更安全、廉價(jià)、環(huán)保和簡(jiǎn)便的技術(shù)，得到了廣泛應(yīng)用（Aryanti et al.，2017）。符群等（2018）利用減壓—超聲輔助醇法從薇菜中提取黃酮，獲得最佳提取工藝條件，并對(duì)提取的黃酮抗氧化活性進(jìn)行研究;張楊洋等（2020）利用超聲輔助酶法提取銀杏葉中的總黃酮，通過單因素和正交試驗(yàn)研究料液比、酶添加量、超聲溫度、超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)銀杏葉黃酮提取率的影響。在黃酮物質(zhì)的分離純化方面，毛迪銳等（2016）利用XAD-1600大孔樹脂對(duì)文冠果殼總黃酮進(jìn)行分離純化，獲得最佳分離工藝參數(shù)，純化后總黃酮的純度達(dá)70%以上，回收率達(dá)89.63%;張美榮等（2020）采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜及制備型高效液相色譜對(duì)藏藥鐮莢棘豆中的黃酮類成分進(jìn)行分離純化，從其乙酸乙酯萃取部位中分離出16種黃酮化合物?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管超聲提取法已廣泛應(yīng)用，但針對(duì)不同提取對(duì)象時(shí)的工藝參數(shù)不盡相同，且在分離提純方面提取對(duì)象和所含有效物質(zhì)不同，分離純化的具體方式也差異明顯;目前針對(duì)金露梅有效物質(zhì)超聲提取方面的研究較少，也鮮有關(guān)于金露梅中黃酮類物質(zhì)分離純化及生物活性方面的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)金露梅中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行超聲提取，研究液料比、超聲功率、超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮類物質(zhì)提取率的影響，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝;并采用多重系列柱層析法對(duì)金露梅黃酮化合物進(jìn)行分離純化，測(cè)定分析其種類和含量，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）分析法評(píng)定分離出的黃酮類化合物的抗氧化活性，同時(shí)對(duì)黃酮提取物的降血糖活性進(jìn)行測(cè)試，為金露梅黃酮提取和高價(jià)值利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

金露梅采自青海省大通達(dá)坂山（東經(jīng)101°50′32″，北緯37°8′42″，海拔3006 m），將其莖葉放入40 ℃干燥箱烘干至水分含量≤3%，再用高速粉碎機(jī)粉碎，過80目篩后備用。DPPH、二甲基亞砜（DMSO）、甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、H₃PO₄、NaNO₂、NaOH和Al（NO₃）₃均為分析純;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司;3T3-L1細(xì)胞、胰島素和葡萄糖購自武漢益普生物科技有限公司;Intersil ODS-3 C₁₈色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）購自日本島津公司;Sephadex LH-20層析柱（25～100 μm）、MCI-gel CHP-20P層析柱（75～150 μm）和Diaion HP20SS層析柱購自日本三菱化學(xué)公司;硅膠H層析柱（200～300目）購自青島海浪化工有限公司;葡萄糖（GO）檢測(cè)試劑盒購自上海滬崢生物科技有限公司。

主要儀器設(shè)備：NAI-CS超聲波細(xì)胞破碎儀（上海那艾精密儀器有限公司）;EVO18掃描電鏡（德國(guó)蔡司）;TG16MW臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）;SHB-IIIG循環(huán)水式多用真空泵、干燥箱（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;UH4150型紫外分光光度計(jì)（日立公司）;ME4002分析天平[梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司];Agilent1200型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）;恒溫水浴箱（上海比郎儀器制造有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 金露梅黃酮超聲提取 精確稱量干燥的金露梅粉末40 g，按照一定液料比添加到特定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中，設(shè)置超聲功率和超聲時(shí)間，對(duì)金露梅粉末進(jìn)行乙醇超聲提取，將提取后的溶劑放入高速離心機(jī)中，8000 r/min離心30 min，取上清液，并用與超聲提取時(shí)相同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液沖洗下部沉積物，然后在真空抽濾機(jī)上用0.5 μm微孔膜負(fù)壓抽濾，濾液與離心上清液合并，用真空旋蒸儀蒸干乙醇和水分，獲得金露梅提取物浸膏，浸膏低溫干燥后稱重，計(jì)算金露梅提取物質(zhì)量。

金露梅超聲提取單因素試驗(yàn)中液料比（mL/g，下同）、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和超聲時(shí)間4個(gè)提取工藝參量如表1所示。

1. 2. 2 提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，對(duì)液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和超聲時(shí)間4個(gè)影響因素設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)，因素水平和編碼見表2。采用Box-Benhnken Design（BBD）設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)金露梅黃酮提取工藝參量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

1. 2. 3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用NaNO₂-Al（NO₃）₃-NaOH比色法測(cè)定。稱取13.2 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇溶液定容至25 mL，制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL容量瓶中，分別加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4和0 mL 60%乙醇溶液，再加入0.5 mL 5% NaNO₂溶液，搖勻靜置6 min，之后加入0.5 mL 10% Al（NO₃）₃溶液，靜置6 min，最后加入4 mL 4% NaOH溶液，用60%乙醇定容，搖勻后靜置15 min。在510 nm處測(cè)定吸光值，以蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）作X軸，該濃度下的吸光值作Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=35.324X-0.0238，R²=0.9999。

1. 2. 4 金露梅提取物中總黃酮含量測(cè)定 以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為對(duì)照，測(cè)定金露梅提取物中總黃酮含量。稱取一定質(zhì)量的金露梅提取物，用60%乙醇定容至25 mL，按照1.2.3的方法處理后，在510 nm處測(cè)定吸光值。通過蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出測(cè)定樣品中的總黃酮含量，再根據(jù)稀釋倍數(shù)和提取物得率計(jì)算金露梅物料的總黃酮提取率。

C=A×N×m/M×m1 （1）

式中，C為金露梅中總黃酮提取率（mg/g），A為測(cè)定樣品中的總黃酮含量（mg），N為稀釋倍數(shù)，m為金露梅提取物總質(zhì)量（mg），M為金露梅物料總質(zhì)量（g），m1為測(cè)定樣品中金露梅提取物質(zhì)量（mg）。

1. 2. 5 金露梅中黃酮化合物組分測(cè)定 將提取的金露梅浸膏稱量后懸浮于水中，用石油醚、乙酸乙酯依次萃取，獲得石油醚層、乙酸乙酯層和水層;先將水層經(jīng)Diaion HP20SS柱層析（甲醇—水梯度洗脫，體積比0∶1～1∶0，10%體積分?jǐn)?shù)遞增）脫糖去除色素，再將水層和乙酸乙酯層分別經(jīng)Sephadex LH-20柱層析（甲醇—水梯度洗脫，體積比0∶1～1∶0，10%體積分?jǐn)?shù)遞增）、MCI-gel CHP-20P柱層析（甲醇—水梯度洗脫，體積比0∶1～1∶0，10%體積分?jǐn)?shù)遞增）、硅膠H柱層析（氯仿—甲醇—水洗脫，體積比7∶3∶0.5），通過反復(fù)的層析純化分離化合物單體。

采用Agilent1200型高效液相色譜儀對(duì)分離的化合物與常見的黃酮化合物標(biāo)品進(jìn)行色譜比對(duì)分析，篩選獲得金露梅中的黃酮化合物。色譜條件：色譜柱Intersil ODS-3 C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.2% H₃PO₄水溶液（體積比55∶45），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，進(jìn)樣20 μL。

1. 2. 6 金露梅黃酮化合物的抗氧化活性和降血糖活性試驗(yàn)

1. 2. 6. 1 DPPH分析法抗氧化活性試驗(yàn) 參考Kosani?等（2011）的方法進(jìn)行。精確稱量3.0 mg金露梅黃酮化合物，用60%乙醇溶液溶解并定容至25 mL，制得樣品溶液;分別量取各樣品溶液1.5 mL置于試管內(nèi)，再分別加入4.5 mL 0.1045 mol/mL DPPH溶液，室溫避光反應(yīng)30 min，以無水乙醇作空白試驗(yàn)，在517 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光值。金露梅黃酮化合物的抗氧化活性按照公式（2）計(jì)算：

C=A0-（AS-AC）/A0?×100 （2）

式中，C為DPPH自由基清除率（%），A₀為1.5 mL去離子水+4.5 mL DPPH溶液吸光值，A_s為1.5 mL樣品溶液+4.5 mL DPPH溶液吸光值，A_c為1.5 mL樣品溶液+4.5 mL無水乙醇吸光值。

1. 2. 6. 2 降血糖活性試驗(yàn) 將水浴解凍后的3T3-L1細(xì)胞經(jīng)離心處理后，吹打均勻加入到盛有新鮮、完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液隔天更換一次;待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行傳代。傳代細(xì)胞長(zhǎng)滿后，將3T3-L1前脂肪細(xì)胞以10⁵個(gè)/mL密度接種至24孔板，在37 ℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞完全融合后進(jìn)行誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)分化的具體方法：加入誘導(dǎo)劑I（含10 μg/mL胰島素、1 μmol/L Dex、0.5 mmol/L IBMX的完全培養(yǎng)基）培養(yǎng)48 h，再換成誘導(dǎo)劑Ⅱ（只含10 μg/mL胰島素的完全培養(yǎng)基）培養(yǎng)48 h，然后每隔1～2 d更換一次完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分化至第8 d時(shí)，用1800 mg/L葡萄糖清洗細(xì)胞后，加入到200 μL低糖培養(yǎng)基中孵育，待測(cè)樣品組用25 μmol/L濃度黃酮提取物孵育，對(duì)照組分別用DMSO和100 nmol/L胰島素孵育，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。孵育24 h后吸取10 μL細(xì)胞培養(yǎng)基，用葡萄糖氧化酶—過氧化物酶法（陳啟華等，2019）測(cè)定培養(yǎng)液中葡萄糖濃度。計(jì)算公式如下：

C=A_樣×C_校/A_標(biāo)（3）

式中，C為葡萄糖濃度（mmol/L），A_樣為待測(cè)樣品吸光值，C_校為校準(zhǔn)品濃度（mmol/L），A_標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品吸光值。

葡萄糖消耗率根據(jù)公式（4）計(jì)算：

P=C_初-C_測(cè)C/_初×100 （4）

式中，P為葡萄糖消耗率（%），C_初為初始葡萄糖濃度，C_測(cè)為試驗(yàn)孔葡萄糖濃度。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行單因素方差分析，Design Expert 10進(jìn)行響應(yīng)面分析，以O(shè)rigin 8.5制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 1. 1 液料比對(duì)金露梅總黃酮提取率的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率350 W、超聲時(shí)間40 min的條件下，液料比對(duì)金露梅總黃酮提取率的影響如圖1所示，在10∶1～40∶1范圍內(nèi)，隨著液料比增加，總黃酮提取率顯著提高（P<0.05，下同），當(dāng)液料比為40∶1時(shí)，總黃酮提取率達(dá)45.64 mg/g，繼續(xù)增大液料比，總黃酮提取率無顯著變化（P>0.05，下同）。

2. 1. 2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)金露梅總黃酮提取率的影響 在液料比20∶1、超聲功率350 W、超聲時(shí)間40 min的條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)金露梅總黃酮提取率的影響如圖2所示，在30%～60%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取率顯著提高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)最大值（31.62 mg/g），繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，總黃酮提取率則降低，但變化不顯著。

2. 1. 3 超聲功率對(duì)金露梅總黃酮提取率的影響

在液料比30∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間40 min的條件下，超聲功率對(duì)金露梅總黃酮提取率的影響如圖3所示，隨著超聲功率的增加，總黃酮提取率呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為350 W時(shí)，總黃酮提取率達(dá)最大值（42.52 mg/g）。單因素顯著性方差分析結(jié)果顯示，250和550 W超聲功率對(duì)金露梅總黃酮提取率影響的差異未達(dá)顯著水平，其余超聲功率對(duì)金露梅總黃酮提取率的影響差異均達(dá)顯著水平。

圖4為金露梅粉末顆粒在經(jīng)350 W超聲波輻射振蕩40 min前后的形貌，從圖中可看出，原始的金露梅粉末顆粒形狀規(guī)則，表面光滑平整，而經(jīng)超聲處理后，粉末顆粒形狀不規(guī)則變形，表面變得粗糙不平，可觀察到顆粒表面出現(xiàn)破損。

2. 1. 4 超聲時(shí)間對(duì)金露梅總黃酮提取率的影響

在液料比30∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率350 W的條件下，超聲時(shí)間對(duì)金露梅總黃酮提取率的影響如圖5所示，在20～40 min范圍內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率顯著提高，當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí)，總黃酮提取率為42.52 mg/g，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，總黃酮提取率增加不顯著。

2. 2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝分析結(jié)果

采用Design Expert 10對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表3）進(jìn)行多元回歸分析，得到金露梅總黃酮提取率為響應(yīng)值的最優(yōu)方程：Y=29.71+7.23A+1.68B+1.47C+4.36D。對(duì)影響金露梅總黃酮提取率的4個(gè)因素進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果顯示，液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和超聲時(shí)間4個(gè)因素的顯著性P值均小于0.01，表明4個(gè)因素對(duì)金露梅總黃酮提取率的影響均達(dá)極顯著水平（P<0.01，下同），其顯著性排序?yàn)锳（液料比）>D（超聲時(shí)間）>B（乙醇體積分?jǐn)?shù)）>C（超聲功率）。

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，按照4因素3水平設(shè)計(jì)Box-Benhnken Design（BBD）試驗(yàn)（表4），并采用Design Expert 10對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，得出預(yù)測(cè)的總黃酮提取率Y可用二次多項(xiàng)式表示：

Y=37.84+14.48A+14.93B+3.02C+9.38D-0.03AB-0.66AC-0.01AD-0.01BD-0.01CD-14.71A²-11.25B²-16.96C²-12.89D²

圖6為液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和超聲時(shí)間兩兩因素間交互作用對(duì)金露梅總黃酮提取率影響的響應(yīng)面，曲線走勢(shì)越陡峭，說明該因素影響越顯著，等高線越呈橢圓形，表明兩因素的交互作用越顯著。從圖6可看出，液料比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的響應(yīng)曲線最陡峭，表明兩者對(duì)金露梅總黃酮提取率的影響最顯著，其次是液料比與超聲時(shí)間，以及乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間，而超聲功率與乙醇體積分?jǐn)?shù)的等高線橢圓形最明顯，表明兩者間的交互作用最顯著?？傸S酮提取率隨液料比先增大，在達(dá)到最高點(diǎn)后基本保持穩(wěn)定，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲功率增加先增大后減小，超聲功率較低時(shí)，總黃酮提取率隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)而增加，但超聲功率增大到一定程度后，總黃酮提取率隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)而先增大后減小，模擬的結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致。擬合回歸方程中得到最優(yōu)的提取條件為：液料比39.78∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)65.47%、超聲功率390.98 W、超聲時(shí)間49.55 min，預(yù)測(cè)的金露梅總黃酮提取率為47.59 mg/g。為了檢查計(jì)算的最優(yōu)參數(shù)，以液料比39.8∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)65.5%、超聲功率390 W、超聲時(shí)間49.6 min為參數(shù)進(jìn)行單次的驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)得到的總黃酮提取率為46.95±0.06 mg/g，與預(yù)測(cè)值之間僅存在微小的差別，表明模型對(duì)于從金露梅中提取總黃酮的預(yù)測(cè)精確。

2. 3 金露梅黃酮化合物組分分析結(jié)果

將上述最佳提取工藝獲得的金露梅總黃酮提取物通過多重柱層析分離后，參考文獻(xiàn)報(bào)道（Shaker et al.，2015;鄭聰聰?shù)龋?015;Ma et al.，2016;Zhong et al.，2016;孫玉俠，2017），利用高效液相色譜儀進(jìn)行黃酮化合物組分的測(cè)定。從圖7可看出，提取的金露梅黃酮中含有8種化合物組分，分別為（+）-兒茶素-7-O-葡萄糖苷、（+）-兒茶素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸、3-阿拉伯葡萄糖基槲皮素、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、槲皮素、柚皮素和圣草酚-7-O-β-D-葡萄糖苷，其中含量最高的為槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸，達(dá)10.90 mg/g，其次為（+）-兒茶素-7-O-葡萄糖苷，達(dá)9.39 mg/g，而柚皮素含量最低，僅為0.51 mg/g。

2. 4 金露梅黃酮化合物抗氧化活性和降血糖活性分析結(jié)果

DPPH分析法是一種廣泛采用的篩選自由基清除劑方法（羌宇等，2019），采用DPPH法對(duì)金露梅中的黃酮化合物進(jìn)行抗氧化活性測(cè)試，并以DMSO和胰島素為對(duì)照品，對(duì)黃酮化合物進(jìn)行降血糖活性測(cè)試，結(jié)果如圖8所示。金露梅的黃酮化合物中，柚皮素對(duì)DPPH自由基的清除率最低，僅為5.0%，其余7種化合物對(duì)DPPH自由基的清除率均達(dá)50.0%以上，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，其中槲皮素對(duì)DPPH自由基的清除率最高，為58.4%。金露梅中黃酮化合物對(duì)葡萄糖消耗率均高于DMSO，其中（+）-兒茶素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸和3-阿拉伯葡萄糖基槲皮素對(duì)葡萄糖的消耗率達(dá)19.5%以上，接近胰島素的2/3，表現(xiàn)出良好的降血糖活性，具有促進(jìn)脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖的能力。

3 討論

在單因素試驗(yàn)的方差顯著性差異分析中，液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和超聲時(shí)間的P值分別為3.62E-10、4.91E-07、1.3E-07和1.02E-07，均遠(yuǎn)小于0.01，且其檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量F值分別為273.604、62.45、82.347和86.549，均大于檢驗(yàn)臨界值Fcrit=3.47805，說明在檢驗(yàn)水平為0.05的情況下，液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和超聲時(shí)間4個(gè)工藝參量對(duì)金露梅總黃酮提取率影響的差異均達(dá)極顯著水平。金露梅總黃酮提取率隨液料比的增大呈先增加后趨于平緩的趨勢(shì)，表明對(duì)于一定質(zhì)量的金露梅粉末物料，適當(dāng)增加萃取溶液用量，有利于物料中黃酮物質(zhì)的更好溶出，但萃取溶劑達(dá)一定量后，已足以應(yīng)對(duì)物料中有限的黃酮溶出，再繼續(xù)增加萃取溶劑用量，黃酮溶出的增量有限，反而會(huì)增加經(jīng)濟(jì)成本。金露梅粉末中的黃酮物質(zhì)是根據(jù)相似相溶原理溶于乙醇溶液中，乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，有利于金露梅中滲出的黃酮物質(zhì)溶入乙醇溶液中，但單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)并非越大越好，超過一定量后，反而不利于黃酮物質(zhì)提取，可能是由于更高體積分?jǐn)?shù)的溶液影響乙醇溶劑擴(kuò)散通過金露梅的細(xì)胞壁，從而影響細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有效物質(zhì)的溶出。超聲波輻射可產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)和擾動(dòng)效應(yīng)，可加速破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞組織變形破損（薛宏坤等，2020），使得目標(biāo)化合物能更快地被釋放到提取溶液中，隨著超聲功率增大，超聲波的這種功效越顯著，但超聲功率增大到一定程度后，反而會(huì)破壞萃取的黃酮化合物結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致總黃酮提取率降低。在超聲時(shí)間達(dá)到一定程度后，如350 W下40 min的超聲處理，已經(jīng)使得金露梅粉末中的黃酮物質(zhì)盡可能溶出，再繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，對(duì)提取量的作用不大，反而增加提取能耗。

通過設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，并利用響應(yīng)面法分析可節(jié)省確定最優(yōu)處理參數(shù)的時(shí)間，且這種方法在萃取領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用（韋璐等，2015;磨正遵等，2018），一般而言，通過該體系的預(yù)測(cè)值與測(cè)試值間未發(fā)現(xiàn)有顯著差異。本研究利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，建立了回歸方程，并利用該模型優(yōu)化得到最佳提取條件，即液料比39.78∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)65.47%、超聲功率390.98 W、超聲時(shí)間49.55 min，預(yù)測(cè)的金露梅總黃酮提取率與單次驗(yàn)證試驗(yàn)得到的提取率僅存在微小差異，表明成功獲得了能準(zhǔn)確描述金露梅總黃酮提取率的回歸模型，再次驗(yàn)證了響應(yīng)面分析法在植物提取領(lǐng)域的有效運(yùn)用。

黃酮類化合物是一種強(qiáng)抗氧化劑，可有效清除人體內(nèi)的過剩自由基，延緩組織器官衰老（Hoensch and Oertel，2011）。黃酮類化合物具有的較強(qiáng)清除自由基能力與其化合物結(jié)構(gòu)中酚羥基數(shù)目和所處位置密切相關(guān)（Mojica et al.，2015;劉科梅等，2016）。酚羥基可將自由基轉(zhuǎn)變成活性低的酚類自由基，打斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在弱酸性或中性條件時(shí)，鄰位酚羥基還能與金屬離子鰲合，抑制其對(duì)自由基生成和鏈反應(yīng)的催化作用，同時(shí)酚羥基能顯著抑制氧化酶活性，因此酚羥基是黃酮類化合物清除自由基功效中共性的活性基團(tuán)（Ozkan et al.，2007;Li et al.，2013）。羥基數(shù)目越多，黃酮化合物抗氧化活性越強(qiáng)，而分子結(jié)構(gòu)中B環(huán)是最主要的活性部位，尤其是B環(huán)上存在鄰位酚羥基時(shí)，則抗氧化活性會(huì)顯著增強(qiáng)（吳洪和高平章，2009;王謝祎，2016）。金露梅的黃酮類化合物中，柚皮素DPPH自由基清除率僅為5.0%，可能是由于柚皮素B環(huán)上只有4′-OH，不存在鄰位酚羥基，而其他化合物的B環(huán)上均存在鄰位酚羥基，因此表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性。

4 結(jié)論

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化的金露梅黃酮超聲提取工藝切實(shí)可行，建立的回歸方程具有較高的準(zhǔn)確性;多重層析柱法可實(shí)現(xiàn)金露梅中黃酮化合物的分離純化，各組分除柚皮素外，均具有明顯的抗氧化活性，且各組分化合物均有一定的降血糖活性。金露梅可作為一種天然抗氧化劑和降血糖劑來源在食品、醫(yī)藥等方面進(jìn)行開發(fā)利用。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）